專利名稱：治療帕金森病及帕金森綜合癥的藥物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種治療帕金森病及帕金森綜合癥的藥物及其制備方法，屬于中藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
帕金森病和帕金森綜合癥(Parkinson，PD)是臨床常見病，特別是隨著人口老齡化，老年人口的比例和絕對數(shù)逐漸增加，作為老年退行性腦病的帕金森病和帕金森綜合癥其發(fā)病率和患病率正迅速增加。帕金森病(PD)是以進(jìn)行性運(yùn)動功能障礙為主要臨床表現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性性疾病，震顫、僵直及運(yùn)動減少是其最主要的臨床表現(xiàn)。
目前，市場上尚無治療帕金森病和帕金森綜合癥的中成藥。帕金森病及帕金森綜合癥的治療主要是藥物治療和手術(shù)治療兩大類，手術(shù)療法由于有嚴(yán)格的適應(yīng)癥(原發(fā)性帕金森病的部分患者)、70％左右的復(fù)發(fā)率、技術(shù)難度大，存在手術(shù)并發(fā)癥、價格昂貴等因素，因此，僅僅限于大醫(yī)院的少量患者，不能普及，而大量的患者還是主要依靠藥物治療為主。目前的藥物治療主要是西藥為主，常用的藥物分為多巴胺類制劑，如左旋多巴、美多芭、息寧等，這是治療帕金森病的主要藥物，另外，還有多巴胺受體激動劑，如溴隱停、協(xié)良行等，抗膽堿能藥物，如安坦等，另外，還有增加多巴胺釋放的藥物，如金剛烷胺，抑制多巴胺降解的藥物，如Selegiline等。目前的治療藥物主要是改善癥狀，不能延緩病情的發(fā)展，并且，很多研究發(fā)現(xiàn)，雖然多巴胺類替代療法療效顯著，但應(yīng)用過早，或長期應(yīng)用，或用量較大，反而可能促進(jìn)自身的多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的萎縮，和產(chǎn)生多巴胺的功能喪失，使病情進(jìn)行性加重，因此，現(xiàn)在一般不主張早期應(yīng)用多巴胺類制劑，也不主張大量應(yīng)用。而提出“細(xì)水長流，不求全效”的用藥思路，或推廣“假日療法”等。一般多巴胺類制劑的療效在用藥5～10年后趨于消失，機(jī)體不再有效地吸收和利用多巴胺，最后出現(xiàn)無藥可醫(yī)的局面。另外，治療帕金森病的藥物多數(shù)存在較多的副作用，長期應(yīng)用的患者多數(shù)出現(xiàn)幻覺、異動癥、低血壓、胃部不適、嚴(yán)重心衰、心律失常、精神病、運(yùn)動障礙等不良反應(yīng)，并且長期應(yīng)用還可以出現(xiàn)“開關(guān)現(xiàn)象”、“劑末現(xiàn)象”、“劑量高峰多動癥”等特殊問題，同時很多合并癥如冠心病、低血壓、糖尿病、青光眼、胃病等均因為不良反應(yīng)限制了西藥的應(yīng)用。還有巴胺類替代療法對帕金森綜合癥往往療效較差，甚至無效，所以，積極尋找其它安全有效的治療辦法，改善患者生存質(zhì)量，尤其是早期輕型患者，能代替巴胺類制劑的又無不良反應(yīng)的藥物以及重癥患者提高巴胺類制劑療效、增加其療效持續(xù)時間、減輕其不良反應(yīng)的增效減毒，改善患者生存質(zhì)量的藥物是現(xiàn)代帕金森病藥物研究和開發(fā)的重點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種在總結(jié)多年臨床治療帕金森病經(jīng)驗的基礎(chǔ)上，通過對帕金森病臨床患者的臨床癥狀、證候和體質(zhì)的特點(diǎn)、以及病因病機(jī)的深入研究而制成治療帕金森病及帕金森綜合癥的藥物。
本發(fā)明的另一個目的是提供了該中藥組合物的制備方法。
本發(fā)明藥物選擇白芍、鉤藤、天麻、蒺藜、石決明、制何首烏、珍珠母、牡蠣、丹參、炙甘草進(jìn)行組合的，將這些藥物組合使得各藥物功效產(chǎn)生作用，從而能夠有效地治療帕金森病患者的癥狀。其中選用白芍是因為白芍具有平抑肝陽，養(yǎng)血斂陰，柔肝止痙，與天麻、鉤藤等配伍，可以起到平肝潛陽，熄風(fēng)止痙，用于陰虛陽亢，風(fēng)邪內(nèi)動，肢體或頭部震顫、抖動，眩暈、頭痛、煩躁易怒等肝陽上亢，肝風(fēng)內(nèi)動證；選用鉤藤是因為鉤藤具有息風(fēng)止痙，平肝清熱之功，與白芍合用加強(qiáng)白芍平肝息風(fēng)舒解肢體筋脈攣縮，動作緩慢不靈和肢體震顫的作用；選用天麻是因為天麻具有息風(fēng)止痙，平肝潛陽，祛風(fēng)通絡(luò)之功。與白芍合用，可以加強(qiáng)平抑肝陽、舒痙止顫的作用；選用蒺藜是因為蒺藜具有平肝疏肝，祛風(fēng)明目之功，與白芍、天麻等合用，可以輔助和加強(qiáng)白芍、鉤藤平肝潛陽，息風(fēng)止痙的作用；選用石決明是因為石決明具有清泄肝火，鎮(zhèn)潛肝陽之功，同時由于具有咸寒滋養(yǎng)肝陰的作用，與白芍合用，可以加強(qiáng)白芍的滋補(bǔ)肝之陰血緩解筋脈拘急的作用；選用制何首烏是因為制何首烏具有補(bǔ)益肝腎陰血，潤腸通便之功。與白芍合用，可以加強(qiáng)白芍的滋補(bǔ)肝之陰血緩解筋脈拘急的作用。同時，何首烏還具有潤腸通便之功，對帕金森病患者多數(shù)合并有的便秘有較好的作用；選用珍珠母是因為珍珠母具有平肝潛陽，清肝明目，鎮(zhèn)靜安神作用，與白芍合用，可以加強(qiáng)白芍的平抑肝陽，養(yǎng)血斂陰，柔肝止痙的作用。與石決明、佐藥牡蠣等重鎮(zhèn)藥平肝潛陽藥物合用，可以加強(qiáng)平肝潛陽，重鎮(zhèn)止顫的作用。與鉤藤合用，可以加強(qiáng)鉤藤平抑肝陽之功；選用牡蠣是因為具有平肝潛陽，重鎮(zhèn)安神的作用，與石決明、珍珠母合用，適用于肝陰不足，肝陽上亢所致的震顫、眩暈、頭痛、煩躁易怒等證。同時牡蠣質(zhì)重能鎮(zhèn)，具有安神之功，適用于心神不安，驚悸怔忡，失眠多夢等證；選用丹參是因為丹參具有活血止痛，清心除煩的功效，另外丹參活血養(yǎng)血可加強(qiáng)白芍養(yǎng)血滋陰的作用，丹參藥性偏涼，善入心經(jīng)，能清心除煩安神，與重鎮(zhèn)的石決明、珍珠母、牡蠣合用，對于帕金森病患者的心神不安，驚悸怔忡，失眠多夢等證有較好的治療作用；選用炙甘草是因為炙甘草具有益氣補(bǔ)中，緩急止痛，調(diào)和藥性的作用，炙甘草味甘，與白芍合用，酸甘化陰，柔筋緩急止痛，可以加強(qiáng)白芍的養(yǎng)血斂陰，柔肝止痙，緩解筋脈拘急，進(jìn)而增加肢體靈活性。同時由于炙甘草味甘性平，得中和之性，能緩和鉤藤、天麻、蒺藜諸藥之剛性，使其作用柔和而持久，不致于作用過強(qiáng)而傷肝，與石決明、珍珠母、牡蠣等質(zhì)重的介類重鎮(zhèn)之品合用，可以減輕對胃的刺激，減緩其重鎮(zhèn)潛降之性，固護(hù)肝胃，因此既有佐藥的作用，又有使藥的作用。綜合全方諸藥，本品具有平肝潛陽，養(yǎng)血斂陰，熄風(fēng)止痙，養(yǎng)心安神，舒痙止顫之功，諸藥合力，起到了滋補(bǔ)肝腎，平肝潛陽，息風(fēng)止痙的作用，正好與本品的病機(jī)肝腎陰虛、肝陽上亢，肝風(fēng)內(nèi)動基本一致，達(dá)到改善帕金森氏病、帕金森綜合癥患者的癥狀和生存質(zhì)量。
本發(fā)明藥物是由下列組份制成的(用量為重量份)白 芍73.73～2.99鉤 藤73.73～2.99天麻44.16～1.79蒺 藜74.72～3.03石決明73.73～2.99制何首烏53.09～2.15
珍珠母73.73～2.99牡 蠣73.73～2.99丹參53.09～2.15炙甘草22.23～0.90。
制備本發(fā)明藥物的配方優(yōu)選重量(份)配比范圍是白 芍47.88～2.99鉤 藤47.88～2.99天麻28.68～1.79蒺 藜48.52～3.03石決明47.88～2.99制何首烏34.48～2.15珍珠母47.88～2.99牡 蠣47.88～2.99丹參34.48～2.15炙甘草14.44～0.90。
本發(fā)明藥物的最佳重量(份)配比是白 芍11.97 鉤 藤11.97 天麻7.17蒺 藜12.13 石決明11.97 制何首烏8.62珍珠母11.97 牡 蠣11.97 丹參8.62炙甘草3.61。
本發(fā)明藥物可以采用中藥制劑的常規(guī)方法制備成任何常規(guī)的內(nèi)服藥品。
將上述各組份制成本發(fā)明藥物的制備方法是a)將鉤藤、天麻、制何首烏、丹參加10～90％的乙醇，提取多次，每次0.5～3.0小時，合并乙醇提取液、過濾；b)濾液回收乙醇并濃縮至相對密度為1.0～1.3，備用；c)藥渣與白芍、蒺藜、石決明、珍珠母、牡蠣、炙甘草加水煎煮多次，每次0.5～3.0小時，水煎液濾過，合并濾液及醇提濃縮液，濃縮至相對密度為1.1～1.4；d)加入適量的輔料，制成藥劑。
輔料可以是糊精、阿斯帕坦。
本發(fā)明藥物具有平肝潛陽、熄風(fēng)止痙之功效。用于治療因肝陽上亢，肝風(fēng)內(nèi)動引起的帕金森病和帕金森綜合癥，癥見肢體振顫、僵硬、不靈活，動作緩慢，便秘，面部表情呆板、行動困難，眩暈、頭痛、煩躁易怒、肢體麻木、失眠、多夢、心悸，舌質(zhì)紅，脈弦等病癥。


圖1是HPLC標(biāo)準(zhǔn)品檢測圖譜。
圖2是HPLC紋狀體樣品檢測圖譜。
圖3是致帕金森病樣模型大鼠黑質(zhì)處酪氨酸羥化酶免疫組化染色圖譜。
圖4是本發(fā)明藥物對單側(cè)黑質(zhì)紋狀體通路損毀大鼠模型的藥理作用的技術(shù)路線圖。
圖5是本發(fā)明藥物顆粒對藥物性肌肉震顫模型小鼠的藥理作用示意圖。
圖6是本發(fā)明藥物顆粒對MPTP致PD樣模型小鼠的藥理作用示意圖。
具體實施例方式
以下通過實驗例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明所述藥物的有益效果，這些實驗例為本發(fā)明藥物的藥效學(xué)試驗[實驗例I]本發(fā)明藥物對單側(cè)黑質(zhì)紋狀體通路損毀大鼠模型的藥理作用本實驗例考察本發(fā)明藥物對單側(cè)黑質(zhì)紋狀體通路損毀致帕金森病樣模型大鼠的運(yùn)動功能、大鼠皮層過氧化脂質(zhì)水平、紋狀體內(nèi)多巴胺含量及黑質(zhì)處神經(jīng)元數(shù)量的影響。
實驗材料1、動物SD大鼠，雄性，體重200±20g2、試劑與儀器試劑6-羥多巴胺(6-hydroxydapamine，6-OHDA)、辛烷磺酸鈉鹽(octylsulfate sodium salt，OSA)、多巴胺(Dopamine，DA)、二羥基苯乙酸(dihydroxyphenylacetic acid，DOPAC)、二羥基苯甲胺(3，4-dihydroxybenzylamine，DHBA)、高香草酸(homovanillic acid，HVA)、硫代巴比妥酸(Thiobarbituric acid，TBA)、乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetra-acetic acid，EDTA)、高氯酸、甲醇、酚、酪胺酸羥化酶抗體。
儀器SN-2N型動物腦立體定位儀、8453型紫外可見分光光度計、高效液相色譜儀、460電化學(xué)檢測器、碳18反相色譜柱、T21型高速冷凍離心機(jī)、Image-pro plus圖象采集及分析系統(tǒng)。
實驗方法1、紋狀體6-OHDA定向損毀大鼠模型的建立參照Yukio lchitani等的方法建立6-OHDA紋狀體定向損毀的大鼠PD模型6-OHDA溶于0.9％生理鹽水中(含0.1％抗壞血酸)。大鼠以10％水合氯醛麻醉，腦立體定位儀定位，平顱頭位，右側(cè)為健側(cè)，左側(cè)進(jìn)行四點(diǎn)注射，四點(diǎn)分別為前囟前(AP)0.5-1.0mm，中線旁開(ML)3.0mm，自顱骨表面深度(DV)5.5mm及4.5mm各一點(diǎn)，及平前囟，中線旁開(ML)3.0mm，自顱骨表面深度(DV)5.5mm及4.5mm各一點(diǎn)，每點(diǎn)注射6-OHDA 2μl(3μg/μl)。對照組(假手術(shù))注射等量生理鹽水。
2、大鼠旋轉(zhuǎn)行為的檢測及模型鼠的篩選參照郜文等的實驗方法術(shù)后2周起對各組實驗動物腹腔注射鹽酸阿樸嗎啡(0.25mg/kg)，觀察其行為學(xué)變化，3分鐘后，開始記錄大鼠旋轉(zhuǎn)次數(shù)，連續(xù)測定40分鐘。
在造模4周后進(jìn)行篩選傳統(tǒng)的帕金森病樣大鼠模型制備方式為黑質(zhì)處6-OHDA的定向損毀，選擇旋轉(zhuǎn)圈數(shù)＞6圈/分鐘的大鼠作為合格大鼠模型，但此時大鼠腦中多巴胺(DA)的含量已嚴(yán)重下降，多降低95％以上，為便于觀察藥物作用效果，我們選擇了6-OHDA紋狀體處定向損毀的中度損毀造模方式，選擇恒定向健側(cè)旋轉(zhuǎn)且旋轉(zhuǎn)圈數(shù)＞40圈/40分鐘的大鼠作為合格模型鼠，選擇任一次測定均不產(chǎn)生旋轉(zhuǎn)行為的假手術(shù)大鼠作為對照鼠，其余則淘汰。
在用藥2周和6周時，分別測定阿樸嗎啡誘導(dǎo)的各組大鼠的旋轉(zhuǎn)行為，測定時間40分鐘。計算每只大鼠用藥后旋轉(zhuǎn)圈數(shù)下降率。計算方法下降率＝(用藥前旋轉(zhuǎn)圈數(shù)-用藥后旋轉(zhuǎn)圈數(shù))/用藥前旋轉(zhuǎn)圈數(shù)×100％。
3、分組及給藥將經(jīng)篩選合格大鼠隨機(jī)分組。假手術(shù)組蒸餾水(10ml/kg)連續(xù)灌胃7周；模型組蒸餾水(10ml/kg)連續(xù)灌胃7周；本發(fā)明藥物組分別給予顆粒1g/kg、2g/kg、4g/kg連續(xù)灌胃7周；美多巴組(陽性對照藥組)給予美多巴50mg/kg/日(一日兩次)連續(xù)灌服7周。
4、腦組織脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)測定腦組織稱重，以1∶8的比例加0.2M pH7.4磷酸鹽緩沖液進(jìn)行勻漿，3000rpm離心10min，取上清0.5ml。加1/24mol/L H2SO44ml、10％磷鎢酸0.5ml攪拌，室溫放置5分鐘，3000rpm離心10分鐘，棄上清，倒控1min。加1/24mol/LH2SO42ml、10％磷鎢酸0.3ml，攪拌，室溫放置5分鐘，3000rpm離心10分鐘，棄上清，倒控1分鐘。按下表加試劑。
測定管標(biāo)準(zhǔn)管空白管勻漿沉淀物 有- -四乙氧基丙烷(5nmol/ml) - 0.5 -生理鹽水(ml) 0.5 - 0.50.05mol/L HCl(ml)1 1 1TBA溶液6.7mg/ml(ml) 1 1 1加塞混勻，置沸水浴1h后冷卻，2000rpm離心5min，取上清，532nm測OD值計算丙二醛濃度丙二醛濃度＝f/F×5nmol/ml(F標(biāo)準(zhǔn)溶液OD，f樣品(OD)5、高效液相色譜法對腦組織單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的測定標(biāo)準(zhǔn)品配制各標(biāo)準(zhǔn)品都溶于流動相中，濃度為0.1mg/ml，使用時分別稀釋到10ng/ml，進(jìn)樣量10μl。
色譜條件Waters公司碳十八反相色譜柱，洗脫液80mM磷酸氫二鈉，60mM檸檬酸，0.22mM乙二胺四乙酸二鈉，0.5mM octyl sulfate sodium salt，20％甲醇。調(diào)pH為4.3，經(jīng)過濾脫氣后使用，流量1.0ml/min。電化學(xué)檢測器工作電壓0.7v，測定溫度37℃。標(biāo)準(zhǔn)品在濃度和峰面積間有良好的線性關(guān)系，r2＞0.99。
樣品預(yù)處理參照張林魁等人的方法進(jìn)行樣品的預(yù)處理按照1∶10(w/v)的比例向紋狀體內(nèi)加入0.1M高氯酸(每100ml含L-半胱氨酸5mg，內(nèi)標(biāo)DHBA濃度為200ng/ml)制備勻漿，置高速冷凍離心機(jī)12000轉(zhuǎn)，溫度為4℃離心20分鐘。取上清10μl測定其中的多巴胺用其代謝產(chǎn)物的含量。
6、腦黑質(zhì)處酪胺酸羥化酶的免疫組織化學(xué)染色灌注固定，取材用10％水合氯醛腹腔注射麻醉動物，將動物固定于平臺上，開胸，由心尖剪開左心室，插入灌注針頭至主動脈根部，并剪開右心耳，快速灌注溫鹽水，直至心室內(nèi)無血，肝臟變白，再用預(yù)冷的灌注固定液進(jìn)行灌注固定，直至動物全身僵直，再慢灌10-20分鐘后，取出腦組織放入后固定液中，待組織下沉后應(yīng)用。
免疫組織化學(xué)染色將腦組織從后固定液中取出，用自來水沖洗，修塊，置于異戊烷中，放入液氮中速凍10-15鈔，組織經(jīng)冠狀切面切為40μm厚的組織薄片，將組織片放入PBS液中洗滌，5分鐘/次×3次，組織片用3％H2O2室溫孵育10分鐘，以去除內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS洗液充分洗滌，5分鐘/次×3次，用5-10％封閉用羊血清室溫孵育30分鐘，以減少非特異性吸附，吸出羊血清，加入1∶5000稀釋的酪胺酸羥化酶抗體(TH室溫孵育2小時后轉(zhuǎn)入4℃孵育48小時。PBS洗液充分洗滌，5分鐘/次×3次，加入生物素標(biāo)記的鼠二抗(稀釋度為1∶300，37℃水浴箱中保溫30分鐘，PBS洗液充分洗滌，5分鐘/次×3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的三抗(稀釋度為1∶200)，37℃水浴箱中保溫60分鐘，PBS洗液充分洗滌，5分鐘/次×3次，DAB顯色，鏡下控制染色程度，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。陰性對照的設(shè)立分別以洗液和非免疫的正常兔血清代替一抗進(jìn)行免疫組化染色，其余步驟同前。陽性反應(yīng)為組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)呈棕黃色顆粒聚集。
免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的圖象分析每組隨機(jī)選取3只大鼠行免疫組化切片，將切片置于10×10顯微鏡下觀察各動物黑質(zhì)陽性細(xì)胞，用Image-pro plus軟件采集圖象并分析，記錄陽性細(xì)胞數(shù)，面積及平均灰度。
實驗結(jié)果
1.本發(fā)明藥物對模型大鼠旋轉(zhuǎn)行為的影響對于單側(cè)的黑質(zhì)紋狀體通路損毀模型，同側(cè)的黑質(zhì)-紋狀體通路破壞，紋狀體內(nèi)的神經(jīng)元失去多巴胺能神經(jīng)的支配，其多巴胺受體處于一種超敏狀態(tài)，當(dāng)給予外源性的多巴胺受體激動劑如阿樸嗎啡后，動物損傷側(cè)的反應(yīng)就強(qiáng)于健側(cè)而無法保持平衡，并向健側(cè)旋轉(zhuǎn)，旋轉(zhuǎn)的頻率大致與黑質(zhì)內(nèi)的多巴胺能神經(jīng)元的受損程度一致。本研究給藥前、給藥后2周及6周，分別對大鼠進(jìn)行了旋轉(zhuǎn)行為測定，為消除動物個體差異對實驗結(jié)果的影響，我們對每只大鼠分別進(jìn)行給藥后自身旋轉(zhuǎn)次數(shù)下降率的計算，對模型組與其它各組下降率(％)作t檢驗。實驗發(fā)現(xiàn)模型組大鼠較對照組旋轉(zhuǎn)圈數(shù)明顯增高，本發(fā)明藥物各劑量組都明顯減少大鼠旋轉(zhuǎn)次數(shù)，其中本發(fā)明藥物1g/kg和2g/kg劑量組與模型組相比差異具顯著性(表1)。
表1.本發(fā)明藥物對6-OHDA大鼠旋轉(zhuǎn)行為的影響組別只數(shù)用藥前 用藥2周 用藥6周圈/40min 圈/40min 下降率％ 圈/40min 6周下降率％假手術(shù)組 10 0.0±0.0 0.0±0.0 /0.0±0.0 /模型組 10 96.2±88.190.4±102.5 25.2±36.9 87.5±132.6 27.6±30.3美多巴 10 136.9±92.0 111.7±94.0 29.1±24.9 67.8±82.867.5±30.9**本發(fā)明藥物1g/kg 10 105.5±97.9 68.8±102.6 49.0±40.5 54.4±87.556.9±42.2*本發(fā)明藥物2g/kg 10 122.3±71.6 79.8±49.237.2±38.1 54.8±42.154.9±26.2本發(fā)明藥物4g/kg 9 138.1±68.6 101.0±70.5 33.4±29.4 80.1±74.850.3±30.5對下降率(％)作t檢驗，與模型組相比*P＜0.05，**P＜0.012)本發(fā)明藥物顆粒對模型大鼠皮層過氧化脂質(zhì)的影響給藥7周后，將大鼠斷頭處死，取腦皮層測定脂質(zhì)過氧化代謝產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量。結(jié)果表明模型組大鼠與正常對照組相比，皮層MDA的含量明顯升高，而本發(fā)明藥物顆粒用藥組則可顯著降低MDA的水平(表2)。
表2本發(fā)明藥物顆對6-OHDA大鼠腦皮層MDA的影響組別 N MDA(nmol/mg蛋白)假手術(shù)組 1868.9±13.4*模型組 1277.5±11.5本發(fā)明藥物1g/kg 1077.7±6.7本發(fā)明藥物4g/kg 1069.4±8.5*與模型組相比，*P＜0.053)本發(fā)明藥物顆粒對模型大鼠腦紋狀體多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物含量的影響大鼠給藥7周后，斷頭處死，取腦紋狀體，用高效液相色譜儀測定單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的含量。在此項檢測指標(biāo)中，我們采用的計算方法如下神經(jīng)遞質(zhì)含量降低率＝(健側(cè)神經(jīng)遞質(zhì)含量-損毀側(cè)含量)/健側(cè)神經(jīng)遞質(zhì)含量×100％。結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組大鼠損毀側(cè)紋狀體內(nèi)多巴胺(DA)、多巴酸(DOPAC)及高香草酸(HVA)含量降低率比對照組明顯加重。應(yīng)用本發(fā)明藥物顆粒后，可明顯縮小損傷側(cè)與未損傷側(cè)神經(jīng)遞質(zhì)含量的差異(請參閱圖1、圖2，表3)表3本發(fā)明藥物顆粒對6-OHDA模型大鼠紋狀體中多巴胺及其代謝產(chǎn)物含量降低率的影響組別 NDA降低率(％) DOPAC降低率(％)HVA降低率(％)假手術(shù)組 642.7±27.8**22.4±27.6**21.4±20.1**模型組 783.1±8.177.0±5.9 68.7±13.9美多巴50mg/kg868.0±17.5 61.3±13.9**59.2±14.5本發(fā)明藥物1g/kg 669.6±13.2*62.7±12.6*56.0±3.7*本發(fā)明藥物2g/kg 974.1±8.3*69.9±8.4*65.6±6.5本發(fā)明藥物4g/kg 672.7±20.6 61.0±16.9*67.9±16.9神經(jīng)遞質(zhì)含量降低率＝(健側(cè)神經(jīng)遞質(zhì)含量-損毀側(cè)含量)/健側(cè)神經(jīng)遞質(zhì)含量×100％與模型組相比*P＜0.05，**P＜0.014)本發(fā)明藥物顆粒對模型大鼠黑質(zhì)處酪胺酸羥化酶染色陽性細(xì)胞的影響在本項指標(biāo)中，我們將每組動物左右側(cè)黑質(zhì)處酪胺酸羥化酶(TH)染色陽性的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行自身對比，計算損毀側(cè)TH陽性細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞面積的下降率，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠損毀側(cè)黑質(zhì)處TH陽性細(xì)胞的下降率明顯高于正常對照組，應(yīng)用本發(fā)明藥物顆?？墒菇档偷腡H陽性細(xì)胞率明顯回升(表4)表4，本發(fā)明藥物顆粒對6-OHDA模型大鼠黑質(zhì)處酪胺酸羥化酶染色陽性細(xì)胞的影響組別 N 陽性細(xì)胞數(shù)下降率％ 陽性細(xì)胞面積下降率％假手術(shù) 3 32.32±15.61**26.35±15.32**模型組 3 87.32±4.21 80.83±8.92美多巴50mg/kg 3 62.37±19.93**58.90±22.20**本發(fā)明藥物1g/kg3 36.15±12.00**35.04±13.03**本發(fā)明藥物2g/kg3 37.54±6.62**38.28±5.16**本發(fā)明藥物4g/kg3 64.10±11.99**68.95±14.44**陽性細(xì)胞數(shù)下降率＝(健側(cè)-損傷側(cè)TH陽性細(xì)胞數(shù))/健側(cè)TH陽性細(xì)胞數(shù)×100％陽性細(xì)胞面積下降率＝(健側(cè)-損傷側(cè)TH陽性細(xì)胞面積)/健側(cè)TH陽性細(xì)胞面積×100％與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01實驗表明，本發(fā)明藥物顆粒可以減少神經(jīng)毒物6-羥多巴胺(6-OHDA)對黑質(zhì)內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元的損害，對其具有良好的保護(hù)作用，明顯提升動物損毀紋狀體內(nèi)多巴胺及其代謝產(chǎn)物的含量。
本發(fā)明藥物顆粒對藥物性肌肉震顫模型小鼠的藥理作用本實驗例選用了兩種藥物性肌肉震顫模型檳榔堿震顫和氧合震顫素震顫。記錄動物出現(xiàn)震顫的潛伏期及震顫持續(xù)的時間，以觀察本發(fā)明藥物顆粒對藥物震顫行為的影響。
實驗材料1、動物ICR小鼠，雄性，清潔級，體重18±2g。
2、試劑氧化震顫素(Oxotremorin)、檳榔堿(Arecoline)。
實驗方法1、動物分組及給藥情況小鼠隨機(jī)分組，正常對照組小鼠在給予0.9％生理鹽水單次腹腔注射(0.3ml/只)前，給予蒸餾水連續(xù)灌胃(0.3ml/只)3周；模型組小鼠給予檳榔堿(25mg/kg)或氧化震顫素(0.15mg/kg)單次腹腔注射前蒸餾水連續(xù)灌胃(0.3ml/只)3周；藥物預(yù)實驗后，我們對本發(fā)明藥物組顆粒用藥組小鼠造模前連續(xù)灌胃3周，本發(fā)明藥物顆粒劑量分別為1g/kg、2g/kg、4g/kg；美多巴組(陽性對照藥組)小鼠在造模前1天，美多巴65mg/kg灌胃。
2、檳榔堿肌肉震顫小鼠行為評價采用成年ICR小鼠，檳榔堿25mg/kg腹腔注射，記錄每只小鼠自給予檳榔堿后至產(chǎn)生肉眼明顯可見的肌肉震顫所需時間為震顫潛伏期，震顫產(chǎn)生后至消失所需時間為震顫持續(xù)時間。
3、氧化震顫素震顫小鼠行為評價采用成年ICR小鼠，氧化震顫素0.15mg/kg腹腔注射，記錄每只小鼠自給予氧化震顫素后至產(chǎn)生肉眼明顯可見的肌肉震顫所需時間為震顫潛伏期，震顫產(chǎn)生后至消失所需時間為震顫持續(xù)時間。
實驗結(jié)果1、本發(fā)明藥物顆粒對檳榔堿致小鼠震顫行為的影響結(jié)果表明模型組小鼠在給予檳榔堿腹腔注射后，出現(xiàn)明顯的震顫、流涎、躁動不安等行為，其震顫持續(xù)的時間明顯高于對照組。本發(fā)明藥物顆粒給藥組小鼠在腹腔注射檳榔堿后，震顫、流涎、躁動不安等癥狀較模型組減輕，震顫持續(xù)時間較模型組顯著縮短(表5)。
表5本發(fā)明藥物顆粒對檳榔堿致小鼠震顫時間的影響組別 N 持續(xù)時間(秒)對照組 15 0.0±0.0**模型組 15 430.5±55.1美多巴(65mg/kg) 15 397.3±39.3*本發(fā)明藥物顆粒1g/kg 15 395.8±46.9*本發(fā)明藥物顆粒2g/kg 15 370.6±37.9**本發(fā)明藥物顆粒4g/kg 15 406.8±46.9與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.012、本發(fā)明藥物顆粒對氧化震顫素致小鼠震顫行為的影響結(jié)果表明模型組小鼠在給予氧化震顫素腹腔注射后，出現(xiàn)明顯的震顫行為，其震顫持續(xù)的時間明顯高于對照組。本發(fā)明藥物顆粒給藥組小鼠在腹腔注射氧化震顫素后，震顫、流涎、躁動不安等癥狀較模型組減輕，震顫持續(xù)時間較模型組顯著縮短(表6)。
表6本發(fā)明藥物顆粒對氧化震顫素致小鼠震顫時間的影響組別 N 持續(xù)時間(秒)對照組 15 0.0±0.0**模型組 15 38.9±7.6美多巴(65mg/kg) 15 32.1±4.1**本發(fā)明藥物顆粒1g/kg 15 39.5±3.9*本發(fā)明藥物顆粒2g/kg 15 34.4±5.9*本發(fā)明藥物顆粒4g/kg 15 32.8±6.4*與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01帕金森病人最直觀的臨床表現(xiàn)是肌肉震顫、僵直及運(yùn)動不能。檳榔堿和氧化震顫素均為M受體激動劑，可以引起肌肉的劇烈收縮，能夠模擬該病的震顫表現(xiàn)，故本模型也是評價抗帕金病藥效的一種必要動物模型。本發(fā)明藥物能夠顯著縮短動物震顫持續(xù)時間。
本發(fā)明藥物顆粒對MPTP致PD樣模型小鼠的藥理作用實驗材料1、動物C57BL小鼠，雌、雄各半，清潔級，體重18±2g。
2、試劑及儀器1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP)。
儀器CS-2型小鼠自主活動程序儀。
實驗方法1、MPTP致帕金森病小鼠模型的建立MPTP直接溶于0.9％無菌生理鹽水中，調(diào)節(jié)其終濃度為2mg/ml。模型組動物連續(xù)腹腔注射MPTP20mg/kg，共造模8天。
2、分組及給藥C57BL小鼠隨機(jī)分組。正常對照組蒸餾水灌胃3周后，腹腔注射與模型組等劑量的生理鹽水8天。模型組蒸餾水灌胃3周后，MPTP20mg/kg連續(xù)腹腔注射，共造模8天。本發(fā)明藥物顆粒用藥組在給予本發(fā)明藥物顆粒3周后，腹腔注射MPTP20mg/kg，共造模8天。本發(fā)明藥物顆粒在給予3周后，腹腔注射MPTP20mg/kg，共造模8天。本發(fā)明藥物顆粒的劑量分別為1g/kg、2g/kg、4g/kg；美多巴組(陽性對照藥組)為造模當(dāng)天開始給予美多巴65mg/kg。
3、小鼠爬桿實驗參照Nobutaka Arai；Kazuaki Misugi的實驗方法略加修改，具體測定方法如下實驗用具為自制不銹鋼桿長0.5米，直徑1cm(其上用膠布纏繞)頂端為一直徑2.5cm的木制圓球，動物給予MPTP前一天，先進(jìn)行爬桿訓(xùn)練，引導(dǎo)動物10秒內(nèi)由桿頂爬至桿底，每只訓(xùn)練4次。正式測定時，首先測定應(yīng)用MPTP前小鼠的爬桿時間，在給予MPTP后1-2小時內(nèi)，對動物進(jìn)行第二次爬桿時間的測定。具體測定方法如下持小鼠尾部，將其頭向下置于桿頂部(以小鼠后肢置于球上為準(zhǔn))，讓其自然爬下，記錄小鼠自站于桿頂至雙前肢接觸桿底平臺所需時間。測定時限120秒，鼠不能持桿，完全自然下滑者，記錄其爬桿時間為120秒。計算各組小鼠給予MPTP前后爬桿時間的差值(給予MPTP后爬桿時間短于未處理時，其數(shù)據(jù)記錄為0)。連續(xù)測定造模8天內(nèi)各組小鼠處理前后爬桿時間差值。
4、小鼠自發(fā)活動記數(shù)測定參照李斌等報告的方法，應(yīng)用中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究后研制的CS-2型小鼠自主活動程序儀測定小鼠自發(fā)活動次數(shù)，當(dāng)計算機(jī)進(jìn)入測定程序后，將小鼠放入活動箱中(高13cm，直徑25cm)，每次同時測定4只小鼠，每個活動箱中一只，由計算機(jī)自動記錄小鼠活動情況，測定每只鼠5分鐘內(nèi)的活動次數(shù)，進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。
5、高效液相色譜法對腦組織單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的測定標(biāo)準(zhǔn)品配制各標(biāo)準(zhǔn)品都溶于流動相中，濃度為0.1mg/ml，使用時，分別稀釋到10ng/ml，進(jìn)樣量10μl。
色譜條件Waters公司碳十八反相色譜柱，洗脫液80mM磷酸氫二鈉，60mM檸檬酸，0.22mM乙二胺四乙酸二鈉，0.5mM octyl sulfate sodium salt，20％甲醇。調(diào)pH為4.3，經(jīng)過濾脫氣后使用，流量1.0ml/min。電化學(xué)檢測工作電壓0.7v，測定溫度37℃。標(biāo)準(zhǔn)品在濃度和峰面積間有良好的線性關(guān)系，r2＞0.99。
樣品預(yù)處理參照張林魁等人的方法進(jìn)行樣品的預(yù)處理按照1∶20(w/v)的比例向紋狀體內(nèi)加入0.1M高氯酸(每100ml含L-半胱氨酸5mg，內(nèi)標(biāo)DHBA濃度為200ng/ml)制備勻漿，置高速冷凍離心機(jī)12000轉(zhuǎn)4℃離心20分鐘。取上清10μl測定其中的多巴胺及其代謝產(chǎn)物的含量。
實驗結(jié)果1、本發(fā)明藥物顆粒對小鼠爬桿時間的影響爬桿時間反映了動物的協(xié)調(diào)運(yùn)動能力。協(xié)調(diào)性好則動物爬桿時間所需時間短，協(xié)調(diào)性差，則爬桿時間長。結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組小鼠爬桿時間與正常對照組相比顯著延長，本發(fā)明藥物顆粒用藥組小鼠爬桿時間明顯縮短(表7)。
表7本發(fā)明藥物顆粒對小鼠爬桿時間的影響組別N 造模后時間-造模前時間(秒)對照組 140.32±0.69**模型組 159.19±5.09美多巴(65mg/kg) 157.09±3.20*本發(fā)明藥物顆粒1g/kg 135.67±3.18**本發(fā)明藥物顆粒2g/kg 156.70±3.68*本發(fā)明藥物顆粒4g/kg 145.45±2.64*與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.012、本發(fā)明藥物顆粒對小鼠自主活動的影響自主活動數(shù)反映了動物的隨意運(yùn)動能力。模型組小鼠與正常對照組相比，自主活動明顯減少。本發(fā)明藥物顆粒用藥組小鼠自主活動較模型組顯著增加(表8)。
表8本發(fā)明藥物顆粒對小鼠自主活動的影響組別 N 造模后時間-造模前時間(秒)對照 14 38.6±33.0**模型 15 12.2±9.2美多巴(65mg/kg) 15 70.0±34.7**本發(fā)明藥物顆粒1g/kg 13 18.7±8.4*本發(fā)明藥物顆粒2g/kg 15 18.9±11.9*本發(fā)明藥物顆粒噸/kg 14 20.7±13.2*與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.013、本發(fā)明藥物顆粒對MPTP模型小鼠腦紋狀體中多巴胺及其代謝產(chǎn)物含量的影響小鼠造模后14天，斷頭處死，取腦紋狀體用HPLC電化學(xué)檢測器測定單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的含量。結(jié)果顯示模型組小鼠腦紋狀體內(nèi)多巴胺(DA)、多巴酸(DOPAC)及高香草酸(HVA)的含量較對照組都明顯降低，差異具顯著性。各劑量本發(fā)明藥物顆粒都能不同程度的提高模型動物腦紋狀體內(nèi)多巴胺的含量(表9)。
表9.本發(fā)明藥物顆粒對MPTP模型小鼠紋狀體多巴胺及其代謝產(chǎn)物含量的影響(ng/mg紋狀體重)組別 N DA DOPACHVA對照 10 7.02±2.54**6.17±1.99**2.91±0.57**模型 10 2.08±1.24 2.76±2.24 2.07±0.66美多巴(65mg/kg) 10 3.54±1.91*4.11±2.43 3.17±1.60*本發(fā)明藥物顆粒1g/kg 10 2.82±1.12 4.55±1.88*2.50±0.82本發(fā)明藥物顆粒2g/kg 10 3.60±1.83*5.37±1.78**2.76±0.90*本發(fā)明藥物顆粒4g/kg 10 4.43±2.32**3.74±1.18 2.30±0.53與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01結(jié)論1、對于單側(cè)黑質(zhì)紋狀體通路損毀致帕金森病(PD)大鼠模型，本發(fā)明藥物顆粒對模型鼠的異常旋轉(zhuǎn)行為有明顯的改善作用，它還能夠抑制模型鼠大腦皮層脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的增多，增加黑質(zhì)處酪胺酸羥化酶染色陽性神經(jīng)元數(shù)目，提升大鼠腦紋狀體內(nèi)多巴胺及其代謝產(chǎn)物的含量。
2、對于檳榔堿及氧化震顫素所致的肌肉震顫小鼠模型，本發(fā)明藥物顆粒能明顯減少震顫持續(xù)時間。
3、對于MPTP腹腔注射PD小鼠模型，本發(fā)明藥物顆粒能明顯增強(qiáng)小鼠運(yùn)動協(xié)調(diào)性，縮短其爬桿時間，增強(qiáng)小鼠自主活動能力，提升小鼠腦紋狀體內(nèi)多巴胺及其代謝產(chǎn)物的含量。
本發(fā)明藥物的顆粒劑制備本發(fā)明藥物由下列重量配比的原料藥制成白芍11.97、鉤藤11.97、天麻7.17、蒺藜12.13、石決明11.97、制何首烏8.62、珍珠母11.97、牡蠣11.97、丹參8.62、炙甘草3.61。
它包括下列步驟a)將鉤藤、天麻、制何首烏、丹參加4倍量70％的乙醇，回流提取3次，每次1.5小時，合并乙醇提取液、過濾；b)濾液減壓回收乙醇并濃縮至相對密度為1.10～1.12，溫度為60℃?zhèn)溆?；c)藥渣與白芍、天麻、蒺藜、石決明、珍珠母、牡蠣、炙甘草加8倍量的水，煎煮2次，每次1.5小時，水煎液濾過，合并兩次濾液及醇提濃縮液，濃縮至相對密度為1.15～1.17，溫度為60℃；d)加入適量的糊精及阿斯帕坦3g，噴霧干燥后制成本發(fā)明藥物的顆粒劑，經(jīng)過篩、整粒、分裝。
本發(fā)明藥物的膠囊劑制備本發(fā)明藥物由下列重量配比的原料藥制成白芍11.97、鉤藤11.97、天麻7.17、蒺藜12.13、石決明11.97、制何首烏8.62、珍珠母11.97、牡蠣11.97、丹參8.62、炙甘草3.61。
它包括下列步驟a)將鉤藤、天麻、制何首烏、丹參加4倍量70％的乙醇，回流提取3次，每次1.5小時，合并乙醇提取液、過濾；
b)濾液減壓回收乙醇并濃縮至相對密度為1.10～1.12，溫度為60℃?zhèn)溆?；c)藥渣與白芍、天麻、蒺藜、石決明、珍珠母、牡蠣、炙甘草加8倍量的水，煎煮2次，每次1.5小時，水煎液濾過，合并兩次濾液及醇提濃縮液，濃縮至相對密度為1.15～1.17，溫度為60℃；d)加入適量的輔料，制粒，干燥，分裝入明膠硬膠囊，即得到本發(fā)明藥物的膠囊劑。
本發(fā)明藥物的片劑制備該治病帕金森病的藥物由下列重量配比的原料藥制成白芍11.97、鉤藤11.97、天麻7.17、蒺藜12.13、石決明11.97、制何首烏8.62、珍珠母11.97、牡蠣11.97、丹參8.62、炙甘草3.61。
它包括下列步驟a)將鉤藤、天麻、制何首烏、丹參加4倍量70％的乙醇，回流提取3次，每次1.5小時，合并乙醇提取液、過濾；b)濾液減壓回收乙醇并濃縮至相對密度為1.10～1.12，溫度為60℃?zhèn)溆茫籧)藥渣與白芍、天麻、蒺藜、石決明、珍珠母、牡蠣、炙甘草加8倍量的水，煎煮2次，每次1.5小時，水煎液濾過，合并兩次濾液及醇提濃縮液，濃縮至相對密度為1.15～1.17，溫度為60℃；d)加入適量的輔料，制粒，干燥，壓制成片，分裝，即得到本發(fā)明藥物的片劑。
以上所述僅為本發(fā)明專利的較佳實施例，凡依本發(fā)明專利要求范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明專利權(quán)利要求的涵蓋范圍。
權(quán)利要求
1.一種治療帕金森病及帕金森綜合癥的藥物，其特征在于它由下列重量配比的原料制成的藥劑白 芍 73.73～2.99 鉤 藤 73.73～2.99 天麻 44.16～1.79蒺 藜 74.72～3.03 石決明 73.73～2.99 制何首烏 53.09～2.15珍珠母 73.73～2.99 牡 蠣 73.73～2.99 丹參 53.09～2.15炙甘草 22.23～0.90。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療帕金森病及帕金森綜合癥的藥物，其中各原料的重量配比是白 芍 47.88～2.99 鉤 藤 47.88～2.99 天麻 28.68～1.79蒺 藜 48.52～3.03 石決明 47.88～2.99 制何首烏 34.48～2.15珍珠母 47.88～2.99 牡 蠣 47.88～2.99 丹參 34.48～2.15炙甘草 14.44～0.90。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療帕金森病及帕金森綜合癥的藥物，其中各原料的重量配比是白 芍 11.97鉤 藤 11.97天麻 7.17蒺 藜 12.13石決明 11.97制何首烏 8.62珍珠母 11.97牡 蠣 11.97丹參 8.62炙甘草 3.61。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療帕金森病及帕金森綜合癥藥物的制備方法，其特征在于，它包括下列步驟a)將鉤藤、天麻、制何首烏、丹參加10～90％的乙醇，回流提取多次，每次0.5～3.0小時，合并乙醇提取液、過濾；b)濾液回收乙醇并濃縮至相對密度為1.0～1.3，備用；c)藥渣與白芍、蒺藜、石決明、珍珠母、牡蠣、炙甘草加水煎煮多次，每次0.5～3.0小時，水煎液濾過，合并濾液及醇提濃縮液，濃縮至相對密度為1.1～1.4；d)加入適量的輔料，制成藥劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的治療帕金森病及帕金森綜合癥藥物的制備方法，其特征在于輔料是糊精、阿斯帕坦。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種有效治療帕金森病及帕金森綜合癥的藥物及其制備方法，它是以白芍、鉤藤、天麻、蒺藜、石決明、制何首烏、珍珠母、牡蠣、丹參、炙甘草為原料，通過下述步驟制備a)將鉤藤、天麻、制何首烏、丹參加10～90％的乙醇，回流提取多次，合并乙醇提取液、過濾；b)濾液回收乙醇并濃縮至相對密度為1.0～13；c)藥渣與白芍、蒺藜、石決明、珍珠母、牡蠣、炙甘草加水煎煮多次，水煎液濾過，合并濾液及醇提濃縮液，濃縮至相對密度為1.1～1.4；d)加入適量的輔料，制成藥劑。本發(fā)明配方及制作方法獨(dú)特，治療效果顯著。
文檔編號A61P25/00GK1739743SQ20051003279
公開日2006年3月1日 申請日期2005年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月19日
發(fā)明者王永炎, 袁銳光, 龍超峰, 謝稱石, 陳木洲 申請人:廣東眾生藥業(yè)股份有限公司