專(zhuān)利名稱(chēng)：具有改進(jìn)耐受性的免疫原組合物中的疏水性蛋白調(diào)配物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于誘導(dǎo)對(duì)于疏水性膜蛋白(例如孔蛋白(porin))之免疫反應(yīng)的不引起疼痛或引起較少疼痛的免疫原性和醫(yī)藥組合物。這些組合物用于預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物疾病，例如腦膜炎或淋病。
背景技術(shù)：
大部分以蛋白為主的醫(yī)藥品或者不含有去污劑或者含有相對(duì)溫和的去污劑，例如TWEEN80(聚山梨醇酯80)或TWEEN20。然而，這些溫和去污劑通常不能夠溶解某些疏水性膜蛋白。當(dāng)疏水性膜蛋白從膜上分離時(shí)，其所暴露的疏水性區(qū)域互相作用，引起蛋白分子聚結(jié)并且從水溶液中沉淀出。這些蛋白可以通過(guò)對(duì)疏水性基團(tuán)和水均有親合力的去污劑來(lái)溶解。離子去污劑結(jié)合膜蛋白暴露的疏水性區(qū)域，以及結(jié)合水溶性蛋白的疏水性核心。由于其電荷，因此這些去污劑通常通過(guò)破壞離子鍵和氫鍵來(lái)變性蛋白。舉例來(lái)說(shuō)，高濃度的十二烷基硫酸鈉完全變性蛋白。相反，高濃度的非離子去污劑通過(guò)形成去污劑、磷脂和疏水性膜蛋白的混合膠束來(lái)溶解生物膜。然而，變性蛋白和混合膠束中的蛋白通常不是最適宜用作免疫原組合物。低濃度的這些去污劑可能不溶解疏水性膜蛋白。已經(jīng)顯示兩性離子去污劑有效地溶解從天然膜中提取的疏水性膜蛋白，并且當(dāng)這些蛋白重組產(chǎn)生時(shí)促進(jìn)這些蛋白的再折疊。參看Matsuka，Y.V.等人，J.ProteinChemistry 17(7)719-728(1998)。如下文所述，目前需要包含膜蛋白的有效免疫原組合物，例如來(lái)自病原體腦膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)和淋病奈瑟菌(N.gonorrhoeae)。
腦膜炎雙球菌腦膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)是格蘭氏陰性的包膜雙球菌，其是專(zhuān)性人類(lèi)病原體并且是流行性乙型腦炎的病因體，所述流行性乙型腦炎是腦膜炎的一種最具破壞性形式。這些細(xì)菌遍布全世界，并且可以引起突發(fā)性和流行性疾病。腦膜炎奈瑟菌的人對(duì)人轉(zhuǎn)移主要是通過(guò)空氣途徑進(jìn)行，并且是人與人近距離接觸場(chǎng)所的一個(gè)顯著問(wèn)題，例如監(jiān)獄、軍營(yíng)、宿舍、學(xué)校教室和日托中心。在任何時(shí)候，2與10％之間的人口無(wú)癥狀地?cái)y帶此生物體(Greenfield等人，J.Infec.Dis.1971，12367-73；Moore等人，Scientific American 1994，38-45；Romero等人，Clinicai Microbiology Review1994，7559-575)。因?yàn)樗龅母邤y帶率，因此一直存在爆發(fā)或流行的威脅或潛能。
由血清組指定，腦膜炎奈瑟菌的血清學(xué)分類(lèi)是基于特定菌株的莢膜多糖組合物。在腦膜炎球菌中至少存在13個(gè)不同血清組A、B、C、29-E、H、I、X、L、W135、X、Y和Z。這些血清組中A、B、C和W135是最常見(jiàn)的疾病起因。血清組A、C和W135中莢膜的性質(zhì)引起抗這些血清組的可用免疫原組合物的形成。然而，認(rèn)為血清組B莢膜多糖不適于用于人類(lèi)。因?yàn)樾枰寡褰MB的免疫原組合物，因此致力于表征各種膜蛋白(例如孔蛋白)的抗原性和免疫原性。一些主要的蛋白抗原包括外部膜蛋白(OMP)，例如1類(lèi)(Por A，一種陽(yáng)離子特異性孔蛋白)、2或3類(lèi)(Por B，一種陰離子特異性孔蛋白)以及較次要的4類(lèi)、5類(lèi)OMP(Rmp，和Ope與Opa不透明相關(guān)性蛋白)和載脂表面蛋白。
淋病奈瑟菌淋病是目前全世界一種最廣泛的性病，每年僅美國(guó)就發(fā)生數(shù)百例。所述疾病的病原體是淋球菌淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)，其是一種貫穿其歷史發(fā)展出對(duì)于傳統(tǒng)抗生素治療和在某種程度上對(duì)于正常人類(lèi)血清的殺菌活性的抗性的細(xì)菌。無(wú)力通過(guò)傳統(tǒng)手段控制感染引起對(duì)于可以有效預(yù)防感染的免疫原組合物的需要。
開(kāi)發(fā)用于淋病的免疫原組合物領(lǐng)域的研究最為集中于外部膜蛋白。已經(jīng)描述使用淋球菌膜部分的許多免疫原組合物，例如美國(guó)專(zhuān)利第4,203,971號(hào)、第4,288,557號(hào)和第4,681,761號(hào)。然而，大部分這些組合物含有蛋白與額外細(xì)胞物質(zhì)的混合物，所述混合物的存在通常引起伴隨所需免疫反應(yīng)的不利炎癥或生理反應(yīng)。因此，需要更純形式細(xì)菌抗原的免疫原組合物。
一個(gè)淋病免疫原組合物的候選是已知為蛋白I或Por的特異性外部膜蛋白。Por是疏水性膜蛋白，并且是淋病奈瑟菌的主要外部膜蛋白，其充當(dāng)孔蛋白。認(rèn)為孔蛋白通過(guò)導(dǎo)引小分子量物質(zhì)穿越疏水性脂質(zhì)外部膜而在細(xì)胞內(nèi)運(yùn)作。Por存在許多特征以使其成為可用于免疫原組合物的一種令人感興趣的候選。首先，其至少部分負(fù)責(zé)奈瑟菌中的血清型特異性。其次，其展現(xiàn)為以其自然狀態(tài)暴露于表面，并且誘導(dǎo)調(diào)理素的產(chǎn)生，所述調(diào)理素是結(jié)合于感染生物體表面的抗體以有助于巨噬細(xì)胞吞噬生物體。
在淋球菌中已經(jīng)證實(shí)兩種不同主要類(lèi)型的Por分子，基于肽作圖和對(duì)蛋白質(zhì)水解的感受性而分為PorA(也已知為PIA)和PorB(也已知為PIB)。參看Barrera等人，Infect.Immun.1984，44565-568；Blake等人，Infect.Immun.1981，33212-222。發(fā)現(xiàn)此劃分與血清組模式和發(fā)病機(jī)理有關(guān)系。表達(dá)PorA的淋球菌最可能與全身性感染相關(guān)，而表達(dá)PorB的淋球菌通常與局部感染相關(guān)。參看Buchanan等人，Infect.Immun.1981，32985-994；Hildebrandt等人，Infect.Immun.1978，20267-273。美國(guó)專(zhuān)利第5,736,361號(hào)中描述編碼PIA的實(shí)質(zhì)上經(jīng)純化的核酸分子。美國(guó)專(zhuān)利第6,068,992號(hào)中描述編碼PIB的實(shí)質(zhì)上經(jīng)純化的核酸分子。
因?yàn)槭杷阅さ鞍?，尤其是Por蛋白的潛在有益免疫原作用，因此仍然存在尚未實(shí)現(xiàn)的對(duì)于有效、可耐受次單位免疫原組合物和其制備方法的需要。更具體來(lái)說(shuō)，需要由腦膜炎球菌或淋球菌疏水性膜蛋白組成的免疫原組合物，其制備簡(jiǎn)單、安全、不引起疼痛或引起較少疼痛，并且有效治療和/或預(yù)防感染。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例提供適于人類(lèi)注射的疏水性蛋白的不引起疼痛組合物，所述不引起疼痛組合物包含(a)疏水性蛋白；(b)少于溶解蛋白所需量的一定量?jī)尚噪x子去污劑；和(c)有效維持蛋白在醫(yī)藥學(xué)可接受載劑中溶解性的一定量醫(yī)藥學(xué)可接受的非離子去污劑。本發(fā)明的實(shí)施例也提供對(duì)人類(lèi)進(jìn)行免疫化的方法，所述方法包含非經(jīng)腸投與組合物，其中所述傳染媒介物是人類(lèi)病原體。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，提供一種制備適于投與哺乳動(dòng)物的醫(yī)藥學(xué)可接受載劑中的疏水性蛋白的引起較少疼痛免疫原組合物的方法。所述方法包含以下步驟(a)用兩性離子去污劑溶解所述疏水性蛋白以制得第一組合物；(b)改變所述第一組合物，以使得與所述第一組合物相比，所述經(jīng)改變的組合物產(chǎn)生較少疼痛。在本發(fā)明的其他實(shí)施例中，提供改變包含疏水性蛋白和兩性離子去污劑的組合物的方法，所述方法包括(i)稀釋兩性離子去污劑，(ii)用不引發(fā)疼痛的非離子去污劑替換兩性離子去污劑，和(iii)加入不引發(fā)疼痛的非離子去污劑但保持兩性離子去污劑的濃度恒定。在另一個(gè)實(shí)施例中，改變步驟是稀釋所述兩性離子去污劑，并且其中所述疏水性蛋白是沉淀形式。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，提供一種減少與向哺乳動(dòng)物投與包含疏水性蛋白和兩性離子去污劑的免疫原組合物相關(guān)疼痛的方法。所述方法包含改變所述組合物，以使得經(jīng)改變的組合物與未經(jīng)改變的組合物相比引起較少疼痛，以及投與所述免疫原組合物。在本發(fā)明的其他實(shí)施例中，提供多種改變包含疏水性蛋白和兩性離子去污劑的組合物的方法，所述方法包括(i)稀釋兩性離子去污劑，(ii)用不引發(fā)疼痛的非離子去污劑替換兩性離子去污劑，和(iii)加入不引發(fā)疼痛的非離子去污劑但保持兩性離子去污劑的濃度恒定。在另一個(gè)實(shí)施例中，改變步驟是稀釋所述兩性離子去污劑，并且其中所述疏水性蛋白是沉淀形式。
在一個(gè)特定實(shí)施例中，所述兩性離子去污劑是終濃度低于其CMC的正十四基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸且所述非離子去污劑是終濃度高于其臨界膠束濃度(CMC)的α-[4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基]-ω-羥基聚(氧基-1，2-乙烷二基)。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，在所述非離子去污劑中維持疏水性蛋白的溶解性。在本發(fā)明的一替代實(shí)施例中，改變步驟是稀釋所述兩性離子去污劑，并且其中所述疏水性蛋白是沉淀形式。
在本發(fā)明的某些實(shí)施例中，在大鼠足墊模型中測(cè)量疼痛。在其他實(shí)施例中，如在大鼠足墊模型中所測(cè)量，與未經(jīng)改變的組合物相比，經(jīng)改變的組合物產(chǎn)生至少約50％的疼痛減少。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，提供一種減少與向哺乳動(dòng)物投與包含疏水性蛋白和兩性離子去污劑的免疫原組合物相關(guān)疼痛的方法。所述方法包含改變所述組合物，以使得如在大鼠足墊模型中所測(cè)量，與未經(jīng)改變的組合物相比，經(jīng)改變的組合物產(chǎn)生疼痛減少；和投與所述免疫原組合物，其中如在大鼠足墊模型中所測(cè)量，與未經(jīng)改變的組合物相比，所述經(jīng)改變的組合物產(chǎn)生至少約50％的疼痛減少。
本發(fā)明的其他實(shí)施例提供一種在免疫原組合物中維持疏水性蛋白溶解性的方法，所述方法包含在不引發(fā)疼痛的非離子去污劑中溶解疏水性蛋白，其中不引發(fā)疼痛的非離子去污劑是α-[4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基]-ω-羥基聚(氧基-1，2-乙烷二基)。
本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施例提供一種用含有疏水性膜蛋白的組合物對(duì)人類(lèi)進(jìn)行免疫化而不引發(fā)疼痛的方法，所述方法包含選擇Triton X-100作為醫(yī)藥學(xué)可接受去污劑用以維持疏水性蛋白在最終調(diào)配物中的溶解性；其中Triton X-100的濃度高于CMC。
在本發(fā)明的某些實(shí)施例中，兩性離子去污劑是選自由以下各物質(zhì)組成的群組正辛基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸；正癸基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸；正十二基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸；正十四基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸；3-(N，N-正十六十六基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸；3-[(3-膽酰胺基丙基)二甲基銨基]-1-丙烷磺酸；3-[(3-膽酰胺基丙基)二甲基銨基]-2-羥基-1-丙烷磺酸和正十二基-N，N-二甲基甘氨酸。在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施例中，兩性離子去污劑是正十四基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸。
在本發(fā)明的其他實(shí)施例中，非離子去污劑是選自由以下各物質(zhì)組成的群組α-[4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基]-ω-羥基聚(氧基-1，2-乙烷二基)，聚氧乙烯(20)山梨聚糖單月桂酸酯，聚氧乙烯(20)山梨聚糖單油酸酯和聚氧乙烯(35)月桂基醚。在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施例中，非離子去污劑是α-[4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基]-ω-羥基聚(氧基-1，2-乙烷二基)。
在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施例中，所述兩性離子去污劑是終濃度低于其CMC的正十四基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸和終濃度高于其CMC的α-[4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基]-ω-羥基聚(氧基-1，2-乙烷二基)。
在本發(fā)明的特定實(shí)施例中，疏水性蛋白是膜內(nèi)在蛋白。在本發(fā)明的其他實(shí)施例中，所述膜內(nèi)在蛋白源自選自由以下各物質(zhì)組成群組的傳染媒介物細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)和朊病毒(prion)。在一個(gè)實(shí)施例中，所述傳染媒介物是細(xì)菌，且所述膜內(nèi)在蛋白是孔蛋白。在一個(gè)特定實(shí)施例中，所述膜內(nèi)在蛋白是淋球菌孔蛋白或腦膜炎球菌孔蛋白。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)稀釋去污劑、替換去污劑或添加不引發(fā)疼痛的去污劑來(lái)改變疼痛引發(fā)組合物的去污劑組份，以產(chǎn)生經(jīng)改變但不引發(fā)疼痛的組合物。在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施例中，如在大鼠足墊模型中所測(cè)量，與未經(jīng)改變的組合物相比，經(jīng)改變的組合物產(chǎn)生至少50％的疼痛減少。在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施例中，如在大鼠足墊模型中所測(cè)量，與未經(jīng)改變的組合物相比，經(jīng)改變的組合物產(chǎn)生至少約75％的疼痛減少。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，如在大鼠足墊模型中所測(cè)量，與未經(jīng)改變的組合物相比，經(jīng)稀釋或經(jīng)替換的組合物產(chǎn)生至少約90％的疼痛減少。


圖1此圖是在對(duì)大鼠足墊注射之后，與引起疼痛兩性離子去污劑(Zwittergent3-12)和不引起疼痛非離子去污劑(TritonX-100)的各種免疫原組合物相關(guān)聯(lián)的疼痛的圖形表示。保持引起疼痛兩性離子去污劑的濃度恒定，并且加入增加量的第二不引起疼痛非離子去污劑。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的實(shí)施例提供疏水性蛋白(例如疏水性膜蛋白)的組合物，尤其是具有可接受耐受性的免疫原組合物。本發(fā)明的實(shí)施例也提供制備所述組合物的方法。
盡管先前已經(jīng)揭示了制備其中抗原是疏水性蛋白的免疫原組合物的方法，所述組合物或者含有已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在注射后引起哺乳動(dòng)物疼痛的用于純化的去污劑，或者含有溫和去污劑，例如TWEEN80(聚山梨醇酯80)或TWEEN20，其不能夠溶解某些疏水性蛋白。舉例來(lái)說(shuō)，已經(jīng)用兩性離子去污劑從細(xì)胞膜分離并純化難以溶解的疏水性蛋白，例如膜內(nèi)在蛋白。然而，本發(fā)明的一個(gè)發(fā)現(xiàn)在于這些免疫原組合物中兩性離子去污劑的存在引起人類(lèi)和哺乳動(dòng)物注射后的疼痛，并且顯著地降低所得免疫原組合物的耐受性至不可接受的水平。
本發(fā)明的實(shí)施例涉及出乎意外的發(fā)現(xiàn)，其在于以包含低于臨界膠束濃度的非離子去污劑或兩性離子去污劑的溶液投與的包含疏水性蛋白的免疫原組合物對(duì)受檢者具有良好的耐受性。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，加入引發(fā)較少疼痛或不引起疼痛的去污劑至高于臨界膠束濃度的水平，而保持疼痛引發(fā)去污劑的濃度恒定，并且當(dāng)投與受檢者時(shí)所得組合物具有改進(jìn)的耐受性。如本文所使用，具有“改進(jìn)耐受性”的免疫原組合物是指包含疏水性膜蛋白和去污劑的免疫原組合物，與其中疏水性蛋白在作為唯一去污劑組份的0.05％ Zwittergent 3-14中投與的免疫原組合物相比，當(dāng)注射至受檢者時(shí)所述“改進(jìn)耐受性”的免疫原組合物產(chǎn)生實(shí)質(zhì)上較少的疼痛。
人類(lèi)臨床研究測(cè)試作為保護(hù)性免疫原組合物候選的重組淋球菌PorB(“rPorB”)。免疫原組合物含有0.5ml體積的10mM磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)和0.03％(w/v)Zwittergent(“Zw”)3-14(后者是溶解孔蛋白的兩性離子去污劑)中的50μg重組淋球菌孔蛋白(“GC rPorB”)。然而，注射此組合物通過(guò)在注射處誘導(dǎo)不可接受水平的疼痛而顯示較差的耐受性。接受GC rPorB的8名接受者中的每一名在注射之后隨即感受到疼痛(3名嚴(yán)重，5名中度)而不考慮佐劑，其中2名接受各以下佐劑3-O-脫?；瘑瘟柞；|(zhì)A(MPL)(Corixa，Hamilton，MT)、磷酸鋁、MPL加磷酸鋁，或無(wú)佐劑。注射之后20分鐘內(nèi)此疼痛消除。
在某種程度上，本發(fā)明的實(shí)施例起因于闡述重組次單位免疫原組合物中疼痛來(lái)源的努力。注射后的疼痛是影響非經(jīng)腸免疫原組合物耐受性的嚴(yán)重的臨床問(wèn)題。因?yàn)樯鲜鎏弁窗l(fā)生在所有GC rPorB免疫原組合物群組中，而與佐劑無(wú)關(guān)，因此其不可能歸因于特定佐劑或佐劑與免疫原組合物的相互作用。必須確定疼痛是否歸因于孔蛋白自身、去污劑或兩者的組合。在新西蘭(New Zealand)白兔中所進(jìn)行的GC rPorB免疫原組合物的研究未發(fā)現(xiàn)明顯的毒性跡象和血液學(xué)、化學(xué)或病理學(xué)數(shù)據(jù)中的任何臨床顯著異常。接種處組織病理學(xué)評(píng)分未揭示歸因于GC rPorB蛋白的任何顯著不利反應(yīng)。注射處的偶發(fā)和溫和反應(yīng)(浮腫和紅斑)持續(xù)時(shí)間短暫，并且不與任何特異性抗原或佐劑相關(guān)。必須采用動(dòng)物模型來(lái)確定疼痛的起因，以制備可耐受GC rPorB免疫原組合物。在某種程度上，本發(fā)明的實(shí)施例是基于本研究的結(jié)果。
使用先前用于檢測(cè)與抗生素注射相關(guān)疼痛的動(dòng)物模型，大鼠舔爪(paw-lick)(足墊)模型(Celozzi等人，J.Pharmacol.Methods，1980，4285-189；Comerski等人，F(xiàn)undamental and Appl.Toxicology，1986，6335-338)。此模型監(jiān)控大鼠舉起、舔舐和咬住注射爪的所耗時(shí)間。此模型證明用于溶解GC rPorB的去污劑(Zwittergent3-12或Zwittergent3-14)造成注射后的疼痛。相似的研究已經(jīng)顯示去污劑辛基-糖苷與CHAPS(3-((膽酰胺基丙基)-二甲基銨基)-1-丙烷磺酸)也在注射后引發(fā)相當(dāng)大的疼痛(如果存在的話(huà))。
所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該了解其他活體內(nèi)疼痛模型或活體外相關(guān)疼痛可以用于確定疼痛引發(fā)免疫原組合物被改變?yōu)椴灰l(fā)疼痛免疫原組合物的時(shí)間。
然而，僅僅鑒別問(wèn)題的起因并不預(yù)示著解決問(wèn)題。本發(fā)明的方法和組合物起因于以強(qiáng)非離子去污劑稀釋或替換兩性離子去污劑產(chǎn)生注射后不引發(fā)不可接受疼痛反應(yīng)的可耐受調(diào)配物的進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)。
本發(fā)明的實(shí)施例提供用兩性離子去污劑純化疏水性蛋白，隨后降低兩性離子去污劑的濃度以改進(jìn)所得免疫原組合物的耐受性的方法。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的實(shí)施例針對(duì)制備用于注射至受檢者的含有疏水性膜蛋白的引起較少疼痛或不引起疼痛水平次單位的免疫原組合物。
在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施例中，疏水性蛋白溶解于兩性離子去污劑，例如正十四基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸(Zwittergent3-14)。術(shù)語(yǔ)“兩性離子去污劑”是指總體電中性，但具有正電荷部分和負(fù)電荷部分，并且通常用于溶解疏水性蛋白的去污劑。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該了解本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例也可以接近起始溶解于其他兩性離子去污劑或溶解于尿素中的疏水性蛋白的免疫原組合物。兩性離子去污劑的非限制性實(shí)例包括正辛基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸，Zwittergent3-8；正癸基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸，Zwittergent3-10；正十二基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸，Zwittergent3-12；正十四基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸，Zwittergent3-14；3-(N，N-正十六十六基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸，Zwittergent3-16；3-[(3-膽酰胺基丙基)二甲基銨基]-1-丙烷磺酸，CHAPS；3-[(3-膽酰胺基丙基)二甲基銨基]-2-羥基-1-丙烷磺酸，CHAPSO；正十二基-N，N-二甲基甘氨酸，EMPIGEN BB；和其他能夠引發(fā)大鼠足墊模型疼痛的兩性離子去污劑。

所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該了解也可以用兩性離子去污劑的組合來(lái)在重組表達(dá)之后從細(xì)胞膜或從包涵體中溶解或再折疊本發(fā)明的疏水性蛋白。
在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施例中，組合物中的兩性離子去污劑經(jīng)非離子去污劑稀釋或替換。術(shù)語(yǔ)“表面活性劑”是指當(dāng)以極低濃度使用時(shí)可以極大降低水表面張力的表面活性試劑。術(shù)語(yǔ)“去污劑”是指一類(lèi)具有非極性、疏水性部分和極性、親水性部分的兩性分子的表面活性劑。術(shù)語(yǔ)“去污劑”和“表面活性劑”可以交替使用。去污劑通過(guò)插入至磷脂雙層內(nèi)并且溶解脂質(zhì)和蛋白來(lái)破壞膜。去污劑分子的疏水性部分被碳?xì)浠衔镂?，而親水性部分強(qiáng)烈地被水吸引。一些去污劑為天然產(chǎn)物，但大部分為開(kāi)發(fā)用于清潔和分散油水混合物的合成分子。去污劑的極性(親水性)末端可以帶電荷(離子)，如十二烷基硫酸鈉(SDS)；或者不帶電荷(非離子)，如Triton去污劑；或者可以具有正電荷部分和負(fù)電荷部分，如兩性離子去污劑。
術(shù)語(yǔ)“非離子去污劑”是指充當(dāng)不帶電荷去污劑的分子。親水性基團(tuán)是由一些其他極具水溶性的部分組成，例如短、水溶性聚合物鏈，而不是帶電荷種類(lèi)。非離子去污劑傳統(tǒng)上使用聚(氧化乙烯)鏈作為親水性基團(tuán)。聚(氧化乙烯)是水溶性聚合物；非離子去污劑中所用的聚合物通常為10至100單體單元長(zhǎng)。用聚(氧化乙烯)鏈作為其親水性基團(tuán)的兩類(lèi)普通去污劑是醇乙氧基化物和烷基酚乙氧基化物。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該了解本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例可以接近經(jīng)其他非離子去污劑稀釋或替換的組合物。非離子去污劑的非限制性實(shí)例包括N，N-雙(3-D-葡萄糖-酰胺基丙基)膽酰胺，BigCHAP；α-[4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基]-ω-羥基聚(氧基-1，2-乙烷二基)，TritonX-100；聚氧乙烯(20)山梨聚糖單月桂酸酯，TWEEN20TM；聚氧乙烯(20)山梨聚糖單油酸酯，TWEEN 80；聚氧乙烯(35)月桂基醚，BRIJ35；乙基酚聚(乙二醇醚)11，Nonidet P40，NP40；正辛基-b-D-葡萄哌喃糖苷，OG；和其他能夠溶解疏水性蛋白的非離子去污劑。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該了解非離子去污劑的組合也可以用于溶解疏水性蛋白且減少與投與免疫原組合物中的所述蛋白相關(guān)的疼痛。

如本文所使用術(shù)語(yǔ)“疏水性”是指某些物質(zhì)抵制水的傾向，或著傾向于不與水結(jié)合或不能夠溶于水。如本文所使用術(shù)語(yǔ)“親水性”是指某些物質(zhì)被水吸引或溶于水的傾向。術(shù)語(yǔ)“疏水性蛋白”是指不可溶或僅輕微可溶于水的蛋白。疏水性蛋白通常顯示與水和水溶性離子化合物最小的相關(guān)性，其實(shí)際上相互之間或與水相外部的其他脂質(zhì)相關(guān)。
術(shù)語(yǔ)“組合物”是指用于對(duì)媒質(zhì)或溶液進(jìn)行保存或投放或同時(shí)保存與投放的含水媒質(zhì)或溶液，其優(yōu)選直接投與受檢者。本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的組合物可以包含蛋白、兩性離子去污劑和非離子去污劑。組合物的特征可在于其功能，例如免疫原性、治療性或診斷性組合物。
術(shù)語(yǔ)“免疫原組合物”廣泛是指可以投放以引出對(duì)存在于組合物中抗原的免疫原反應(yīng)的任何組合物。本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的免疫原組合物可以包含抗原蛋白或多肽、兩性離子去污劑、非離子去污劑和離子去污劑。免疫原組合物可以在接受者中用作預(yù)防劑或用作治療。免疫原組合物通常包含免疫有效劑量的免疫原(例如傳染媒介物的抗原)和醫(yī)藥學(xué)可接受載劑和視情況的佐劑。
如本文所定義“分離”意謂蛋白或多肽從特定來(lái)源獲得和分離。舉例來(lái)說(shuō)，“從腦膜炎奈瑟菌分離”意謂蛋白或多肽從腦膜炎奈瑟菌獲得和分離。經(jīng)分離的物質(zhì)可以(但不需要)經(jīng)純化。
如本文所定義“經(jīng)純化”是指令人感興趣的蛋白或多肽已經(jīng)實(shí)質(zhì)上從天然與多肽發(fā)生的各種其他蛋白、脂質(zhì)、核酸和碳水化合物組份分離。所存在的外源組份的殘余量無(wú)論多少均不干擾免疫原組合物中經(jīng)純化物質(zhì)的用途或作為抗原。術(shù)語(yǔ)“經(jīng)純化”并不預(yù)期排除保留其合成矯作物的合成多肽制劑；或者所述術(shù)語(yǔ)不意謂排除包括一些雜質(zhì)的制劑，只要制劑展示可重現(xiàn)蛋白或多肽的特征數(shù)據(jù)即可，例如分子量、糖殘余含量、色譜反應(yīng)和免疫原行為。所述特征可以通過(guò)色譜、凝膠電泳、免疫測(cè)定、組合物分析、質(zhì)譜分析或生物測(cè)定和其他所屬領(lǐng)域已知的方法來(lái)評(píng)價(jià)。
純化方法為所屬領(lǐng)域所熟知。舉例來(lái)說(shuō)，多肽和蛋白可以通過(guò)各種方法來(lái)純化，其包括(但不限于)制備性圓盤(pán)凝膠電泳、等電聚焦、HPLC、倒相HPLC、凝膠過(guò)濾、離子交換和分溶色譜法、沉淀和鹽析色譜法、萃取和逆流分布法。因此，優(yōu)選在重組系統(tǒng)中制備蛋白或多肽，所述重組系統(tǒng)中所表達(dá)的蛋白或多肽含有有助于純化的附加序列標(biāo)簽，例如但不限于聚組氨酸序列或特異性結(jié)合抗體的序列，例如FLAG和GST。隨后可以通過(guò)在適當(dāng)固相基質(zhì)上進(jìn)行色譜以從宿主細(xì)胞的粗溶解液中純化出蛋白或多肽。或者，抗蛋白或抗其所衍生的多肽而產(chǎn)生的抗體可以用作純化試劑。通過(guò)各種技術(shù)純化細(xì)胞，其包括離心、基質(zhì)分離(例如尼龍羊毛分離)、淘篩和其他免疫選擇技術(shù)、消耗(例如污染細(xì)胞的補(bǔ)足消耗)和細(xì)胞分選(例如熒光活化細(xì)胞分選[FACS])。其他純化方法是可能的。經(jīng)純化的物質(zhì)可以含有少于約50％，優(yōu)選少于約75％，且最優(yōu)選少于約90％的其最初相關(guān)的細(xì)胞組份。術(shù)語(yǔ)“實(shí)質(zhì)上純”指示最大程度的純度，其可以通過(guò)使用所屬技術(shù)領(lǐng)域已知的常規(guī)純化技術(shù)完成。
如本文所使用術(shù)語(yǔ)“約”或“大約”意謂在50％的所給定值以?xún)?nèi)，優(yōu)選為所給定值的20％以?xún)?nèi)，更加優(yōu)選為10％以?xún)?nèi)，更加優(yōu)選為5％以?xún)?nèi)，且最優(yōu)選為1％以?xún)?nèi)?；蛘?，術(shù)語(yǔ)“約”或“大約”意謂一個(gè)數(shù)值可能在此數(shù)值類(lèi)型的科學(xué)可接受誤差范圍內(nèi)，此取決于可用工具給出條件下如何進(jìn)行測(cè)量的性質(zhì)。“約”或“大約”定義圍繞平均值的分布。除非另外說(shuō)明，否則所有值均為近似的，并且固有地是在誤差范圍以?xún)?nèi)。
改變?nèi)ノ蹌┙M合物本發(fā)明的實(shí)施例提供制備和投放包含疏水性蛋白的免疫原組合物的方法。所述方法涉及用兩性離子去污劑溶液溶解或再折疊疏水性蛋白。本發(fā)明的某些實(shí)施例提供用非離子去污劑改變疏水性蛋白的去污劑組合物，因此如在大鼠足墊模型中所測(cè)量，與未經(jīng)改變的組合物相比，經(jīng)改變的組合物產(chǎn)生疼痛減少。如本文所使用“改變”是指通過(guò)一種以下的方法改進(jìn)免疫原組合物耐受性的過(guò)程(i)稀釋兩性離子去污劑，(ii)用不引發(fā)疼痛的非離子去污劑替換兩性離子去污劑，或者(iii)加入不引發(fā)疼痛的非離子去污劑但保持兩性離子去污劑的濃度恒定。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例提供制備包含疏水性蛋白的免疫原組合物的方法。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述方法包含用兩性離子去污劑溶解蛋白，隨后用非離子去污劑稀釋兩性離子去污劑以降低兩性離子去污劑的濃度。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，至少以約2的因子稀釋所述兩性離子去污劑，例如約0.05％至約0.025％。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，至少以約4的因子稀釋所述兩性離子去污劑，例如約0.05％至約0.02％。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，至少以約5的因子稀釋所述兩性離子去污劑，例如約0.05％至約0.01％。在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施例中，至少以約7.5的因子稀釋所述兩性離子去污劑，例如約0.05％至0.067％。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，至少以約10的因子稀釋所述兩性離子去污劑，例如約0.05％至約0.005％。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，至少以約15的因子稀釋所述兩性離子去污劑，例如約0.05％至約0.03％。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，至少以約20的因子稀釋所述兩性離子去污劑，例如約0.05％至約0.0025％。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該了解隨著稀釋因子的增加，稀釋的過(guò)程開(kāi)始變?yōu)樘鎿Q過(guò)程。因?yàn)閮尚噪x子去污劑注射后可以引發(fā)疼痛，因此降低所述去污劑的濃度尤其至低于其臨界膠束濃度的水平產(chǎn)生注射后引起較少疼痛的組合物。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該了解包含疏水性蛋白，尤其是疏水性膜蛋白(例如孔蛋白)的不引起疼痛或引起較少疼痛免疫原組合物的優(yōu)勢(shì)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，加入引發(fā)較少疼痛或不引起疼痛的去污劑至足以維持疏水性蛋白的溶解性而同時(shí)保持疼痛引發(fā)去污劑的濃度恒定的水平。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，加入引發(fā)較少疼痛或不引起疼痛的去污劑至高于臨界膠束濃度的水平，而保持疼痛引發(fā)去污劑的濃度恒定。盡管并不傾向于由任何特定理論所支持，相信向疼痛引發(fā)去污劑中加入不引起疼痛去污劑產(chǎn)生疼痛引發(fā)去污劑和不引發(fā)疼痛的去污劑的混合膠束，并且使得注射后所誘發(fā)的疼痛(改進(jìn)的耐受性)減少或消除。參看實(shí)例8。
本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的制備免疫原組合物的替代方法涉及用兩性離子去污劑溶解蛋白，隨后將兩性離子去污劑替換成非離子去污劑。替換去污劑的方法為所屬技術(shù)領(lǐng)域已知。一種這樣的技術(shù)是離子交換色譜法。在離子交換色譜中，蛋白首先溶解在含有兩性離子去污劑的溶液中。隨后將所溶解的蛋白負(fù)載于離子交換管柱上，例如已經(jīng)用相同緩沖液平衡的Q-SepharoseTM管柱(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)。用含有可接受的非離子去污劑的溶液洗滌所結(jié)合的蛋白。用含有非離子去污劑的線(xiàn)性梯度鹽水溶液溶離蛋白。隨后透析所溶離的物質(zhì)，并使其通過(guò)0.22μm濾膜，并且確定經(jīng)過(guò)濾物質(zhì)的蛋白濃度。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該了解可以使用所屬技術(shù)領(lǐng)域已知的其他交換技術(shù)來(lái)將疼痛引發(fā)去污劑替換成不引發(fā)疼痛的去污劑。舉例來(lái)說(shuō)，所述技術(shù)包括膜透析和凝膠過(guò)濾色譜。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，兩性離子去污劑是ZWITTERGENT去污劑，例如ZWITTERGENT3-8ZWITTERGENT3-10ZWITTERGENT3-12ZWITTERGENT3-14或ZWITTERGENT3-16去污劑。
在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施例中，溶于兩性離子去污劑中的蛋白經(jīng)非離子去污劑聚乙二醇叔辛基苯基醚(TRITONX-100)稀釋或替換。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該了解本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例也可以接近溶解于兩性離子去污劑中的疏水性蛋白的免疫原組合物，這些疏水性蛋白經(jīng)另一種非離子去污劑稀釋或替換。在一個(gè)特定實(shí)施例中，聚乙二醇叔辛基苯基醚的終濃度為約0.01％至約0.2％。在另一個(gè)實(shí)施例中，聚乙二醇叔辛基苯基醚的終濃度為約0.05％。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例提供含有經(jīng)稀釋或替換以減少終濃度的兩性離子去污劑的組合物，產(chǎn)生與未經(jīng)稀釋或未經(jīng)替換的組合物相比可以引發(fā)較少疼痛的組合物?？梢酝ㄟ^(guò)大鼠足墊疼痛測(cè)試來(lái)確定疼痛的減少。在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施例中，如通過(guò)大鼠足墊疼痛測(cè)試所測(cè)量，疼痛減少至少50％。在本發(fā)明的另一個(gè)特定實(shí)施例中，兩性離子去污劑的濃度降低至低于其臨界膠束濃度。
本文中所用術(shù)語(yǔ)“疼痛”是指不適的感覺(jué)。疼痛與由于炎癥、局部缺血、機(jī)械或其他刺激所引起的實(shí)際或潛在的損傷或組織損壞相關(guān)。神經(jīng)系統(tǒng)從許多感覺(jué)受體接受輸入。感覺(jué)神經(jīng)元和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元回路包含于周緣神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)。這些回路向中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)發(fā)送信息并從其接收信息，中樞神經(jīng)系統(tǒng)包含腦和脊髓，并且主要包含中間神經(jīng)元。對(duì)特異性環(huán)境刺激產(chǎn)生反應(yīng)的高度專(zhuān)門(mén)感覺(jué)受體細(xì)胞直接向腦發(fā)送其輸出(例如味覺(jué)和嗅覺(jué)受體)，或者向周緣感覺(jué)神經(jīng)元發(fā)送其輸出(例如疼痛和伸展受體)。如本文所使用術(shù)語(yǔ)“傷痛刺激”是指賴(lài)以探測(cè)有害刺激的神經(jīng)機(jī)制。傷痛刺激包含兩個(gè)步驟通過(guò)周緣神經(jīng)末梢轉(zhuǎn)導(dǎo)有害刺激，并且將這些信號(hào)傳輸至中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疼痛敏感(有疼痛反應(yīng))神經(jīng)元。
本文中所用術(shù)語(yǔ)“大鼠足墊疼痛”或“大鼠舔爪”測(cè)試或模型是指用于確定由注射后的特異性調(diào)配物所誘發(fā)疼痛的測(cè)試或模型。所述測(cè)試是由給相同種類(lèi)和大約相同重量的大鼠足墊均一注射待作為疼痛引發(fā)劑來(lái)評(píng)估的組合物和已知引發(fā)注射處疼痛的組合物以及已知不引起注射處疼痛的組合物組成。對(duì)于每個(gè)測(cè)試和對(duì)照調(diào)配物均使用統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著數(shù)量的動(dòng)物。注射之后，將動(dòng)物置于有鏡子的籠中，并且隨后由技術(shù)人員(優(yōu)選為對(duì)免疫原組合物的特性缺乏判斷)觀(guān)察退縮、舉起、舔舐或咬住經(jīng)注射的爪子長(zhǎng)達(dá)20至30分鐘。用秒表記錄這些疼痛反應(yīng)行為所耗時(shí)間，并且合計(jì)達(dá)10分鐘時(shí)段。
本文中所用術(shù)語(yǔ)“較少疼痛”是指與通過(guò)大鼠足墊疼痛測(cè)試所測(cè)量的未經(jīng)改變的組合物相比，組合物中引起疼痛反應(yīng)的時(shí)間長(zhǎng)度或強(qiáng)度或者兩者減少的改變。本文中所用術(shù)語(yǔ)“50％疼痛減少”是指當(dāng)比較以相等注射體積通過(guò)相同手段投與并且觀(guān)察相同長(zhǎng)度時(shí)間的經(jīng)改變與未經(jīng)改變的免疫原組合物時(shí)，通過(guò)大鼠足墊疼痛測(cè)試所測(cè)量的疼痛反應(yīng)所耗時(shí)間的量減少50％。每組中動(dòng)物的數(shù)目為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著數(shù)目。不同注射組的觀(guān)察優(yōu)選是由相同技術(shù)人員進(jìn)行，且其缺乏對(duì)組合物特性的判斷。
本文中所用術(shù)語(yǔ)“臨界膠束濃度(CMC)”是指特異性去污劑的濃度，高于此濃度去污劑分子單體即叢集形成膠束。濃度單位通常給定為任一毫克分子的百分比(V/V)。參看Charles Tanford John wiley和Sons New York的The Hydrophobic EffectFormation Of Micelles And Biological Membranes(第2版，1980)。在極低濃度下，去污劑在純水中溶解為分離分子。隨著濃度的增加，由于疏水性作用，分子開(kāi)始形成膠束。其為小球狀聚結(jié)體，其中分子的親水性部分面向外部，而疏水性部分叢集在中心。膠束形成時(shí)的CMC是每種去污劑的特征，并且與其疏水性和親水性部分的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該了解，通常將CMC值闡述為一定范圍的值，這是因?yàn)樗鲋狄蕾?lài)于溫度、壓力等。一些已知的臨界膠束濃度列示如下

因?yàn)閷尚苑肿勇?lián)合進(jìn)膠束中的驅(qū)動(dòng)力為非特異性，并且因?yàn)樗a(chǎn)生的膠束具有液體樣核心，因此含有去污劑混合物的混合膠束可以容易地形成。如本文所使用“混合膠束”是指含有不同去污劑分子混合物的膠束，例如Zw 3-12與TX-100混合膠束。
蛋白與抗原術(shù)語(yǔ)“抗原”是指可以由免疫系統(tǒng)所識(shí)別，并且在所述識(shí)別后可以引起特異性免疫反應(yīng)，通常是引起特異性抗體和細(xì)胞免疫性產(chǎn)生的任何物質(zhì)。盡管術(shù)語(yǔ)抗原可以包括全部的細(xì)菌或病毒，但是免疫原組合物通常含有次單位抗原，例如來(lái)自病原體的蛋白或肽。次單位抗原可以來(lái)源于任何類(lèi)型的傳染媒介物，例如細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)、真菌或腫瘤細(xì)胞。
包括大腸桿菌(E.coli)在內(nèi)的許多細(xì)菌具有圍繞其原生質(zhì)膜的外部膜。外部膜由各種形成孔的孔蛋白所穿透，其允許高至600道爾頓的所選親水性溶質(zhì)擴(kuò)散穿過(guò)外部脂質(zhì)雙層?？椎鞍资谴┰街|(zhì)雙層并且具有β-桶類(lèi)型蛋白結(jié)構(gòu)的形成孔的跨膜蛋白。一些多通道跨膜蛋白的跨膜節(jié)段安置成為封閉β-片層(β-桶)，而非α-螺旋。所述桶由16股反向平行的β-片層形成，其足夠彎曲以卷入圓柱體結(jié)構(gòu)中。極性側(cè)鏈敷蓋內(nèi)部的水通道，而非極性測(cè)量從桶的外部凸出以與脂質(zhì)雙層的疏水性核心相互作用。所述蛋白的最佳研究實(shí)例是孔蛋白，其是在許多細(xì)菌的外部膜中發(fā)現(xiàn)的。其為完全原子結(jié)構(gòu)已經(jīng)由X光結(jié)晶學(xué)解析的極少數(shù)跨膜蛋白中者。
本發(fā)明的一個(gè)例示性實(shí)施例提供其中抗原為孔蛋白的免疫原組合物。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該了解某些孔蛋白被視為良好的免疫原組合物候選。舉例來(lái)說(shuō)，孔蛋白(Por)A是在自然感染后誘導(dǎo)抗體形成的B組腦膜炎奈瑟菌的莢膜下蛋白抗原(Lehmann，A.K.等人，Infect.Immun.，1999，672552)，并且被視為良好的腦膜炎球菌免疫原組合物候選(van der Voort，E.R.等人，Vaccine，2000，181334)。由于Por蛋白在腦膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌的細(xì)菌細(xì)胞表面上的存在，其相對(duì)守恒的性質(zhì)和其在外部膜中的充足量，因此Por蛋白被注意到是潛在的免疫原組合物候選抗原。參看Heckels，J.E.等人.，Vaccine，8225-230(1990)。分子流行病研究揭示在天然感染期間內(nèi)發(fā)展的Por特異性抗體可以提供抗相同Pot血清型的淋球菌再感染的部分保護(hù)(Plummet，F(xiàn).A.等人，J.Clin.Invest，1989，831472-1476)。根據(jù)結(jié)構(gòu)和免疫化學(xué)特征，已經(jīng)識(shí)別出兩種主要亞類(lèi)型的Por蛋白，命名為PorA和PorB，其由互斥等位基因編碼。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員了解制備包含疏水性膜蛋白的不引起疼痛和較少疼痛免疫原組合物是重要的，包括待投與哺乳動(dòng)物的淋球菌和腦膜炎球菌孔蛋白。
Northern Regional Research Laboratory(NRRL)以入藏登記號(hào)NRRL #B-18263在1987年11月13日存放了導(dǎo)入含有PIA基因的質(zhì)粒pUNC7的大腸桿菌菌株BL21(DE3)。American Type Culture Collection以入藏登記號(hào)67775存放了導(dǎo)入含有PIB基因的質(zhì)粒pUNCH25的大腸桿菌菌株BL21(DE3)。
“膜蛋白”是與膜相關(guān)的蛋白。不同的膜蛋白以不同的方式與膜相關(guān)。許多膜蛋白延伸穿過(guò)脂質(zhì)雙層，其蛋白塊部分位于兩側(cè)。與其脂質(zhì)鄰居相同，所述跨膜蛋白是具有疏水性區(qū)域和親水性其他區(qū)域的兩性分子。其疏水性區(qū)域穿過(guò)膜，并且與雙層內(nèi)脂質(zhì)分子的疏水性尾相互作用。其親水性區(qū)域在膜的一側(cè)或另一側(cè)暴露于水中。一些所述膜蛋白的疏水性隨著插入脂質(zhì)雙層的膜小葉內(nèi)的脂肪酸鏈的共價(jià)結(jié)合而增加。其他膜蛋白完全位于胞液中，或位于周緣原生質(zhì)空間內(nèi)，并且僅借助一個(gè)或一個(gè)以上共價(jià)結(jié)合的脂肪酸鏈或其他類(lèi)型脂質(zhì)鏈而與雙層相關(guān)。其他膜蛋白完全暴露在真核細(xì)胞的外部細(xì)胞表面，或格蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞的外部膜，其僅通過(guò)共價(jià)鍵與雙層連接。
完全不延伸至脂質(zhì)雙層的疏水性?xún)?nèi)部中的一些蛋白通過(guò)與其他膜蛋白的非共價(jià)相互作用結(jié)合于膜的一個(gè)或其他面。通過(guò)相對(duì)溫和的提取過(guò)程將許多所述蛋白從膜中釋放，例如暴露于干擾蛋白-蛋白互作但保留脂質(zhì)雙層完整的極高或極低離子強(qiáng)度或極端pH的溶液中；所述蛋白實(shí)際上稱(chēng)作“周緣膜蛋白”。相反，跨膜蛋白、通過(guò)脂質(zhì)基團(tuán)固持在雙層中的許多蛋白和一些其他緊密結(jié)合蛋白不可能以所述方式釋放，并且因此被稱(chēng)為“膜內(nèi)在蛋白”?？傮w來(lái)說(shuō)，跨膜蛋白(和一些其他緊密結(jié)合膜蛋白)僅可由中斷疏水性相關(guān)性并破壞脂質(zhì)雙層的試劑溶解，例如兩性離子去污劑。
所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該了解本發(fā)明的疏水性蛋白可以通過(guò)重組DNA方法產(chǎn)生，并且用所屬領(lǐng)域已知的方法在細(xì)菌或真核細(xì)胞中表達(dá)。也應(yīng)該了解疏水性蛋白起始可以用尿素或胍溶解單獨(dú)蛋白分子以從包涵體中回收。隨后通過(guò)替換或稀釋于含有兩性離子去污劑或兩性離子去污劑組合或兩性離子去污劑與其他去污劑的組合的溶液來(lái)再折疊所溶解(但已變性)的蛋白。
治療的組合物與方法本發(fā)明的實(shí)施例提供投與動(dòng)物用于免疫療法或免疫預(yù)防，或者用于其他治療或診斷目的的免疫原組合物?？梢酝ㄟ^(guò)注射或不引起不可接受疼痛反應(yīng)的其他投放途徑來(lái)投與所述組合物。免疫原組合物可以包括佐劑和/或載劑。本發(fā)明的實(shí)施例也提供用于投放以預(yù)防或治療特異性疾病的免疫學(xué)有效劑量的組合物。舉例來(lái)說(shuō)，可以投與組合物來(lái)預(yù)防或治療淋病或腦膜炎或任何格蘭陰性細(xì)菌疾病。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，將免疫原組合物投與哺乳動(dòng)物。如本文所使用術(shù)語(yǔ)“哺乳動(dòng)物”被定義為哺乳動(dòng)物綱中的種類(lèi)組。哺乳動(dòng)物的非限制性實(shí)例是農(nóng)業(yè)動(dòng)物，例如綿羊、豬和牛，嚙齒動(dòng)物，例如大鼠和小鼠，和靈長(zhǎng)類(lèi)，例如猴、猿和人類(lèi)。
術(shù)語(yǔ)“免疫學(xué)有效量”是指足以引起所需免疫反應(yīng)的化合物或組合物的量?？傮w來(lái)說(shuō)，本發(fā)明實(shí)施例的免疫原組合物的適當(dāng)免疫學(xué)有效量或劑量的選擇也應(yīng)該基于所用的特定免疫原組合物，以及受檢者的身體情況，尤其包括經(jīng)免疫化受檢者的健康狀況和體重。所述選擇和有效劑量的上調(diào)和下調(diào)是在所屬領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)。誘導(dǎo)免疫反應(yīng)而無(wú)顯著不利副作用所需的活性組份量取決于所用組合物而不同。
在某些實(shí)施例種，免疫原組合物應(yīng)該包含一種或一種以上的佐劑。如本文所使用“佐劑”是用于增強(qiáng)本發(fā)明特定實(shí)施例的免疫原組合物的免疫性的物質(zhì)。
已經(jīng)顯示許多細(xì)胞因子或淋巴因子具有免疫調(diào)節(jié)活性，并且因此可以用作佐劑，其包括(但不限于)介白素1-α、1-β、2、4、5、6、7、8、10、12(參看，例如美國(guó)專(zhuān)利第5,723,127號(hào))、13、14、15、16、17和18(和其突變形式)、干擾素-α、β和γ、粒性白細(xì)胞-巨噬細(xì)胞群落刺激因子(參看，例如美國(guó)專(zhuān)利第5,078,996號(hào)和ATCC入藏登記號(hào)39900)、巨噬細(xì)胞群落刺激因子、粒性白細(xì)胞群落刺激因子、GSF和腫瘤壞死因子α和β?？捎糜诒景l(fā)明特定實(shí)施例的其他佐劑包括趨化因子，包括(但不限于)MCP-1、MIP-1α、MIP-1β和RANTES。黏附分子，例如選擇素，例如L-選擇素、P-選擇素和E-選擇素也可以用作佐劑。其他可用佐劑包括(但不限于)粘蛋白樣分子，例如CD34、GlyCAM-1和MadCAM-1，整合素家族成員，例如LFA-1、VLA-1、Mac-1和p150.95，免疫球蛋白超家族成員，例如PECAM、ICAM，例如ICAM-1、ICAM-2和ICAM-3、CD2和LFA-3，共刺激分子，例如CD40和CD40L，生長(zhǎng)因子，包括脈管生長(zhǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、纖維原細(xì)胞生長(zhǎng)因子、外皮生長(zhǎng)因子、B7.2、PDGF、BL-1和脈管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、受體分子，包括Fas、TNF受體、Fit、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2和DR6。另一種佐劑分子包括卡斯蛋白酶(ICE)。也參看國(guó)際專(zhuān)利公開(kāi)案第WO 98/17799號(hào)和第WO 99/43839號(hào)，所述揭示案全文以引用的方式并入本文。
用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)的合適佐劑進(jìn)一步包括(但不限于)MPL(3-O-脫?；瘑瘟柞；|(zhì)A；Corixa，Hamilton，MT)，其描述于美國(guó)專(zhuān)利第4,912,094號(hào)，其以引用的方式并入本文。也適用的佐劑是可購(gòu)自Corixa(Hamilton，MT)的合成脂質(zhì)A類(lèi)似物或葡糖胺磷酸氨基烷酯化合物(AGP)，或其衍生物或類(lèi)似物，其描述于美國(guó)專(zhuān)利第6,113,918號(hào)，所述專(zhuān)利以引用的方式并入本文。一種所述AGP是2-[(R)-3-十四酰氧基十四?；被鵠乙基2-脫氧基-4-O-膦?；?3-O-[(R)-3-十四酰氧基十四?；鵠-2-[(R)-3-十四酰氧基十四?；?氨基]-b-D-葡萄哌喃糖苷，其也已知為529(先前已知為RC529)。所述529佐劑經(jīng)調(diào)配成水性形式或穩(wěn)定乳液。
其他佐劑包括礦物油和水乳液、鋁鹽(明礬)，例如氫氧化鋁、磷酸鋁等、Amphigen、Avridine、L121/鯊烯、D-交酯-聚交酯/糖苷、普流尼克(pluronic)多元醇、胞壁?；?、殺死博德氏菌(Bordetella)、皂角苷，例如StimulonQS-21(Antigenics，F(xiàn)ramingham，MA.)，描述于美國(guó)專(zhuān)利第5,057,540號(hào)，所述專(zhuān)利以引用的方式并入本文，和由其產(chǎn)生的粒子，例如ISCOMS(免疫刺激復(fù)合物)、結(jié)核桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)、細(xì)菌脂質(zhì)多糖、合成聚核苷酸，例如含有CpG基序的寡核苷酸(美國(guó)專(zhuān)利第6,207,646號(hào)，其以引用的方式并入本文)，百日咳毒素(PT)和大腸桿菌熱不穩(wěn)定毒素(LT)，尤其是LT-K63、LT-R72、PT-K9/G129；參看，例如國(guó)際專(zhuān)利公開(kāi)案第WO 93/13302號(hào)和第WO 92/19265號(hào)，其以引用的方式并入本文。
霍亂毒素和其突變體也可以用作佐劑，其包括描述于已公開(kāi)的國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)第WO00/18434號(hào)者(其中氨基酸29位置處的谷氨酸被另一種氨基酸(除天冬氨酸之外)置換，優(yōu)選為組氨酸)。相似的CT毒素或突變體描述于已公開(kāi)的國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)第WO02/098368號(hào)中(其中氨基酸位置16處的異亮氨酸被另一個(gè)氨基酸置換，或者同時(shí)發(fā)生氨基酸位置68處的絲氨酸被另一個(gè)氨基酸置換；和/或其中氨基酸位置72處的纈氨酸被另一個(gè)氨基酸置換)。其他CT毒素描述于已公開(kāi)的國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)第WO 02/098369號(hào)中(其中氨基酸位置25處的精氨酸被另一個(gè)氨基酸置換；和/或氨基酸位置49處插入一個(gè)氨基酸；和/或氨基酸位置35和36處插入兩個(gè)氨基酸)。
可以使用各種投放途徑。當(dāng)然，所選特定模式可以取決于所選特定免疫原組合物，所治療的特定病癥和治療功效所需劑量。大體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明某些實(shí)施例的方法可以使用任何醫(yī)學(xué)可接受的投放模式實(shí)施，意謂產(chǎn)生有效水平的免疫反應(yīng)而不引起臨床不可接受不利作用的任何模式。投放途徑的實(shí)例包括(但不限于)非經(jīng)腸(例如靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮內(nèi)、經(jīng)皮膚、肌肉內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi))、跨粘膜(例如口服、經(jīng)直腸、鼻內(nèi)、經(jīng)陰道、經(jīng)呼吸)和經(jīng)皮膚(局部)。
免疫原組合物的優(yōu)選投放方法是非經(jīng)腸投放。用于非經(jīng)腸投放的溶液或懸浮液包括以下組份無(wú)菌稀釋劑，例如注射用水、鹽水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗菌劑，例如苯甲醇或羥苯甲酸甲酯；抗氧化劑，例如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，例如乙二胺四乙酸；緩沖液，例如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；和用于調(diào)節(jié)張力的試劑，例如氯化鈉或右旋糖?？梢杂盟峄驂A調(diào)節(jié)pH，例如鹽酸或氫氧化鈉?？梢詫⒎墙?jīng)腸制劑封于安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制得的多劑量瓶中。
術(shù)語(yǔ)“醫(yī)藥學(xué)可接受”是指當(dāng)投與個(gè)體時(shí)，分子實(shí)體和組合物為生理可耐受，并且通常不產(chǎn)生過(guò)敏或相似不適當(dāng)反應(yīng)(例如胃部不適、眩暈和類(lèi)似情形)。優(yōu)選且尤其當(dāng)免疫原組合物用于人類(lèi)時(shí)，術(shù)語(yǔ)“醫(yī)藥學(xué)可接受”可以意謂由管理機(jī)構(gòu)(例如U.S.Foodand Drug Agency)批準(zhǔn)，或在用于人類(lèi)或動(dòng)物的通常公認(rèn)的藥典中所列出(例如美國(guó)藥典(U.S.Pharmacopeia))。
術(shù)語(yǔ)“載劑”是指與化合物一起投放的稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒劑。無(wú)菌水或鹽水溶液和含水右旋糖和甘油溶液優(yōu)選用作載劑，尤其是用于可注射溶液。例示性合適醫(yī)藥學(xué)載劑由E.W.Martin描述于“Reminington’s Pharmaceutical Sciences”中。適當(dāng)載劑為所屬領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的，并且很大程度上取決于投放途徑。
可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)藥學(xué)過(guò)程確定化合物的毒性與治療功效，例如在細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定中，或使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物確定LD50和ED50。參數(shù)LD50和ED50是所屬技術(shù)領(lǐng)域所熟知的，并且分別是指對(duì)50％群體致死和對(duì)50％群體有治療作用的化合物劑量。毒性與治療作用之間的劑量比是指治療指數(shù)，并且可以表示為比率LD50/ED50。展示大治療指數(shù)的化合物為優(yōu)選。盡管可以使用展示毒性副作用的化合物，但是例如尤其優(yōu)選的使用特異性使所述化合物靶向患病組織處的傳輸系統(tǒng)，以將其對(duì)其他細(xì)胞、組織或器官的潛在損害減到最小并且減少副作用。
實(shí)例本發(fā)明的實(shí)施例通過(guò)以下實(shí)例加以描述。然而，本說(shuō)明書(shū)任何地方中的這些或其他實(shí)例的用途僅為說(shuō)明性，并且不以任何方式限制本發(fā)明或任何例示術(shù)語(yǔ)的范疇和含義。同樣，本發(fā)明并不限于本文所描述的任何特定實(shí)施例。事實(shí)上，本發(fā)明的許多修改和變更對(duì)于所屬領(lǐng)域技術(shù)人員在讀完本說(shuō)明書(shū)之后可能是顯而易見(jiàn)的，并且可以在不悖離其精神和范疇下進(jìn)行修改和變更。
縮寫(xiě)以下縮寫(xiě)遍及實(shí)例使用Zw-Zwittergent 3-14；0.1×Zw＝0.005％Zw 3-14；1×Zw＝0.05％Zw 3-14。
TX-TRITON X-100；還原型TRITONX-100(“red TX”)GC PorB-重組淋球菌PorB(來(lái)自菌株FA1090)Mn PorA-重組腦膜炎球菌PorA(I類(lèi)孔蛋白)0.1×PorB＝10μg/ml GC rPorB；1×PorB＝100μg/ml GC rPorB；實(shí)例1各種免疫原組合物注射的疼痛反應(yīng)材料與方法免疫原組合物制備在大腸桿菌中用pET-17b表達(dá)載體(Novagen，Inc.，Madison，WI)制備重組淋球菌PorB(“GC rPorB”來(lái)自淋病奈瑟菌菌株FA1090)。將在包涵體中表達(dá)的所述重組蛋白溶解于尿素中，并且通過(guò)管柱色譜在Zwittergent(“Zw”)3-14中根據(jù)現(xiàn)行優(yōu)良制造規(guī)范(cGMP)進(jìn)行純化。將批量濃縮物于-20℃下儲(chǔ)存于10mM NaPO4(pH 7.4)、150mM NaCl和0.05％(w/v)Zw 3-14(Calbiochem，San Diego，CA；目錄號(hào)693017)中。此物質(zhì)的蛋白濃度為1.3mg/ml。
用注射用水(“WFI”)制備用于在大鼠足墊疼痛模型中測(cè)試的免疫原組合物的所有緩沖液，并且傳經(jīng)0.22μm濾膜。還原型TRITONX-100(“red TX”)購(gòu)自Sigma(St.Louis，MO；目錄號(hào)X-100R-PC)，福爾馬林購(gòu)自EM Sciences(Gibbstown，N.J；目錄號(hào)FX0415-5)，并且包括TRITONX-100(“TX”)(目錄號(hào)X198-05)在內(nèi)的所有其他試劑購(gòu)自J.T.Baker(Phillipsburg，NJ)。對(duì)于實(shí)例1所示的實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)，不是無(wú)熱原質(zhì)的PBS購(gòu)自Sigma(目錄號(hào)P0261)。對(duì)于其余實(shí)例來(lái)說(shuō)，制備無(wú)熱原質(zhì)的PBS。
以下臨床級(jí)別免疫原組合物用于所述研究中1)含有0.05％(w/v)Zw 3-14的PBS(pH 7.2)中含有100μg/ml重組淋球菌孔蛋白的GC rPorB；2)非典型流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)/卡他莫拉菌(Moraxellacatarrhalis)(“NTHi/Mcat”)免疫組合物，其含有以下成分各自50μg來(lái)源于流感嗜血桿菌的重組P4和重組P6蛋白，50μg天然UspA2(卡他莫拉菌)于含有0.04％(v/v)TX(含或不含250μg/ml鋁，如AlPO4)、0.03％(w/v)Zw 3-12的PBS(pH 7.2)中。[所述免疫原組合物不與人類(lèi)志愿者的注射后疼痛相關(guān)，猜想這是因?yàn)?.03％Zw 3-12低于此去污劑的臨界膠束濃度。相反，0.04％ TX濃度高于TX的CMC。]和3)來(lái)自呼吸道合胞病毒(“PFP-2”)的100μg/ml經(jīng)純化F蛋白于含有100μg/ml STIMULONQS-21(Antigenics，F(xiàn)ramingham)的PBS(pH 6.5)中，其與人類(lèi)志愿者的注射后即時(shí)的疼痛相關(guān)。
疼痛對(duì)照也將福爾馬林(甲醛100μl)用作陽(yáng)性疼痛對(duì)照，因?yàn)樽⑸?％福爾馬林溶液引起兩階段的疼痛反應(yīng)，一個(gè)為即時(shí)而另一個(gè)為延遲。
通過(guò)在分層流動(dòng)凈化罩中，用適當(dāng)緩沖液，含有所指的Zw 3-14、TX或還原型TX的PBS(pH 7.2)或10mM Tris(pH 7.5)、150mM NaCl(“TBS”)無(wú)菌稀釋蛋白來(lái)制備用于大鼠足墊研究的實(shí)驗(yàn)免疫原組合物。所述實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照是PBS(pH 7.2)中5％(v/v)福爾馬林。將免疫原組合物分散于2ml 1型玻璃瓶中，其是用West無(wú)乳膠塞和鋁封條密封。所有的免疫原組合物均儲(chǔ)存于2-8℃下。
大鼠足墊疼痛測(cè)試在投與動(dòng)物之前，將免疫原組合物樣品移至室溫下。由不涉及監(jiān)控疼痛反應(yīng)的技術(shù)人員注射動(dòng)物。用來(lái)自Charles River Laboratories Inc.(Kingston，NY)的雄性Sprague Dawley大鼠(CrlCD(SD)IGS BR，取得時(shí)50-100g)進(jìn)行所有研究。在開(kāi)始研究之前，使大鼠適應(yīng)研究設(shè)備大約1周，此時(shí)其稱(chēng)重為100-150g。在注射之前檢查注射爪以確認(rèn)有無(wú)任何受傷。隨后將動(dòng)物限制在技術(shù)人員的手臂內(nèi)，以使后腿向前伸。在踝關(guān)節(jié)上方抓住右后腿，并且施加壓力以使爪筆直外伸，其腳底(底部)向上。對(duì)每只動(dòng)物使用新23號(hào)針，操作人員將斜邊向上插入爪中心，與爪表面平行，直至針位于襯墊的中心。隨后注射物質(zhì)，并且在拔針之前使針在適當(dāng)位置停留3-5秒，以將注射處的滲漏減至最少。注射體積為0.1ml。
隨后將動(dòng)物置于有3個(gè)鏡子(鄰接側(cè)面和地面)的籠中，并且由不同的技術(shù)人員(對(duì)免疫原組合物的特性缺乏判斷)觀(guān)察退縮、舉起、舔舐或咬住受感染的爪子30分鐘。用秒表記錄這些疼痛反應(yīng)行為所耗時(shí)間，并且總計(jì)10分鐘時(shí)期。每組有6只動(dòng)物。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用調(diào)節(jié)用于多重比較的ANOVA方法分析結(jié)果，多重比較是將每個(gè)處理組與僅接受緩沖液(PBS或TBS)的對(duì)照組進(jìn)行比較。這是一種保守方法，因?yàn)檫@些研究中組間測(cè)量的方差差異極大。此外，常態(tài)假設(shè)并不令人滿(mǎn)意。由于這些原因，在用ANOVA方法之前對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行秩轉(zhuǎn)換。
用Wilcoxon秩檢驗(yàn)進(jìn)行比較個(gè)體免疫原組合物的二級(jí)分析。當(dāng)適當(dāng)時(shí)，進(jìn)行Bonferroni多重比較調(diào)節(jié)。這些二級(jí)分析包括以下比較(a)GC rPorB/Zw 3-14稀釋于含有TX或還原型TX的緩沖液中，(b)10μg/ml或100μg/ml GC rPorB于0.05％Zw3-14中，(c)10μg/ml或100μg/ml GC rPorB于含有NTHi/Mcat免疫原組合物的0.05％Zw 3-14中和(d)含有0.05％或0.005％Zw 3-14的PBS。
在關(guān)于與陰性對(duì)照免疫原組合物比較的初級(jí)分析中每個(gè)研究使用0.05α-水平的顯著性，并且在考慮二級(jí)分析下的每個(gè)研究使用另一0.05α-水平的顯著性。多重比較使用Bonferroni調(diào)節(jié)。
結(jié)果表1總結(jié)在相繼10分鐘間隔內(nèi)，對(duì)各種免疫原組合物的0.1ml注射的疼痛反應(yīng)所耗時(shí)間的量。PBS和非典型流感嗜血桿菌/卡他莫拉菌(NTHi/Mcat)用作陰性對(duì)照。PBS+Zw 3-14、來(lái)自呼吸道合胞病毒的PFP+QS-21佐劑(Antigenics，New York，NY)、GC rPorB于PBS+0.05％Zw 3-14中為測(cè)試組。5％福爾馬林用作注射后疼痛的陽(yáng)性對(duì)照。對(duì)每個(gè)處理后觀(guān)察期的每種免疫原組合物群組給定中值、平均值和范圍。每組有6只動(dòng)物。表2總結(jié)了表1結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所報(bào)導(dǎo)的p-值來(lái)自秩轉(zhuǎn)換ANOVA方法。由Steel和Dwaas方法證明統(tǒng)計(jì)學(xué)測(cè)試。
如表1和2所示，在所測(cè)試的組合物中，福爾馬林明顯地誘導(dǎo)最高疼痛反應(yīng)。本研究數(shù)據(jù)的解釋較為復(fù)雜，這是因?yàn)橛米鞔搜芯恐芯彌_液對(duì)照的PBS(購(gòu)自Sigma)不是無(wú)熱原質(zhì)，并且因此很可能引起大于預(yù)期疼痛反應(yīng)的疼痛反應(yīng)。盡管差異并不是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著，但是所述數(shù)據(jù)揭示在免疫化后的前10分鐘內(nèi)由100μg/ml GC rPorB、0.05％Zw3-14于PBS中或PFP-2+QS-21所誘導(dǎo)的疼痛反應(yīng)大于NTHi/Mcat免疫原組合物。
表1 對(duì)各種免疫原組合物的0.1ml注射的疼痛反應(yīng)

表2 表1的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(α-水平＝0.05/5＝0.01)

在下一個(gè)實(shí)例中，免疫原組合物的體積加倍為200μl注射體積，以試圖增加所述方法的總體敏感性。
實(shí)例2注射體積對(duì)疼痛反應(yīng)的作用材料與方法免疫原組合物制備如實(shí)例1所述制備免疫原組合物。為了增加所述模型的敏感性，評(píng)價(jià)所述模型的最大注射體積(0.2ml)。在本實(shí)例中，PBS為無(wú)熱原質(zhì)。
大鼠足墊疼痛測(cè)試如實(shí)例1所述進(jìn)行大鼠足墊疼痛測(cè)試。在本實(shí)例中，每組為4至6只動(dòng)物，并且使用0.1ml與0.2ml注射體積。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析如實(shí)例1所述進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
結(jié)果表3總結(jié)注射體積(0.1ml與0.2ml比較)對(duì)疼痛反應(yīng)的作用。對(duì)每個(gè)處理后觀(guān)察期的每種免疫原組合物組給定疼痛反應(yīng)所耗時(shí)間的中值、平均值和范圍。注意0.1×GCrPorB＝10μg/ml GC rPorB和1×GC rPorB＝100μg/ml GC rPorB。表4總結(jié)了表3結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所報(bào)導(dǎo)的p-值來(lái)自秩轉(zhuǎn)換ANOVA方法。由Steel和Dwaas方法證明統(tǒng)計(jì)學(xué)測(cè)試。*指示Steel和Dwaas方法產(chǎn)生臨界值1秩單位內(nèi)(邊界顯著)的非顯著統(tǒng)計(jì)量。
如表3和4所示，單獨(dú)Zw 3-14和GC rPorB(100μg/ml)+Zw 3-14免疫原組合物所檢測(cè)到的疼痛反應(yīng)大于實(shí)例中所檢測(cè)到的疼痛反應(yīng)(其中僅使用0.1ml注射體積)。PBS陰性對(duì)照為良好耐受性(表3)，并且如所預(yù)期的產(chǎn)生最小疼痛行為(0-10和10-20分鐘期間分別為0秒和3秒的中值)。0-10分鐘期間內(nèi)的疼痛反應(yīng)分析證明含有0.05％Zw 3-14的樣品與PBS緩沖液對(duì)照在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有差異(通過(guò)秩轉(zhuǎn)換ANOVA為p≤0.0009，與α-水平＝0.01比較)。參看表4。此外，在10-20分鐘期間內(nèi)，接受0.2mlGC rPorB臨床調(diào)配物的動(dòng)物與PBS相比仍然展示顯著疼痛反應(yīng)(p＝0.0002，與α-水平＝0.01比較)。用含有0.005％Zw 3-14的免疫原組合物注射的動(dòng)物顯著地展示最小疼痛反應(yīng)，這與PBS陰性對(duì)照所誘導(dǎo)的反應(yīng)極為相似。因?yàn)?.05％Zw 3-14顯著高于其CMC(0.004％-0.015％)，因此這些結(jié)果揭示高于CMC的Zw 3-14的存在可能和注射后疼痛有關(guān)。
表3 注射體積對(duì)疼痛反應(yīng)的作用


表4 經(jīng)0.2ml免疫原組合物注射動(dòng)物的表3數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(α-水平＝0.05/5＝0.01)

考慮到由注射200μl上述免疫原組合物所獲得的增加敏感性，因此剩余實(shí)例將全部采用200μl注射體積的免疫原組合物，并且將保持福爾馬林注射液為100μl。下一步研究評(píng)價(jià)包含PFP-2+QS-21作為陽(yáng)性對(duì)照的免疫原組合物。
實(shí)例3免疫原組合物注射的疼痛反應(yīng)材料與方法免疫原組合物制備如實(shí)例2所述制備免疫原組合物。用于人類(lèi)志愿者注射后疼痛相關(guān)的PFP-2+QS-21免疫原組合物作為陽(yáng)性對(duì)照。
大鼠足墊疼痛測(cè)試如實(shí)例1所述進(jìn)行大鼠足墊疼痛測(cè)試。在本實(shí)例中，每組為8只動(dòng)物，并且使用0.2ml注射體積。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析如實(shí)例1所述進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。此外，用秩轉(zhuǎn)換ANOVA方法，以用于多重比較的Tukey-Kramer調(diào)節(jié)進(jìn)行所有三組之間的比較。
結(jié)果進(jìn)行所述研究以測(cè)試免疫原組合物PFP-2+QS-21是否可以充當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照，因?yàn)槠渑c人類(lèi)志愿者注射后疼痛相關(guān)。除福爾馬林之外的這些免疫原組合物是以0.2ml注射體積投放。表5總結(jié)與注射0.2ml PFP-2+QS-21相關(guān)的疼痛反應(yīng)所耗時(shí)間的長(zhǎng)度。對(duì)每個(gè)處理后觀(guān)察期的每種免疫原組合物組給定中值、平均值和范圍。注意一只具有52秒反應(yīng)的動(dòng)物排除在數(shù)據(jù)外。表6總結(jié)了表5結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所報(bào)導(dǎo)的p-值來(lái)自秩轉(zhuǎn)換ANOVA方法。由Steel和Dwaas方法證明統(tǒng)計(jì)學(xué)測(cè)試。
如表5所示，在前10分鐘內(nèi)，PFP-2+QS-21與GC rPorB免疫原組合物均產(chǎn)生疼痛反應(yīng)。這些反應(yīng)與由0.2ml PBS(陰性對(duì)照)所誘導(dǎo)的反應(yīng)顯著不同(p≤0.0002，與α-水平＝0.05相比)，其又得以良好耐受(參看表6)。
前三個(gè)實(shí)例的結(jié)果證明當(dāng)注射0.2ml免疫原組合物時(shí)，與人類(lèi)志愿者注射后疼痛相關(guān)的兩種免疫原組合物制劑(GC rPorB+0.05％Zw 3-14；PFP-2+QS-21)也引發(fā)大鼠足墊(舔爪)模型中的疼痛。NTHi/Mcat免疫原組合物不與人類(lèi)志愿者注射后疼痛相關(guān)，并且不引發(fā)大鼠足墊模型的疼痛(用0.1ml)。所述結(jié)果進(jìn)一步揭示Zwittergent3-14是與GC rPorB免疫原組合物相關(guān)的一種主要的疼痛來(lái)源。相反，將Zw 3-14濃度降低至0.005％(低于CMC)表現(xiàn)為顯著地降低疼痛反應(yīng)。根據(jù)所述結(jié)果，制備并在所述大鼠模型中測(cè)試移除或減少Zw 3-14的替代性調(diào)配物。
表5 0.2ml PFP-2+QS-21注射的疼痛反應(yīng)

表6 表5數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。(用Tukey-Kramer方法調(diào)節(jié)P-值用于多重比較)

在兩個(gè)不同蛋白濃度下進(jìn)行下一項(xiàng)研究，并且評(píng)價(jià)在保持疼痛引發(fā)免疫原組合物的蛋白組份恒定的同時(shí)稀釋去污劑對(duì)大鼠足墊模型中疼痛誘導(dǎo)的作用。
實(shí)例4不同的ZWITTERGENT3-14或GC rPorB濃度對(duì)疼痛反應(yīng)的作用材料與方法免疫原組合物制備 如實(shí)例3所述制備免疫原組合物。
大鼠足墊疼痛測(cè)試 如實(shí)例1所述進(jìn)行大鼠足墊疼痛測(cè)試。在本實(shí)例中，注射后前20分鐘內(nèi)監(jiān)控疼痛反應(yīng)，這部分由于在起始實(shí)驗(yàn)的20-30分鐘期間內(nèi)所觀(guān)察到的最小疼痛反應(yīng)。用0.2ml注射體積測(cè)試所有的免疫原組合物(排除0.1ml的福爾馬林陽(yáng)性對(duì)照)。每組的動(dòng)物數(shù)目增加到10。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析如實(shí)例1所述進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
結(jié)果表7總結(jié)了不同Zw 3-14或GC rPorB濃度對(duì)使用0.2ml注射的疼痛反應(yīng)所耗時(shí)間長(zhǎng)度的作用。每組有10只動(dòng)物(表7)。對(duì)每個(gè)處理后觀(guān)察期的每種免疫原組合物組給定中值、平均值和范圍。表8總結(jié)了表7結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所報(bào)導(dǎo)的p-值來(lái)自秩轉(zhuǎn)換ANOVA方法。由Steel和Dwaas方法證明統(tǒng)計(jì)學(xué)測(cè)試。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)稀釋疼痛引發(fā)去污劑并且保持蛋白組份恒定來(lái)賦予免疫原組合物更多耐受性。在這些條件下，蛋白可能為沉淀形式并且不可溶。表7顯示測(cè)量由GC rPorB于0.005％Zw 3-14中所誘導(dǎo)的反應(yīng)與相同蛋白劑量于0.05％Zw 3-14中比較的研究結(jié)果。0.005％的Zw 3-14低于CMC，且rPorin蛋白形成良好沉淀物。先前研究已經(jīng)證明所述沉淀形式的蛋白仍然具有免疫原性(數(shù)據(jù)未顯示)，并且因此這代表被認(rèn)為是克服疼痛的一種可能方法的調(diào)配物選擇。表7所示結(jié)果顯示100μg/ml濃度的GC rPorB于0.005％Zw 3-14中不引發(fā)模型中的疼痛，反而相同濃度的GC rPorB于0.05％Zw 3-14中再次引發(fā)顯著疼痛；NTHi/Mcat臨床免疫原組合物再次不引發(fā)疼痛。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析證明當(dāng)與PBS組(表8)相比時(shí)，在GC rPorB于0.005％Zw 3-14中或NTHi/Mcat免疫原組合物所誘導(dǎo)的反應(yīng)之間無(wú)顯著差異。在0-10分鐘期間內(nèi)，含有0.05％Zw 3-14的免疫原組合物所誘導(dǎo)的疼痛反應(yīng)顯著高于PBS(p＜0.0001，與α-水平＝0.00625相比；表8)。
表7 不同Zwittergent 3-14或GC rPorB濃度對(duì)疼痛反應(yīng)的作用

表8 表7數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(α-水平＝0.05/8＝0.00625)

本實(shí)例顯示免疫原組合物的耐受性如何通過(guò)稀釋疼痛引發(fā)去污劑且保持蛋白組份恒定而得以改進(jìn)。下一個(gè)實(shí)例顯示如何首先通過(guò)識(shí)別不引發(fā)疼痛去污劑，隨后將疼痛引發(fā)去污劑替換成不引發(fā)疼痛去污劑而制備具有改進(jìn)耐受性的免疫原組合物。本方法也顯示如何維持蛋白組份的溶解性。
實(shí)倒5TRITONX-100對(duì)GC rPorB所誘導(dǎo)的疼痛反應(yīng)的作用材料與方法免疫原組合物制備 如實(shí)例3所述制備免疫原組合物。
去污劑替換 通過(guò)離子交換色譜完成替代或替換與GC rPorB相關(guān)的去污劑(例如用TX替代Zw 3-14)。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，將在10mM NaPO4(pH 7.4)、150mM NaCl、0.05％(w/v)Zw 3-14中的GC rPorB負(fù)載于Q-SepharoseTM(Amersham-Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)管柱上，其用相同緩沖液平衡。用大約900ml含有25nM NaCl的20mM Tris(pH 8)、0.03％(v/v)TX洗滌所結(jié)合的蛋白。用NaCl于20mM Tris(pH 8)、0.03％(v/v)TX中的線(xiàn)性梯度溶離蛋白。匯集含有GC PorB的溶離份，并且通過(guò)直接加入TX將TX濃度調(diào)節(jié)成0.06％(v/v)。隨后將所匯集的物質(zhì)相對(duì)于含有0.06％(v/v)TX的10mM NaPO4(pH 7.4)、150mM NaCl透析。將所透析的物質(zhì)通過(guò)0.22μm濾膜，并且確定經(jīng)過(guò)濾物質(zhì)的蛋白濃度。
大鼠足墊疼痛測(cè)試如實(shí)例4所述進(jìn)行大鼠足墊疼痛測(cè)試。在本實(shí)例中，每組有8只動(dòng)物。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析如實(shí)例1所述進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
結(jié)果因?yàn)镹THi/Mcat免疫原組合物含有低于CMC的Zwittergent3-12，并且也含有高于TX CMC的0.04％(v/v)的TX，因此令人感興趣的將TX視作GC rPorB的替代性去污劑，這尤其是因?yàn)門(mén)X與Zw 3-12的混合物不與人類(lèi)志愿者的注射后疼痛相關(guān)。
表9總結(jié)了TX對(duì)用0.2ml注射體積GC rPorB所誘導(dǎo)的疼痛反應(yīng)所耗時(shí)間的作用。每組有8只動(dòng)物。對(duì)每個(gè)處理后觀(guān)察期的每種免疫原組合物組給定中值、平均值和范圍。注意Al凝膠＝250μg/ml，鋁為AlPO4。表10總結(jié)了表9結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所報(bào)導(dǎo)的p-值來(lái)自秩轉(zhuǎn)換ANOVA方法。由Steel和Dwaas方法證明統(tǒng)計(jì)學(xué)測(cè)試。*指示Steel和Dwaas方法產(chǎn)生臨界值1秩單位內(nèi)(邊界顯著)的非顯著統(tǒng)計(jì)量。
經(jīng)GC rPorB(100μg/ml)于0.06％TX中注射的動(dòng)物事實(shí)上在0-10分鐘和10-20分鐘期間內(nèi)不顯示疼痛反應(yīng)(分別為p＝0.98與0.55，與α-水平＝0.01相比)。這些反應(yīng)與單獨(dú)PBS所誘導(dǎo)的反應(yīng)相似(表9和10)。這些數(shù)據(jù)證明用TX替換Zw 3-14導(dǎo)致疼痛反應(yīng)的顯著減少。
表9 Triton X-100對(duì)由GC rPorB所誘導(dǎo)的疼痛反應(yīng)的作用

表10 表9的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(α-水平＝0.05/5＝0.01)

從實(shí)際觀(guān)點(diǎn)來(lái)說(shuō)，替換去污劑需要至少一個(gè)另外的步驟，其中可以丟失蛋白或者另外可以招致花費(fèi)。因此，下一個(gè)實(shí)例教示如何設(shè)計(jì)解決疼痛問(wèn)題的方法，其中用不引發(fā)疼痛的去污劑將疼痛引發(fā)去污劑稀釋至不引起疼痛水平。
實(shí)例6將GC rPorB/ZW 3-14稀釋于TRITONX-100緩沖液中的作用材料與方法通過(guò)稀釋制備免疫原組合物作為去污劑替換的替代，調(diào)查了使用現(xiàn)有的批量濃縮物并且直接將所述物質(zhì)稀釋于含有0.05％TX的緩沖液中的可能性，其中所述物質(zhì)是在含有0.05％Zw 3-14的PBS中。所述稀釋產(chǎn)生具有改進(jìn)耐受性的免疫原組合物，其含有低于CMC濃度的殘余量Zw 3-14(~0.004％)。
大鼠足墊疼痛測(cè)試如實(shí)例4所述進(jìn)行大鼠足墊疼痛測(cè)試。每組有10只動(dòng)物。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析如實(shí)例1所述進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
結(jié)果表11總結(jié)了用0.2ml注射體積將GC rPorB/Zw 3-14稀釋于TX緩沖液中的作用。每組有10只動(dòng)物。對(duì)每個(gè)處理后觀(guān)察期的每種免疫原組合物組給定疼痛反應(yīng)所耗時(shí)間的中值、平均值和范圍。表12總結(jié)了表11結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所報(bào)導(dǎo)的p-值來(lái)自秩轉(zhuǎn)換ANOVA方法。由Steel和Dwaas方法證明統(tǒng)計(jì)學(xué)測(cè)試。**指示ANOVA與Steel和Dwaas方法之間有顯著差異。
直接稀釋于含有0.05％TX緩沖液中的免疫原組合物也產(chǎn)生不引起足墊模型中疼痛的制劑。這與對(duì)單獨(dú)PBS、PBS與TX的結(jié)合和稀釋于PBS與TX中的Zw 3-14的疼痛反應(yīng)相似(參看表11和12)。在所述實(shí)例中，在TRITON中維持蛋白的溶解性。
表11 將GC rPorB/Zw 3-14稀釋于Triton X-100緩沖液中的作用

表12 表11的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(α-水平＝0.05/6＝0.00833)

接著我們?cè)u(píng)價(jià)了其他緩沖液體系和其他非離子去污劑是否也可以用于產(chǎn)生具有改進(jìn)耐受性的免疫原組合物。
實(shí)例7在含有TRITONX-100或還原型TRITONX-100的TRIS緩沖鹽水中調(diào)配的GC rPorB的疼痛反應(yīng)材料與方法免疫原組合物制各如實(shí)例6所述制備免疫原組合物。在還原型TX中稀釋現(xiàn)有批量GC rPorB濃縮物。
大鼠足墊疼痛測(cè)試如實(shí)例4所述進(jìn)行大鼠足墊疼痛測(cè)試。每組有10只動(dòng)物。使用TBS代替PBS。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析如實(shí)例1所述進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
結(jié)果表13總結(jié)了在含有TX或還原型TX的TBS中調(diào)配的0.2ml GC rPorB注射液的疼痛反應(yīng)所耗時(shí)間長(zhǎng)度。還原型TX是TX-100的類(lèi)似物，其在280nm下吸收更少，因此使得其使用簡(jiǎn)單且更加可接受。對(duì)每個(gè)處理后觀(guān)察期的每種免疫原組合物組給定中值、平均值和范圍。每組有10只動(dòng)物。表14總結(jié)了表13結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所報(bào)導(dǎo)的p-值來(lái)自秩轉(zhuǎn)換ANOVA方法。由Steel和Dwaas方法證明統(tǒng)計(jì)學(xué)測(cè)試。注意TBS＝10mM Tris(pH 7.5)、150mM NaCl。
當(dāng)在TBS稀釋液中使用0.05％TX或還原型TX時(shí)得到相似的結(jié)果，進(jìn)行改變以使GCrPorB結(jié)合佐劑氫氧化鋁(參看表13)。TX或還原型TX組合物的結(jié)果與緩沖液對(duì)照統(tǒng)計(jì)學(xué)上不可區(qū)分(參看表14)。
表13在含有Triton X-100或還原型Triton X-100的Tris緩沖鹽水中調(diào)配的0.2ml GC rPorB注射液的疼痛反應(yīng)。

表14 表13的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(α-水平＝0.05/6＝0.00833)

稀釋疼痛引發(fā)去污劑的膠束至低于其臨界膠束濃度的水平，并且加入不引發(fā)疼痛的去污劑至高于其CMC的水平產(chǎn)生高度耐受性免疫原組合物。在下一項(xiàng)實(shí)例中，評(píng)價(jià)了是否可以設(shè)計(jì)出疼痛問(wèn)題的解決方法，其中疼痛引發(fā)去污劑維持在高于其CMC，但加入不引發(fā)疼痛的去污劑以制造混合膠束并減輕疼痛。
實(shí)例8通過(guò)加入TRITONX-100并且維持ZWITTERGENT3-12恒定以將疼痛免疫原組合物轉(zhuǎn)換成不引起疼痛免疫原組合物材料與方法注射制劑在大鼠足墊模型中評(píng)價(jià)以下去污劑和去污劑組合的制備0.2％Zw 3-12于PBS中；0.2％Zw 3-12與0.002％TX；0.2％Zw 3-12與0.01％TX；0.2％Zw 3-12稀釋于0.05％TX中；0.2％Zw 3-12稀釋于0.2％TX中。
大鼠足墊疼痛測(cè)試如實(shí)例4所述進(jìn)行大鼠足墊疼痛測(cè)試。每組有10只動(dòng)物。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析如實(shí)例1所述進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(數(shù)據(jù)未顯示)。
結(jié)果圖1顯示與注射添加不同濃度TX的Zw 3-12比較時(shí)注射Zw 3-12誘導(dǎo)的所產(chǎn)生的疼痛。舉例來(lái)說(shuō)，如通過(guò)大鼠足墊模型所證實(shí)，未經(jīng)稀釋0.2％Zw 3-12和加入0.002％TX的0.2％Zw 3-12產(chǎn)生相對(duì)大量的疼痛。在這些調(diào)配物中，疼痛引發(fā)兩性離子去污劑的濃度維持恒定于0.2％Zw 3-12，并且加入增加量的第二不引起疼痛非離子去污劑(TX)以產(chǎn)生混合膠束。如圖1所示，當(dāng)注射至大鼠足墊模型的大鼠中時(shí)，向0.2％Zw 3-12溶液中加入0.01％TX、0.05％TX或0.2％TX產(chǎn)生疼痛反應(yīng)的顯著降低。
如所述曲線(xiàn)顯示，向0.2％Zwittergent 3-12溶液(終濃度)中加入Triton X-100產(chǎn)生疼痛反應(yīng)的降低。當(dāng)達(dá)到0.01％Triton X-100濃度時(shí)，所述作用變?yōu)槊黠@；當(dāng)加入Triton X-100達(dá)到0.2％終濃度時(shí)，疼痛調(diào)停繼續(xù)。這些結(jié)果與預(yù)期相反。通常預(yù)期免疫原組合物中加入越多的去污劑，所述溶液越能夠更充分地溶解細(xì)胞，并且應(yīng)該誘導(dǎo)更多的疼痛。
數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析展示0-10分鐘時(shí)僅對(duì)具有最低Triton X-100的組與陰性對(duì)照(例如，單獨(dú)0.05％Triton X-100)相比較進(jìn)行非顯著測(cè)試。相似地，在10-20分鐘時(shí)相同比較為非顯著，并且此外0.01％Triton X-100混合物與陰性對(duì)照無(wú)顯著差異。
可以推斷通過(guò)向0.2％Zwittergent 3-12溶液中加入0.01％Triton X-100，產(chǎn)生Zwittergent 3-12與Triton X-100的混合膠束，并且這些膠束具有溶液中的物理特性，其引起注射此溶液后的較少疼痛。
在下一個(gè)實(shí)例中，通過(guò)測(cè)量大鼠足墊模型中的疼痛誘導(dǎo)來(lái)評(píng)價(jià)各種去污劑的耐受性。
實(shí)例9各種去污劑的耐受性材料與方法注射制劑表15、16和17中所列的去污劑制備為高于每種去污劑CMC的所指濃度。所有注射液的體積均為200μl，除了100μl的福爾馬林。
大鼠足墊疼痛測(cè)試如實(shí)例4所述進(jìn)行大鼠足墊疼痛測(cè)試。每組有8只動(dòng)物。
結(jié)果調(diào)查去污劑以確定當(dāng)注射濃度高于去污劑的CMC時(shí)，哪種兩性離子、非離子和離子去污劑引發(fā)疼痛，以及哪種不引發(fā)疼痛。結(jié)果顯示當(dāng)注射時(shí)，非離子去污劑TRITON X-100、還原型TRITON X-100、TWEEN 80和BRIJ為高度耐受性，并且不引發(fā)大鼠足墊模型中的顯著疼痛。參看表15、16和17。相反，兩性離子去污劑ZWITTERGENT 3-10、ZWITTERGENT3-12、ZWITTERGENT 3-14、CHAPS和EMIPGEN BB均引發(fā)大鼠足墊模型中的顯著疼痛，并且可能不適于用作免疫原組合物。相似地，非離子去污劑十二烷基麥芽糖苷和辛基糖苷誘導(dǎo)大鼠足墊模型的疼痛。
表15 大鼠足墊模型中各種去污劑所誘導(dǎo)的疼痛調(diào)查

*NI-非離子；ZW-兩性離子。
表16 大鼠足墊模型中各種去污劑所誘導(dǎo)的疼痛調(diào)查(續(xù))

*NI-非離子；ZW-兩性離子。
表17 大鼠足墊模型中各種去污劑所誘導(dǎo)的疼痛調(diào)查(續(xù))

*NI-非離子；ZW-兩性離子；I-離子。
在下一個(gè)實(shí)例中，我們尋找檢驗(yàn)顯示與淋球菌PorB相同耐受性模式的其他疏水性蛋白。
實(shí)例10注射含有重組腦膜炎球菌PORA(I類(lèi)孔蛋白)的免疫原組合物的疼痛反應(yīng)。
材料與方法免疫原組合物制備 如實(shí)例2所述制備免疫原組合物。
大鼠足墊疼痛測(cè)試 如實(shí)例1所述進(jìn)行大鼠足墊疼痛測(cè)試。在本實(shí)例中，每組為10只動(dòng)物，并且使用0.2ml注射體積。
結(jié)果進(jìn)行本研究以測(cè)試重組孔蛋白腦膜炎球菌PorA(I類(lèi)孔蛋白)是否顯示與先前實(shí)例中淋球菌PorB的相同耐受性模式。
結(jié)果指出當(dāng)與ZWITTERGENT 3-14和TRITON X-100結(jié)合于免疫原組合物，并且評(píng)估于大鼠足墊模型中時(shí)，腦膜炎球菌PorA顯示與淋球菌PorB相同耐受性模式。參看表18。包含腦膜炎球菌PorA和ZWITTERGENT 3-14的免疫原組合物誘導(dǎo)大鼠足墊模型中的疼痛，而包含腦膜炎球菌PorA和TRITON X-100的免疫原組合物耐受性更強(qiáng)，這是由于其在大鼠足墊模型中所誘導(dǎo)的疼痛比腦膜炎球菌PorA和ZWITTERGENT 3-14所誘導(dǎo)的疼痛少。
表18的數(shù)據(jù)也顯示加入佐劑AlOH對(duì)于所誘導(dǎo)疼痛的水平無(wú)積極或消極的影響，并且因此對(duì)免疫原組合物的耐受性無(wú)積極或消極的影響。參看表18。
表18其中腦膜炎球菌孔蛋白Por A作為疏水性蛋白的免疫原組合物所誘導(dǎo)的疼痛

* * * * *本發(fā)明的范疇并不受本文所描述的特定實(shí)施例限制。事實(shí)上，根據(jù)先前描述和附圖，除本文所描述的修改之外的本發(fā)明各種修改對(duì)所屬領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。所述修改傾向于在附加申請(qǐng)專(zhuān)利范圍的范疇內(nèi)。
進(jìn)一步了解所有值均為近似的，并且用于描述。
貫穿本申請(qǐng)案中引用專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)案、公開(kāi)案、產(chǎn)品描述和實(shí)驗(yàn)方法，為達(dá)所有目的，因此所述揭示的內(nèi)容全文以引用的方式并入本文。
權(quán)利要求
1.一種適于注射至人類(lèi)的疏水性蛋白的不引起疼痛組合物，其包含(a)疏水性蛋白；(b)低于溶解所述蛋白所需量的一定量的兩性離子去污劑；和(c)一定量的醫(yī)藥學(xué)可接受的非離子去污劑，其有效維持所述蛋白在醫(yī)藥學(xué)可接受載劑中的溶解性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述兩性離子去污劑是選自由以下各物質(zhì)組成的群組正辛基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸；正癸基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸；正十二基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸；正十四基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸；3-(N，N-正十六基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸；3-[(3-膽酰胺基丙基)二甲基銨基]-1-丙烷磺酸；3-[(3-膽酰胺基丙基)二甲基銨基]-2-羥基-1-丙烷磺酸；和正十二基-N，N-二甲基甘氨酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述兩性離子去污劑是正十四基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述非離子去污劑是選自由以下各物質(zhì)組成的群組α-[4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基]-ω-羥基聚(氧基-1，2-乙烷二基)、聚氧乙烯(20)山梨聚糖單月桂酸酯、聚氧乙烯(20)山梨聚糖單油酸酯和聚氧乙烯(35)月桂基醚。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的組合物，其中所述非離子去污劑是α-[4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基]-ω-羥基聚(氧基-1，2-乙烷二基)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述兩性離子去污劑是終濃度低于其臨界膠束濃度(CMC)的正十四基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸且所述非離子去污劑是終濃度高于其CMC的α-[4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基]-ω-羥基聚(氧基-1，2-乙烷二基)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述疏水性蛋白是膜內(nèi)在蛋白(integralmembrane protein)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合物，其中所述膜內(nèi)在蛋白源自選自由以下各物質(zhì)組成群組的傳染媒介物細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)和朊病毒(prion)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述傳染媒介物是細(xì)菌。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物，其中所述膜內(nèi)在蛋白是孔蛋白。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物，其中所述膜內(nèi)在蛋白是淋球菌孔蛋白。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物，其中所述膜內(nèi)在蛋白是腦膜炎球菌孔蛋白。
13.一種對(duì)人類(lèi)進(jìn)行免疫的方法，所述方法包含非經(jīng)腸投與根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述傳染媒介物是人類(lèi)病原體。
14.一種用于制備適于投與哺乳動(dòng)物的醫(yī)藥學(xué)可接受載劑中的疏水性蛋白的引起較少疼痛的免疫原組合物的方法，所述方法包含以下步驟(a)用兩性離子去污劑溶解所述疏水性蛋白以制得第一組合物；(b)改變所述第一組合物，以使得與所述第一組合物相比，所述經(jīng)改變的組合物引起較少疼痛。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述改變步驟(b)是選自由以下操作組成的群組(i)稀釋所述兩性離子去污劑，(ii)用不引發(fā)疼痛的非離子去污劑替換所述兩性離子去污劑，和(iii)加入不引發(fā)疼痛的非離子去污劑但保持所述兩性離子去污劑的濃度恒定。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述改變步驟(b)是用不引發(fā)疼痛的非離子去污劑稀釋所述兩性離子去污劑。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述改變步驟(b)是用不引發(fā)疼痛的非離子去污劑替換所述兩性離子去污劑。
18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述改變步驟(b)是加入不引發(fā)疼痛的非離子去污劑但保持所述兩性離子去污劑的濃度恒定。
19.根據(jù)權(quán)利要求16、17或18中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述兩性離子去污劑是選自由以下各物質(zhì)組成的群組正辛基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸；正癸基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸；正十二基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸；正十四基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸；3-(N，N-正十六基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸；3-[(3-膽酰胺基丙基)二甲基銨基]-1-丙烷磺酸；3-[(3-膽酰胺基丙基)二甲基銨基]-2-羥基-1-丙烷磺酸；和正十二基-N，N-二甲基甘氨酸。
20.根據(jù)權(quán)利要求16、17或18中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述兩性離子去污劑是正十四基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸。
21.根據(jù)權(quán)利要求16、17或18中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述非離子去污劑是選自由以下各物質(zhì)組成的群組α-[4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基]-ω-羥基聚(氧基-1，2-乙烷二基)，聚氧乙烯(20)山梨聚糖單月桂酸酯，聚氧乙烯(20)山梨聚糖單油酸酯和聚氧乙烯(35)月桂基醚。
22.根據(jù)權(quán)利要求16、17或18中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述非離子去污劑是α-[4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基]-ω-羥基聚(氧基-1，2-乙烷二基)。
23.根據(jù)權(quán)利要求16、17或18中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述兩性離子去污劑是終濃度低于其CMC的正十四基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸且所述非離子去污劑是終濃度高于其CMC的α-[4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基]-ω-羥基聚(氧基-1，2-乙烷二基)。
24.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述改變步驟(b)是稀釋所述兩性離子去污劑，并且其中所述疏水性蛋白是沉淀形式。
25.根據(jù)權(quán)利要求16、17或18中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述疏水性蛋白是膜內(nèi)在蛋白，所述膜蛋白源自選自由以下各物質(zhì)組成群組的傳染媒介物細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)和朊病毒。
26.根據(jù)權(quán)利要求16、17或18中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述傳染媒介物是細(xì)菌。
27.根據(jù)權(quán)利要求16、17或18中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述膜內(nèi)在蛋白是孔蛋白。
28.根據(jù)權(quán)利要求16、17或18中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述兩性離子去污劑被稀釋至低于臨界膠束濃度。
29.根據(jù)權(quán)利要求16、17或18中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述膜內(nèi)在蛋白是淋球菌孔蛋白。
30.根據(jù)權(quán)利要求16、17或18中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述膜內(nèi)在蛋白是腦膜炎球菌孔蛋白。
31.根據(jù)權(quán)利要求16、17或18中任一權(quán)利要求所述的方法，其中如在大鼠足墊模型中所測(cè)量，所述疼痛減少至少約50％。
32.一種減少與向哺乳動(dòng)物投與包含疏水性蛋白和兩性離子去污劑的免疫原組合物相關(guān)疼痛的方法，所述方法包含(a)改變所述組合物，以使得與未經(jīng)改變組合物相比，所述經(jīng)改變的組合物引起較少疼痛；和(b)投與所述免疫原組合物。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述改變步驟(a)是選自由以下操作組成的群組(i)稀釋所述兩性離子去污劑，(ii)用不引發(fā)疼痛的非離子去污劑替換所述兩性離子去污劑，和(iii)加入不引發(fā)疼痛的非離子去污劑但保持所述兩性離子去污劑的濃度恒定。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述改變步驟(a)是用不引發(fā)疼痛的非離子去污劑稀釋所述兩性離子去污劑。
35.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述改變步驟(a)是用不引發(fā)疼痛的非離子去污劑替換所述兩性離子去污劑。
36.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述改變步驟(a)是加入不引發(fā)疼痛的非離子去污劑但保持所述兩性離子去污劑的濃度恒定。
37.根據(jù)權(quán)利要求34、35和36中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述兩性離子去污劑是選自由以下各物質(zhì)組成的群組正辛基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸；正癸基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸；正十二基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸；正十四基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸；3-(N，N-正十六基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸；3-[(3-膽酰胺基丙基)二甲基銨基]-1-丙烷磺酸；3-[(3-膽酰胺基丙基)二甲基銨基]-2-羥基-1-丙烷磺酸；和正十二基-N，N-二甲基甘氨酸。
38.根據(jù)權(quán)利要求34、35和36中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述兩性離子去污劑是正十四基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸。
39.根據(jù)權(quán)利要求34、35和36中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述非離子去污劑是選自由以下各物質(zhì)組成的群組α-[4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基]-ω-羥基聚(氧基-1，2-乙烷二基)，聚氧乙烯(20)山梨聚糖單月桂酸酯，聚氧乙烯(20)山梨聚糖單油酸酯和聚氧乙烯(35)月桂基醚。
40.根據(jù)權(quán)利要求34、35和36中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述非離子去污劑是α-[4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基]-ω-羥基聚(氧基-1，2-乙烷二基)。
41.根據(jù)權(quán)利要求34、35和36中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述兩性離子去污劑是終濃度低于其CMC的正十四基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸和所述非離子去污劑是終濃度高于其CMC的α-[4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基]-ω-羥基聚(氧基-1，2-乙烷二基)。
42.根據(jù)權(quán)利要求34、35和36中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述疏水性蛋白是膜內(nèi)在蛋白。
43.根據(jù)權(quán)利要求34、35和36中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述膜內(nèi)在蛋白源自選自由以下各物質(zhì)組成群組的傳染媒介物細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)和朊病毒。
44.根據(jù)權(quán)利要求34、35和36中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述傳染媒介物是細(xì)菌。
45.根據(jù)權(quán)利要求34、35和36中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述膜內(nèi)在蛋白是孔蛋白。
46.根據(jù)權(quán)利要求34、35和36中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述膜內(nèi)在蛋白是淋球菌孔蛋白。
47.根據(jù)權(quán)利要求34、35和36中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述膜內(nèi)在蛋白是腦膜炎球菌孔蛋白。
48.根據(jù)權(quán)利要求34、35和36中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述疏水性蛋白的溶解性是維持在所述非離子去污劑中。
49.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述改變步驟(a)是稀釋所述兩性離子去污劑，并且其中所述疏水性蛋白是沉淀形式。
50.根據(jù)權(quán)利要求34、35和36中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述疼痛是在大鼠足墊模型中測(cè)量。
51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中與未經(jīng)改變的組合物相比，所述經(jīng)改變的組合物如在大鼠足墊模型中測(cè)量產(chǎn)生至少約50％的疼痛減少。
52.一種減少與向哺乳動(dòng)物投與包含疏水性蛋白和兩性離子去污劑的免疫原組合物相關(guān)疼痛的方法，所述方法包含(a)改變所述組合物，以使得與未經(jīng)改變的組合物相比，所述經(jīng)改變的組合物如在大鼠足墊模型中測(cè)量產(chǎn)生疼痛減少，和(b)投與所述免疫原組合物，其中與未經(jīng)改變的組合物相比，所述經(jīng)改變的組合物產(chǎn)生如在大鼠足墊模型中所測(cè)量的至少約50％的疼痛減少。
53.根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中所述改變步驟(a)是選自由以下操作組成的群組(i)用不引發(fā)疼痛的非離子去污劑稀釋所述兩性離子去污劑，(ii)用不引發(fā)疼痛的非離子去污劑替換所述兩性離子去污劑，和(iii)加入不引發(fā)疼痛的非離子去污劑但保持所述兩性離子去污劑的濃度恒定。
54.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中所述改變步驟(a)是用不引發(fā)疼痛的非離子去污劑稀釋所述兩性離子去污劑。
55.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中所述改變步驟(a)是用不引發(fā)疼痛的非離子去污劑替換所述兩性離子去污劑。
56.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中所述改變步驟(a)是加入不引發(fā)疼痛的非離子去污劑但保持所述兩性離子去污劑的濃度恒定。
57.根據(jù)權(quán)利要求54、55和56中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述兩性離子去污劑是選自由以下各物質(zhì)組成的群組正辛基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸；正癸基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸；正十二基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸；正十四基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸；3-(N，N-正十六基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸；3-[(3-膽酰胺基丙基)二甲基銨基]-1-丙烷磺酸；3-[(3-膽酰胺基丙基)二甲基銨基]-2-羥基-1-丙烷磺酸；和正十二基-N，N-二甲基甘氨酸。
58.根據(jù)權(quán)利要求54、55和56中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述兩性離子去污劑是正十四基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸。
59.根據(jù)權(quán)利要求54、55和56中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述非離子去污劑是選自由以下各物質(zhì)組成的群組α-[4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基]-ω-羥基聚(氧基-1，2-乙烷二基)，聚氧乙烯(20)山梨聚糖單月桂酸酯，聚氧乙烯(20)山梨聚糖單油酸酯和聚氧乙烯(35)月桂基醚。
60.根據(jù)權(quán)利要求54、55和56中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述非離子去污劑是α-[4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基]-ω-羥基聚(氧基-1，2-乙烷二基)。
61.根據(jù)權(quán)利要求54、55和56中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述兩性離子去污劑是終濃度低于其CMC的正十四基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸和所述非離子去污劑是終濃度高于其CMC的α-[4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基]-ω-羥基聚(氧基-1，2-乙烷二基)。
62.根據(jù)權(quán)利要求54、55和56中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述疏水性蛋白是膜內(nèi)在蛋白。
63.根據(jù)權(quán)利要求54、55和56中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述膜內(nèi)在蛋白源自選自由以下各物質(zhì)組成群組的傳染媒介物細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)和朊病毒。
64.一種維持疏水性蛋白在免疫原組合物中溶解性的方法，所述方法包含在不引發(fā)疼痛的非離子去污劑中溶解疏水性蛋白，其中不引發(fā)疼痛的非離子去污劑是α-[4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基]-ω-羥基聚(氧基-1，2-乙烷二基)。
65.一種用于使用含有疏水性膜蛋白的組合物對(duì)人類(lèi)進(jìn)行免疫而不引發(fā)疼痛的方法，所述方法包含選擇Triton X-100作為醫(yī)藥學(xué)可接受去污劑以用于維持疏水性蛋白在最終調(diào)配物中的溶解性；其中Triton X-100的濃度高于CMC。
全文摘要
本發(fā)明提供一種制備引起較少疼痛的疏水性蛋白的免疫原組合物的方法，所述疏水性蛋白是在適于投與哺乳動(dòng)物的醫(yī)藥學(xué)可接受載劑中，所述方法包含以下步驟(a)用兩性離子去污劑溶解所述疏水性蛋白以制得第一組合物；(b)改變所述第一組合物，以使得與所述第一組合物相比，所述經(jīng)改變的組合物產(chǎn)生如在大鼠足墊模型中所測(cè)量到的疼痛減少。
文檔編號(hào)A61P43/00GK1901935SQ200480039228
公開(kāi)日2007年1月24日 申請(qǐng)日期2004年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月30日
發(fā)明者蘇珊·凱·霍塞思, 托馬斯·紐厄爾·梅特卡夫三世, 尤里·弗拉基米羅維奇·馬茨卡, 邁克爾·哈根 申請(qǐng)人:惠氏公司