miRNA-17-3p和miRNA-19b-1組合物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一系列RNA小分子--miR-17_3p和 miR-19b-l的組合物及其在制備預(yù)防或治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用，miR-17-3p和miR-19b-l 在腫瘤血管調(diào)控以及體內(nèi)抗腫瘤活性起著重要作用。
【背景技術(shù)】
[0002] 微小RNA(microRNA，簡(jiǎn)稱miRNA)是一類非編碼的、具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)控功能的、序列長(zhǎng) 度約18~24nt的單鏈小分子RNA。最早于1993年Lee等報(bào)道了在秀剛線蟲(C. elegants)體內(nèi) 發(fā)現(xiàn)的一種可調(diào)節(jié)線蟲發(fā)育的RNA分子，即lin_4(Lee，R.C.等，The C.elegans heterochronic gene lin-4encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14.Cell. 1993,75:843-854)。到2000 年，相繼由 Reinhart 等（Reinhart，B.J.等，The 21-nucleotide let_7RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans.Nature·2000,403:901-906)發(fā)現(xiàn)不同時(shí)期表達(dá)的let-7。至目前，miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)中 已收錄了數(shù)百種人類miRNA序列，其中三分之二已被實(shí)驗(yàn)證實(shí)。miRNA來源于長(zhǎng)度約為 1000bp的長(zhǎng)鏈RNA初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(Pri-miRNA)，Pri-miRNA分子在細(xì)胞核中經(jīng)Drosha酶剪切 形成長(zhǎng)度約60~80nt的具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的miRNA前體(Pre-miRNA) Ire-miRNA轉(zhuǎn)運(yùn)至胞質(zhì)后， 被進(jìn)一步加工為成熟的miRNA^iRNA在動(dòng)植物細(xì)胞中通過種子序列的配對(duì)程度不同實(shí)現(xiàn)對(duì) 目標(biāo)mRNA的降解或轉(zhuǎn)錄抑制。miRNA在物種間具有高度的保守性、時(shí)續(xù)性和組織特異性?；?于miRNA的調(diào)控機(jī)制，通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miRNA可能直接調(diào)控上百個(gè)基因的表達(dá)，此 外研究表明目前所發(fā)現(xiàn)的miRNA直接參與30%的基因調(diào)控，進(jìn)而廣泛的參與多種重要的細(xì) 胞生理病理過程如細(xì)胞凋亡、增殖、分化、胚胎發(fā)育、機(jī)體能量代謝、激素分泌和造血功能以 及心肌肥厚等，在腫瘤疾病中，miRNA也作為關(guān)鍵調(diào)控因子，參與了腫瘤細(xì)胞以及其他相關(guān) 間質(zhì)細(xì)胞的生化過程。已有的證據(jù)顯示部分miRNA的表達(dá)紊亂或成為推動(dòng)腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵， 或成為腫瘤惡性程度以及預(yù)后的分子標(biāo)志物。
[0003] 自1971年由美國(guó)Folkman醫(yī)生首次提出了腫瘤血管生成的概念，至今，基于腫瘤血 管生成的治療策略的研究已經(jīng)成為癌癥研究的最熱點(diǎn)之一(M. Abdelrahim, S.Konduri， R.Basha,P.A.Philip,C.H.Baker , Angiogenesis:an update and potential drug approaches(review) · Int .J.Oncol · 2010.36:5-18)，而抗腫瘤血管生成的腫瘤治療策略也 顯示出不同于傳統(tǒng)抗癌療法的優(yōu)越性，如耐藥性發(fā)生率極低，藥物毒副作用低等。鑒于血管 新生對(duì)于實(shí)體腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移起到了十分關(guān)鍵的作用。miRNA在腫瘤血管調(diào)控的功 能研究有助于我們更好的理解腫瘤發(fā)生發(fā)展的病理機(jī)制，進(jìn)一步找到治療腫瘤疾病相關(guān)的 藥物靶點(diǎn)，從而為這類疾病的預(yù)防或治療提供行之有效的途徑。
[0004] 血管生成包括血管新生(vasculogenesis)和血管發(fā)生(angiogenesis)兩種機(jī)制， 而血管生成的"開關(guān)"是受到機(jī)體促血管生成因子和抑制因子共同調(diào)控，包括生長(zhǎng)因子如血 管生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF)、血小板衍生生長(zhǎng)因子 (platelet-derived growth factor JDGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)等，受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases，RTK)以及一些轉(zhuǎn)錄因子 等。正常的血管生成受到細(xì)胞因子的嚴(yán)格調(diào)控，在兩類因子的動(dòng)態(tài)平衡中保持有序和穩(wěn)定， 而腫瘤微環(huán)境中，血管生成相關(guān)因子異常表達(dá)，致使這一平衡被打破而導(dǎo)致腫瘤血管發(fā)生 (M.Papetti, I.M.Herman,Mechanisms of normal and tumor-derived angiogenesis.American Journal of Physiology-Cell Physiology.2002.282:C947-C970)。研究表明對(duì)細(xì)胞因子十分敏感的血管內(nèi)皮細(xì)胞以及祖細(xì)胞正是調(diào)控這一過程的主 要成員。因此針對(duì)腫瘤血管生成的研究目前主要集中于對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)控機(jī)制的研究。 其中參與調(diào)控最主要的細(xì)胞因子為血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng) 因子(bFGF)，這些分子通過生長(zhǎng)因子受體介導(dǎo)活化下游的信號(hào)通路調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞的增 殖、迀移以及存活等，對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移起到十分關(guān)鍵的作用。其他一些參與血管生成調(diào)控因子也 大多與VEGF調(diào)控相關(guān)，如Dumont等發(fā)現(xiàn)的內(nèi)皮細(xì)胞特異性的酪氨酸激酶受體Tie2，及其配 體Angiopoietin-Ι和2(Ang_l和Ang-2)，研究顯示其在體內(nèi)只有當(dāng)和VEGF-起作用時(shí)才表 現(xiàn)出調(diào)控血管生成的活性，表明這些因子可能參與了細(xì)胞對(duì)VEGF的應(yīng)答。又如內(nèi)皮細(xì)胞和 腫瘤細(xì)胞共同表達(dá)的細(xì)胞表面蛋白Neuropilin為VEGF165以及胎盤生長(zhǎng)因子(placental growth factor，P1GF)的特異性受體，能夠增強(qiáng)VEGF與其受體VEGFR-2的相互作用。此外，研 究發(fā)現(xiàn)其他的一些細(xì)胞因子如Erphrin/Eph、Leptin等因子也參與了調(diào)控。近年來研究人員 發(fā)現(xiàn)還有一些細(xì)胞因子參與了抗血管生成的過程，如Roundabout homolog 4(Robo 4)以及 Notch ligand Delta-like 4,這些因子可以拮抗VEGF信號(hào)來發(fā)揮其抑制作用。目前對(duì)于腫 瘤的血管生成和調(diào)控機(jī)理方面的研究已經(jīng)不僅僅停留在基因和蛋白質(zhì)的水平，隨著 microRNAs(miRs)的發(fā)現(xiàn)和深入研究，其在腫瘤血管方面的調(diào)控作用越來越受到研究人員 的重視，正如研究人員Jason Fish所提到，miRNA為血管生成研究開辟了新的通路。 Giraldez等通過基因敲除的方法沉默Dicer的表達(dá)來抑制miRNA的加工過程，在體內(nèi)外均可 以導(dǎo)致血管生成相關(guān)基因表達(dá)異常，并抑制血管生成。這項(xiàng)研究結(jié)果首次證明了 miRNA在調(diào) 控血管生成中起到至關(guān)重要的作用。由此，越來越多的研究人員開始關(guān)注miRNA在血管生成 中的具體調(diào)控機(jī)制。而內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的miRNA譜成為了研究重點(diǎn)，尤其是內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)的 一些miRNA有可能成為調(diào)控血管生成的關(guān)鍵因子。
[0005] miR-17-3p與miR-19b-l均為本領(lǐng)域已知的miRNA小分子，為腫瘤相關(guān)的基因簇 miR-17-92中的一員，然而，現(xiàn)有技術(shù)對(duì)于miR-17-3p以及miR-19b-l的研究尚未深入，而對(duì) 其所具有的生物學(xué)功能以及作用機(jī)制并不完全清楚。且目前國(guó)內(nèi)外尚無有關(guān)miR-17-3p和/ 或miR-19b-l在腫瘤血管調(diào)控以及體內(nèi)抗腫瘤活性的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供miR-17-3p和miR-19b-l的組合物及其應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明通過生物信息學(xué)分析篩選出在乳腺癌中降低表達(dá)的一系列miRNAs，其中 miR-17-92基因簇中的兩個(gè)成員miR-17-3p及miR-19b-l被證實(shí)可以通過靶向VEGF信號(hào)通路 中的關(guān)鍵分子VEZF1，抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、迀移和成微管能力。在本發(fā)明中首次證實(shí)miR-17-3p及miR-19b-l可以顯著抑制體內(nèi)乳腺癌的生長(zhǎng)，這一分子機(jī)制與調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞的功能 相關(guān)。
[0008]本發(fā)明的第一方面，提供了 miR-17-3p或其前體和miR-19b-l或其前體的組合物在 制備預(yù)防或治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0009]即本發(fā)明提供了microRNAs在制備預(yù)防或治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用，所述的 microRNAs為miR-17-3p或其前體和miR-19b-l或其前體的組合。
[0010]本發(fā)明所述的預(yù)防或治療腫瘤的藥物，尤其是預(yù)防或治療乳腺癌的藥物，所述的 抗腫瘤活性是由抑制乳腺癌誘導(dǎo)血管生成決定的。
[0011]進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供了上述的microRNAs在制備抑制（腫瘤)血管生成藥物中 的應(yīng)用。
[0012] 進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供了上述的microRNAs在制備抑制血管生長(zhǎng)因子(VEZF1)表 達(dá)藥物中的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明所述的miR-17_3p和miR-19b_l的具體序列如下：
[0014] miR-17-3p：5'-ACUGCAGUGAAGGCACUUGU-3'(SEQ ID NO:1)〇
[0015] miR-19b-l:5'-UGUGCAAAUCC