專利名稱：siRNA表達(dá)系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及其于U1 snRNA基因調(diào)控區(qū)的重組siRNA載體。
RNA干擾是在進(jìn)化過程中高度保守的序列特異的轉(zhuǎn)錄后基因沉默過程。序列特異的信使RNA降解的中介物是21-23個核苷酸的小分子干擾RNAs(siRNAs)，其是由核糖核酸酶III從較長的dsRNAs切割產(chǎn)生的。該過程最初在秀麗線蟲(C.elegans)中有描述(Fire等，1998)，隨后報導(dǎo)于昆蟲、植物和真菌中，最近通過使用短雙鏈RNAs再現(xiàn)于哺乳動物細(xì)胞中(21-23個堿基對；Elbashir等，2001)。由于這種分子的效率非常高，siRNA雙螺旋可以用于人類和非人類細(xì)胞中的靶向基因失活，并且用于病毒性或遺傳性疾病的治療劑開發(fā)。
目前，已有數(shù)個小組報導(dǎo)了設(shè)計用于將siRNAs通過寡核苷酸轉(zhuǎn)染導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞的系統(tǒng)(Elbashir等，2001；McManus and Sharp，2002)。鑒于使用人造siRNAs的主要缺陷在于需要周期性給藥，顯然有需要產(chǎn)生編碼siRNAs的質(zhì)粒以獲得長期的效果。
迄今為止，所有的siRNA載體均依靠pol III依賴型啟動子，例如U6 snRNA(Lee等，2002；Paul等，2002)或H1-RNA(Brummelkamp等，2002)基因以及近期的tRNA表達(dá)盒(Kawasaki and Taira，2003)，專利申請WO03/0006477。本發(fā)明的發(fā)明人已開發(fā)了一種基于U1 snRNA基因的pol II依賴型調(diào)控區(qū)的新質(zhì)粒載體。該U1啟動子在所有的細(xì)胞類型中具有活性并且誘導(dǎo)高水平轉(zhuǎn)錄物的積聚。此外，存在負(fù)責(zé)U1 snRNA的正確3’端形成的3’元件，保證了有效和準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄物3’端形成。
本發(fā)明的構(gòu)建體具有以下優(yōu)點(diǎn)i)它們對5’和3’端形成沒有或僅有很小的序列需求；ii)前-siRNA快速地輸出到細(xì)胞質(zhì)中，在其中有效轉(zhuǎn)變成成熟形式；iii)通過雙鏈寡核苷酸的方式易于進(jìn)行克隆，如此避免了經(jīng)常會產(chǎn)生異常產(chǎn)物的PCR擴(kuò)增步驟；iv)U1 snRNA基因具有強(qiáng)pol II啟動子，其在穩(wěn)定的細(xì)胞克隆中不會經(jīng)受沉默。此外，本發(fā)明人已經(jīng)鑒定了使得可以選擇單一siRNA鏈作為干擾的應(yīng)答中介物的特定元件。
將針對核纖層蛋白A/C mRNA的發(fā)夾序列插入到這些調(diào)控區(qū)域之間，并且產(chǎn)生了正確大小的雙鏈siRNA在體內(nèi)的有效積聚。對提取自用siRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞的蛋白質(zhì)進(jìn)行Western印跡分析顯示作為本發(fā)明目的的這些載體能夠非常有效地抑制核纖層蛋白A/C蛋白質(zhì)的表達(dá)。也已經(jīng)鑒定了決定兩個雙鏈siRNA之一的不對稱釋放的序列。
因此，本發(fā)明的目的在于可使siRNA或miRNA在哺乳動物細(xì)胞中正確、穩(wěn)定和有效表達(dá)的重組載體，其從5’到3’包括a)來源于U1 snRNA基因的聚合酶II RNA依賴型啟動子序列；b)用于克隆轉(zhuǎn)錄前-siRNA或前-miRNA的序列的合適的限制性位點(diǎn)；c)轉(zhuǎn)錄前-siRNA的序列，其包括在位置+1的A或G殘基；對應(yīng)于由將被沉默的基因轉(zhuǎn)錄的mRNA有義區(qū)域的21到23個核苷酸的序列，其構(gòu)成前-siRNA莖干的第一個部分；從前-miRNA序列選擇的序列，其組成前-siRNA的環(huán)狀區(qū)域；對應(yīng)于由將被沉默的基因轉(zhuǎn)錄的mRNA反義區(qū)域的21到23個核苷酸的序列，其構(gòu)成前-siRNA莖干的第二個部分；兩個終末殘基UU，其突出的方式使得得到下列結(jié)構(gòu) 或備選地轉(zhuǎn)錄前-miRNA的序列；d)來源于U1 snRNA基因3’端序列的終止序列，其對于分別正確形成前-siRNA或前-miRNA的3’端是必須且足夠的。
優(yōu)選地，轉(zhuǎn)錄前-siRNA的序列5’端的克隆位點(diǎn)為Bgl II。
優(yōu)選地，轉(zhuǎn)錄前-siRNA的序列進(jìn)一步在5’末端和3’末端包括使得轉(zhuǎn)錄的前-siRNA具有下述結(jié)構(gòu)的序列 其中N為A、U、G或C，以及N’為其互補(bǔ)核苷酸。
更優(yōu)選地，轉(zhuǎn)錄前-siRNA的序列進(jìn)一步在5’末端和3’末端包括使得轉(zhuǎn)錄的前-siRNA具有下述結(jié)構(gòu)的序列
本發(fā)明的載體雖然比基于pol III的載體產(chǎn)生較低水平的siRNAs，但其可以方便有利地應(yīng)用。事實(shí)上，這些水平足以介導(dǎo)RNA干擾應(yīng)答，且沒有因高轉(zhuǎn)錄物水平導(dǎo)致的非特異性靶向而產(chǎn)生的副作用。因此當(dāng)由上述較低水平的siRNA獲得同樣的應(yīng)答時，治療應(yīng)用更加安全。
U1 snRNA基因啟動子由作為轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子的遠(yuǎn)側(cè)序列元件(DSE)和決定轉(zhuǎn)錄起始位置的近側(cè)序列元件(PSE)組成。PSE與+1核苷酸之間的距離是嚴(yán)格保守的，雖然其初級序列(primary sequence)并不保守。該啟動子結(jié)構(gòu)有助于修飾和轉(zhuǎn)化其為誘導(dǎo)型啟動子。
最近幾年，已經(jīng)估計1％的人類基因編碼一組20-25個核苷酸長的非編碼微RNA(microRNAs)(miRNAs)，其在植物和動物物種的基因表達(dá)調(diào)控中起重要作用(Bartel，2004)。它們的結(jié)構(gòu)和生物合成與siRNAs幾乎相同，雖然它們轉(zhuǎn)錄為更長的前體。本發(fā)明的載體也可以有效用于產(chǎn)生微RNA(microRNAs)。
用于人類基因治療的siRNA表達(dá)系統(tǒng)使用載體在體內(nèi)表達(dá)siRNAs作為針對所選疾病模型產(chǎn)生RNAi應(yīng)答的治療工具而具有強(qiáng)有力的應(yīng)用。
RNAi途徑可以用于擊倒(knocking down)基因表達(dá)，從而1)下調(diào)有害基因表達(dá)2)重新激活細(xì)胞防御，以及3)抑制病毒基因表達(dá)。
這使得能夠?qū)υS多急性和頑固持久性疾病，包括癌癥和其它遺傳機(jī)能障礙，以及嚴(yán)重感染進(jìn)行治療。
針對所選的靶RNAs制備的構(gòu)建體的效果可以如下進(jìn)行分析1)在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或在已建立的細(xì)胞系中。
2)在從特殊遺傳疾病的患者建立的原代細(xì)胞和/或動物模型中。
動物模型有助于在開始人體臨床試驗(yàn)前，檢驗(yàn)siRNA載體的優(yōu)化特異性、效力、穩(wěn)定性和遞送能力。
本發(fā)明下面將根據(jù)給出的實(shí)施例并參考下述附圖進(jìn)行描述

圖1.表示psiUX載體的概略圖；標(biāo)示了位于U1 snRNA啟動子下游的多接頭(polylinker)中的位點(diǎn)。下面顯示了從第-393位到第-6位(相對于起始位點(diǎn))延伸的U1啟動子區(qū)域的序列。
圖2.圖A)不同psiUx衍生物和相關(guān)寡核苷酸的序列。指示了轉(zhuǎn)錄物的5’端和3’端。從核纖層蛋白A/C mRNA推斷出有義和反義序列，并且用會聚的箭頭表示。在psiUcmut-lam構(gòu)建體中引入的突變標(biāo)示于序列上。U1基因的3’終止序列標(biāo)示為“3’框”。位于psiUb-lam和psiUd-lam構(gòu)建體中的內(nèi)環(huán)和變異序列用灰色顯示。圖B)四種測試的抗核纖層蛋白初級轉(zhuǎn)錄物的預(yù)測結(jié)構(gòu)。箭頭標(biāo)示推測的Dicer酶加工位點(diǎn)。siRNA序列用加粗斜體顯示。加下劃線的核苷酸表示來源于U1 snRNA的5’和3’區(qū)的序列。星號表示單甲基帽(monomethylcap)。
圖3.由psiUx-lam構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的siRNAs的表達(dá)和活性分析。用6μg不同的psiU-lam構(gòu)建體(psiU泳道)或6μg的U6-lam(U6泳道)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞。在所有的例子中用2μg的對照U7構(gòu)建體進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。48小時后，提取總RNA，取15μg在10％聚丙烯酰胺-尿素凝膠上進(jìn)行Northern印跡分析。圖A和A’)與識別反義鏈(左向箭頭)的a和amut探針雜交。圖A”)與特異于U7 snRNA的探針進(jìn)行雜交。方括號表示前體產(chǎn)物的位置。pBR322/Mspl分子大小標(biāo)記的遷移顯示于左邊。泳道NT含有從非轉(zhuǎn)染細(xì)胞中提取的RNA。圖B)與識別有義鏈(右向箭頭)的α探針雜交。圖c)轉(zhuǎn)染后70個小時從與先前實(shí)驗(yàn)相同的細(xì)胞中提取的20μg總細(xì)胞蛋白質(zhì)用抗核纖層蛋白單克隆抗體進(jìn)行Western印跡分析。箭頭指向核纖層蛋白的兩個同種型(A和C)。圖下方顯示濾膜的麗春紅染色。
圖4.分析psiUa-lam、psiUb-lam和U6-lam轉(zhuǎn)錄物在非洲爪蟾(Xenopuslaevis)卵母細(xì)胞中的表達(dá)。將2.76ng的質(zhì)粒DNA顯微注射到非洲爪蟾卵母細(xì)胞的細(xì)胞核中。培養(yǎng)12個小時后，從細(xì)胞核(N)和細(xì)胞質(zhì)(C)中提取RNA并且在10％聚丙烯酰胺-尿素凝膠上進(jìn)行Northern印跡分析。箭頭表示初級轉(zhuǎn)錄物。方括號標(biāo)示環(huán)內(nèi)切割的產(chǎn)物(見旁邊的圖解)。
材料和方法構(gòu)建psiUx載體。基于U1 snRNA基因的載體來源于含有整個人類基因的質(zhì)粒pHU1-ID(De Angelis等，2002)；該質(zhì)粒攜帶600bp的BamHI片段，其含有以與SP6啟動子反方向插入到pSP65載體(Promega)BamHI位點(diǎn)的人U1snRNA基因的轉(zhuǎn)錄單元。質(zhì)粒psiUx來源于后者，其通過用BglII和NheI雙消化和在存在含有5’-BglII、KpnI、XhoI、NheI、BamHI和NheI-3’位點(diǎn)的多接頭(polylinker)的條件下進(jìn)行重新連接而得到。U1 snRNA基因中的BglII位點(diǎn)作圖在相對于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)第-6位，而NheI位點(diǎn)在載體中SP6啟動子上游300個核苷酸。通過使兩條寡核苷酸退火制備接頭接頭上游(linkup)5’-GATCTGGTACCCTCGAGGCTAGCGGATCCG-3’接頭下游(linkdn)5’-CTAGCGGATCCGCTAGCCTCGAGGGTACCA-3’表達(dá)核纖層蛋白A/C蛋白的siRNAs的psiU衍生物的構(gòu)建。
核纖層蛋白A/C上所選的靶序列來源于Sui等(2002)并且覆蓋了NCBI數(shù)據(jù)庫中X03444第1602-1622位的核苷酸。使下列寡核苷酸a-lamUP5’GATCTCATACAGGGCAATTGGCAGATCAAGCGTTGTGAAGCCACAGATGAACGCTTGATCTGCCAATTGCCCTTTATCCCCTGACTTTCTGGAGTTTCAAAAGTAGAC 3’和a-lamDN5’TCGAGTCTACTTTTGAAACTCCAGAAAGTCAGGGGATAAAGGGCAATTGGCAGATCAAGCGTTCATCTGTGGCTTCACAACGCTTGATCTGCCAATTGCCCTGTATGA 3’退火，并插入到psiUx的BglII和XhoI位點(diǎn)，生成質(zhì)粒psiUa-lam。通過在psiUx的BglII和Xhol位點(diǎn)克隆下列寡核苷酸獲得質(zhì)粒psiUb-lam和psiUc-lampsiUb-lamb-lamUP5’GATCTCATACAGGGCAATTGGCAGATCAAGCGTTTGTGTAGCGCTTGATCTGCCAATTGCCCTTTATCCCCTGACTTTCTGGAGTTTCAAAAGTAGAC 3’和b-lamDN5’TCGAGTCTACTTTTGAAACTCCAGAAAGTCAGGGGATAAAGGGCAATTGGCAGATCAAGCGCTACACAAACGCTTGATCTGCCAATTGCCCTGTATGA 3’psiUc-lamc-lamUP
5’GATCTCGGGCAATTGGCAGATCAAGCGTTTGTGTAGCGCTTGATCTGCCAATTGCCCTTACTTTCTGGAGTTTCAAAAGTAGAC 3’和c-lamDN5’CTGAGTCTACTTTTGAAACTCCAGAAAGTAAGGGCAATTGGCAGATCAAGCGCTACACAAACGCTTGATCTGCCAATTGCCCGA 3’psiUd-lamd-lamUP5’GATCTCGGGCAATTGGCAGATCAAGCGTTTGACTTCGCATGAATGAGTTCATTCATGAAGCGAAACGCTTGATCTGCCAATTGCCCTTACTTTCTGGAGTTTCAAAAGTAGAG 3’和d-lamDN5’CTAGCTCTACTTTTGAAACTCCAGAAAGTAAGGGCAATTGGCAGATCAAGCGTTTCGCTTCATGAATGAACTCATTCATGCGAAGTCAAACGCTTGATCTGCCAATTGCCCGA3’。
通過克隆下列寡核苷酸獲得質(zhì)粒psiUcmut-lamcmut-lamUP5’GATCTCGGGCAATTGcgAGATCAAGCGTTTGTGTAGCGCTTGATCTcgCAATTGCCCTTACTTTCTGGAGTTTCAAAAGTAGAC 3’和cmut-lamDN5’CTGAGTCTACTTTTGAAACTCCAGAAAGTAAGGGCAATTGcgAGATCAAGCGCTACACAAACGCTTGATCTcgCAATTGCCCGA 3’(小寫字母表示相對于核纖層蛋白序列突變的核苷酸)。
細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染。根據(jù)廠商的說明使用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺(Lipofectamine)2000(Life Technologies，Gibco BRL)在60mm平皿中轉(zhuǎn)染亞融合的HeLa細(xì)胞。將6μg的psiUx質(zhì)粒衍生物與作為轉(zhuǎn)染內(nèi)對照的2μg質(zhì)粒U7-3’(DeAngelis等，2002)進(jìn)行共同轉(zhuǎn)染。
非洲爪蟾(Xenopus laevis)卵母細(xì)胞顯微注射。根據(jù)Caffarelli等(1987)，將9.2nl的質(zhì)粒DNA(300ng/μl)注射到IV階段非洲爪蟾卵母細(xì)胞的細(xì)胞核中。根據(jù)記載(Caffarelli等，1987)，在19℃培養(yǎng)12個小時后，手工分開細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，并提取RNA。
Northern印跡。根據(jù)廠商的說明使用Ultraspec RNA分離系統(tǒng)(BiotechLaboratories，Houston)從瞬時轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞中分離總RNA。為檢測siRNA，使15μg的總RNA在10％的聚丙烯酰胺-8M尿素凝膠中電泳，并通過電印跡轉(zhuǎn)移到Hybond-N+膜上(Amersham Pharmacia Biotech.)。于37℃在5×SSPE、5×Denhardt’s溶液、0，5％SDS、25μg/ml鮭精DNA(Invitrogen)中進(jìn)行雜交。于37℃在6×SSPE和2×SSPE以及0.2×SSPE中進(jìn)行洗滌。使用的探針為末端32P-放射性標(biāo)記的DNA寡核苷酸探針a5’-GGCAATTGGCAGATCAAGCG-3’；探針a-mut5’-GGCAATTGcgAGATCAAGCG-3’；α探針5’-CGCTTGATCTGCCAATTGCC-3’。
用探針U7a(DeAngelis等，2002)檢測U7-3’轉(zhuǎn)錄物。
免疫印跡。在10％的聚丙烯酰胺-SDS凝膠中分離蛋白提取物(20μg)，并轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜上(ProTran，Schleicher and Schuell)。膜用含3％脫脂奶的TBS封閉。小鼠單克隆抗核纖層蛋白A/C抗體(sc-7292，Santa CruzBiotechnology)在TBS/3％脫脂奶中1∶200稀釋，用作初級抗體。使用ECLWestern印跡檢測系統(tǒng)(Amersham UK)進(jìn)行免疫染色。
結(jié)果系統(tǒng)利用人U1 snRNA及其啟動子和終止區(qū)(Hernandez，1985，Hernandezand Weiner，1986)的特性。U1啟動子調(diào)控RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄，普遍有活性，并保證了高水平的表達(dá)。初級轉(zhuǎn)錄物具有單甲基化帽(monomethylated cap)，并且RNA高效輸出到細(xì)胞質(zhì)中。這對于有效加工前-siRNA是非常重要的，因?yàn)橐呀?jīng)顯示Dicer酶定位于細(xì)胞質(zhì)中(Billy等，2001)。此外，U1 snRNA的正確3’端形成是由位于U1 snRNA編碼區(qū)下游10個核苷酸處的框元件(GTTTCAAAAGTAGAC-3’框)指導(dǎo)的，其僅與特定的U1啟動子序列協(xié)同作用(Hernandez and Weiner 1986；de Vegvar等，1986)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)類似的序列還可指導(dǎo)U2 snRNA的正確3’端形成(Hernandez，1985)。在這方面已表明這些snRNAs必須通過不同于合成mRNAs的特殊轉(zhuǎn)錄機(jī)制進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。最近Medlin等人的工作(2003)顯示如果缺失pol II的CTD，將不會出現(xiàn)正確的終止，這表明3’端形成所需要的因子在轉(zhuǎn)錄過程中非常早就被恢復(fù)補(bǔ)充。含有U1 snRNA基因啟動子的區(qū)域從相對于起始位點(diǎn)位于第-400位的BamHI位點(diǎn)延伸到第-6位的BglII位點(diǎn)，通過使用合成的多接頭(polylinker)將其克隆到pSP65質(zhì)粒的BamHI/Nhel位點(diǎn)(圖1A)。獲得的構(gòu)建體(psiUx)具有強(qiáng)啟動子但缺乏轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和終止子。根據(jù)我們的設(shè)計，將通過插入的合成雙鏈片段，以及siRNA目標(biāo)序列而提供這些序列。起始序列為5’-GATCTC’A-3’，其中最后的殘基對應(yīng)于U1 snRNA的+1位核苷酸(在該位置G也可以接受)。終止元件為5’-CCCCTG’ACTTTCTGGAGTTTCAAAAGTAGAC-3’，其中加下劃線序列為所謂的3’框，位于轉(zhuǎn)錄物3’端下游10個核苷酸處。CCCCTG序列對應(yīng)于U1 snRNA最后6個轉(zhuǎn)錄的核苷酸，其顯示有助于高效和位點(diǎn)特異的3’端形成(Hernandez，1985)。可以通過插入具有與質(zhì)粒的選擇位點(diǎn)相適應(yīng)的末端的擴(kuò)增片段或退火的合成寡核苷酸而容易地將siRNA前體序列克隆到psiUx中。5’BglII末端是必須的，因其是為重建起始位點(diǎn)所需要的，任何包含在多接頭(polylinker)中的位點(diǎn)(Kpnl、Xhol、Nhel和BamHl)都能夠用于3’端(圖1)。
對于測試我們載體效率的目標(biāo)序列，我們選擇了證實(shí)對siRNAs敏感(Sui等，2002)的核纖層蛋白A/C mRNA中的位點(diǎn)。將發(fā)夾結(jié)構(gòu)(來源于核纖層蛋白A/C mRNA的21個核苷酸的有義和反義序列)以不同的方式克隆從而確定對有效的siRNA表達(dá)最適當(dāng)?shù)?psiU-lam構(gòu)建體)。獲得的構(gòu)建體的差別不僅在于插入環(huán)序列的類型，還在于轉(zhuǎn)錄區(qū)域的5’和3’端。不同插入片段的序列顯示于圖2A中，初級轉(zhuǎn)錄物的結(jié)構(gòu)圖解表示于圖B中。在psiUa-lam、psiUb-lam和psiUc-lam中使用的環(huán)是從微前-RNAs導(dǎo)出的(Zeng等，2002和Castanotto等，2002)，而在psiUd-lam中的是從酵母Rht1P核酸內(nèi)切酶-一種RNaseIII樣酶-的標(biāo)準(zhǔn)底物導(dǎo)出的(Chanfreau等，1998)。此外，構(gòu)建體psiUa-lam和psiUb-lam含有的末端區(qū)域包括3個核苷酸的莖干，其對應(yīng)于U1轉(zhuǎn)錄物5’和3’端的保守核苷酸。為了防止Dicer酶切割該區(qū)域，插入了兩個不匹配的堿基。這些延伸部分在psiUc-lam和psiUd-lam中不存在。在這些構(gòu)建體中，為了匹配核纖層蛋白靶序列，轉(zhuǎn)錄物的5’端包括一個G，并且保守的3’區(qū)域由CCCCTG轉(zhuǎn)變?yōu)镃CCTT。
通過在psiUc-lam中核纖層蛋白mRNA配對區(qū)域中心部分引入兩處兩個核苷酸的錯配得到對照構(gòu)建體(psiUcmut-lam)。由該構(gòu)建體產(chǎn)生的這個siRNA將不能夠介導(dǎo)干擾應(yīng)答。
為了比較這些載體系統(tǒng)與以前應(yīng)用的其它系統(tǒng)的活性，U6載體(質(zhì)粒U6-lam)中的抗核纖層蛋白A/C發(fā)夾序列如Sui等(2002)所述的進(jìn)行克隆。通過轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞測試不同構(gòu)建體的表達(dá)和活性。作為內(nèi)對照，共轉(zhuǎn)染經(jīng)修飾的U7 snRNA基因(DeAngelis等，2002)。在48小時，提取RNA并用Northern印跡進(jìn)行分析。
圖3中圖A和A’顯示用特異于有義反義鏈的探針(探針a)進(jìn)行的雜交。所有U1衍生的構(gòu)建體均產(chǎn)生了21到23個核苷酸的反義鏈的積聚。由于這些RNAs積聚于體內(nèi)超過了延長時間，表明它們以穩(wěn)定的復(fù)合物存在。在其它情況中將類似的發(fā)現(xiàn)解釋為對與干擾競爭復(fù)合體關(guān)聯(lián)的診斷。21-23個核苷酸大小的同樣類型的分子，在U6衍生的構(gòu)建體的情況下隨時間積聚(泳道U6)。在根據(jù)共轉(zhuǎn)染的U7 snRNA的雜交信號標(biāo)準(zhǔn)化后(圖A”)，U6和U1衍生的siRNAs水平之間的比較顯示psiU-lam構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄水平略低于U6-lam。然而，如圖3C中所示，它們介導(dǎo)了同樣水平的RNA干擾應(yīng)答。來源于psiUCmut-lam的siRNA僅在使用amut探針的時候可見，其與該突變完全互補(bǔ)(圖3A’)。
用反義探針(探針α，圖B)進(jìn)行的雜交顯示了一個有趣的特征即使將該凝膠長時間曝光，psiUa-lam和psiUb-lam構(gòu)建體也顯示沒有有義鏈的積聚(圖2B中的上方鏈)。相反，所有的其它構(gòu)建體都顯示產(chǎn)生了有義鏈，即使其水平低于反義鏈的水平(在圖A和B中前體與成熟體雜交信號進(jìn)行比較)。這些結(jié)果表明psiUa-lam和psiUb-lam構(gòu)建體的末端區(qū)域(圖2B)，而不是內(nèi)環(huán)，是賦予對干擾復(fù)合物中包括的鏈的非對稱選擇的元件。psiU(圖3A)和其它獨(dú)立產(chǎn)生的構(gòu)建體的表達(dá)分析表明可能可以除去U1 snRNA 3’端的大部分保守核苷酸，但仍然獲得有效的終止和加工。因此，克隆到psiUx載體中沒有序列約束，除了在第+1位存在A或G。
polIII和polII siRNA載體之間的有趣差別在于，在U1驅(qū)動的轉(zhuǎn)錄物中僅能檢測到少量的前體(表示為前-siRNA)。相反，在U6載體的情況下，有大量的這種物質(zhì)(圖3A)。
對于這種差異的可能解釋是U6驅(qū)動的轉(zhuǎn)錄物不能有效地輸出到細(xì)胞質(zhì)中。為了驗(yàn)證該假設(shè)，將U6-lam和psiUa-lam以及psiUb-lam質(zhì)粒顯微注射到非洲爪蟾卵母細(xì)胞的細(xì)胞核中，培養(yǎng)12個小時后，從細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)區(qū)室提取RNA。圖4顯示大部分U6驅(qū)動的轉(zhuǎn)錄物仍然留在細(xì)胞核中，而那里沒有發(fā)現(xiàn)U1驅(qū)動的產(chǎn)物的痕跡。在兩種情況中，只發(fā)現(xiàn)對前體分子預(yù)期大小的RNA轉(zhuǎn)錄物(前-siRNA)，以及如果在環(huán)區(qū)域內(nèi)的任意位置發(fā)生了斷裂而預(yù)期大小的更短的RNA產(chǎn)物。在非洲爪蟾系統(tǒng)中，只有在長時間過度曝光后可顯示很少量的21-23個核苷酸長的產(chǎn)物，表明Dicer樣活性，如果存在，其量非常低。這些數(shù)據(jù)顯示在U1啟動子作用下產(chǎn)生的前-siRNAs可以有效地輸出到細(xì)胞質(zhì)中。
用于分析siRNA產(chǎn)物的相同細(xì)胞也用于檢測RNAi的活性。通過抗核纖層蛋白A/C抗體的Western印跡分析從U1和U6衍生的構(gòu)建體瞬時轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中提取的20微克總蛋白。如圖3B所示，如果我們考慮到轉(zhuǎn)染的效率在80-85％的數(shù)量級(未顯示)，那么所有的siRNA載體均產(chǎn)生良好水平的干擾。核纖層蛋白的消耗水平在所有的U1構(gòu)建體中是相似的且類似于U6衍生的表達(dá)盒。
通過將在21個核苷酸長的配對區(qū)域的中心部分含有兩處錯配的構(gòu)建體(psiUcmut-lam)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞檢測干擾應(yīng)答的特異性。盡管該構(gòu)建體獲得的siRNAs的積聚水平類似于從親代構(gòu)建體所獲得的(圖3A’)，核纖層蛋白積聚水平(圖3B，泳道m(xù)ut)類似于對照(泳道NT)表明它們不介導(dǎo)干擾。
總而言之，這些數(shù)據(jù)表明基于U1的載體與其它的siRNA載體相比具有幾個有趣的特性i)它們在轉(zhuǎn)錄物的5’和3’末端的序列需求很小；ii)它們在轉(zhuǎn)錄區(qū)域接受U序列，這與pol III載體不同；iii)克隆很容易并且可以選擇不同的克隆位點(diǎn)；iv)初級轉(zhuǎn)錄物能夠有效地輸出到細(xì)胞質(zhì)并轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒煨问?。此外，可以將特殊序列插入?’和3’末端，如此可以選擇必須整合到干擾復(fù)合物中的單siRNA鏈。這對于siRNA載體是重要的特性，因?yàn)樗擞辛x鏈的積聚，其會導(dǎo)致不希望出現(xiàn)的靶向。
基于U1的可誘導(dǎo)表達(dá)載體U1 snRNA基因啟動子由作為轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子的遠(yuǎn)側(cè)序列元件(Distal SequenceElement)(DSE)和決定轉(zhuǎn)錄起始位置的近側(cè)序列元件(Pfoximal SequenceElement)(PSE)組成。PSE和第+1位核苷酸之間的距離是嚴(yán)格保守的，雖然其初級序列不保守。該啟動子結(jié)構(gòu)有助于修飾和轉(zhuǎn)化其為誘導(dǎo)型啟動子。
一個例子的代表是Cre-loxP策略(Hoess，R.H.，A.Wierzbicki，andK.Abremski，1986；Sauer，B.and N.Benderson，1988)。長填充DNA(含有選擇標(biāo)記的信息，即嘌呤霉素、新霉素或其它)側(cè)面與噬菌體P1的2個loxP位點(diǎn)連接，可將其插入到PSE和+1位置之間。這種插入阻止了siRNA的轉(zhuǎn)錄。通過添加Cre重組酶，兩個LoxP位點(diǎn)發(fā)生重組，導(dǎo)致填充DNA和其中一個loxP位點(diǎn)被除去。只要PSE和第+1位核苷酸之間的距離維持不變，一個loxP位點(diǎn)的存在不會干擾啟動子活性，而發(fā)生前-siRNA的轉(zhuǎn)錄。
微RNAs(microRNAs)的表達(dá)miRNA的功能與許多復(fù)雜的細(xì)胞回路有關(guān)，例如蠅蟲中細(xì)胞增殖、細(xì)胞死亡和脂肪代謝的調(diào)控，線蟲中的神經(jīng)元模式，哺乳動物中的造血系分化的調(diào)節(jié)，以及植物中葉和花發(fā)育的調(diào)控。最近，又提出了微RNAs(microRNAs)在腫瘤形成中的作用。主要來自蠕蟲和蠅蟲的研究表明微RNAs(microRNAs)在細(xì)胞中通過RNAi途徑進(jìn)行加工和賦予功能，并且通過與mRNA的3’非翻譯區(qū)域的堿基配對，導(dǎo)致其表達(dá)的明顯降低。
本工作中描述的基于U1的載體也可用于產(chǎn)生高水平的miRNAs。為了優(yōu)化miRNA表達(dá)，可以遵循下述兩種不同的策略1)pri-miRNA序列(該序列包括具有明確的二級結(jié)構(gòu)的大約80-110個核苷酸的區(qū)域，并且能夠從基因組數(shù)據(jù)中導(dǎo)出(Griffiths-Jones等，2003)被克隆到psiUx載體的啟動子和終止區(qū)之間；2)miRNA序列被克隆到psiU中作為反義siRNA序列。
總而言之，這些數(shù)據(jù)表明基于U1的載體與其它的siRNA載體相比具有幾介有趣的特性i)它們在轉(zhuǎn)錄物5’和3’末端的序列需求很小；ii)它們在轉(zhuǎn)錄區(qū)域接受U序列，這與pol III載體不同；iii)克隆很容易并且可以選擇不同的克隆位點(diǎn)；iv)初級轉(zhuǎn)錄物能夠有效地輸出到細(xì)胞質(zhì)并轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒煨问?；v)可以將特殊序列添加到5’和3’末端，這使得可以選擇兩條siRNA鏈中只有一條整合到干擾復(fù)合物中。這對于siRNA載體是重要特性，因?yàn)樗藭?dǎo)致不希望出現(xiàn)的靶向的有義鏈積聚。如果該表達(dá)系統(tǒng)被用于人類的臨床方案中，這是保證高水平安全性的非常重要的方面。
參考文獻(xiàn)Bartel D.P.Cell.2004，116(2)281-97.
Billy，E.，et al.Proc Natl Acad Sci USA 25，14428-33(2001).
Brummelkamp，T.R.，Bernard，R.& Agami，R.Science 296，550-553(2002).
Caffarelli，E.，et al.EMBO J.6，3493-8(1987).
Castanotto，D.，Li，H.Rossi，J.J.RNA，.8，1454-1460(2002).
Chanfreau，G.，Legrain，P.$ Jacquier，A.J.Mol.Biol.284，975-988(1998).
De Angelis，F(xiàn).G.，et al.Proc Natl Acad Sci USA.99，9456-9461(2002).
de Vegvar，H.E.，Lund，E.& Dahlberg，J.E.Cell 47，259-266(1986).
Elbashir，S.M.，et al.Nature 411，494-498(2001).
Fire，A.，et al.Nature 391，806-811(1998).
Griffiths-Jones S，et al.Nucleic Acids Res.2003 31(1)439-41.
Hernandez，N.EMBO J.7，1827-1837(1985).
Hernandez，N.& Weiner，A.M.Cell 47，249-258(1986).
Hoess，R.H.，A.Wierzbicki，and K.Abremski，.Nucleic Acids Res，1986.14(5)p.2287-300.
Kawasaki，H.& Taira，K.Nucleic Acids Res.31，700-707(2003).
Lee，N.S.，et al.Nat.Biotechnol.20，500-505(2002).
McManus，M.T.& Sharp，P.A.Nat Rev Genet.10，737-747(2002).
Medlin，J.E.，et al.EMBO J.22，925-934(2003).
Paul，C.P.，et al.Nat.Biotechnol.20，505-508(2002).
Sauer，B.and N.Henderson.ProcNatl Acad Sci USA，1988.85(14)p.5166-70Sui，G.et al.Proc Natl Acad Sci USA 99，5515-5520(2002).
Zeng，Y.，Wagner，E.J.& Cullen，B.R.Mol Cell.9，1327-1333(2002).
權(quán)利要求
1.用于在哺乳動物細(xì)胞中正確、穩(wěn)定并有效表達(dá)siRNA或miRNA的重組載體，其從5’到3’包括a)來源于U1 snRNA基因的RNA聚合酶II依賴型啟動子序列；b)用于克隆轉(zhuǎn)錄前-siRNA或前-miRNA的序列的合適的限制性位點(diǎn)；c)轉(zhuǎn)錄前-siRNA的序列，其包括在第+1位的A或G殘基；對應(yīng)于由將被沉默的基因轉(zhuǎn)錄的mRNA有義區(qū)域的21到23個核苷酸的序列，其構(gòu)成前-siRNA莖干的第一個部分；從前-miRNA序列選擇的序列，其構(gòu)成前-siRNA的環(huán)狀區(qū)域；對應(yīng)于由將被沉默的基因轉(zhuǎn)錄的mRNA反義區(qū)域的21到23個核苷酸的序列，其構(gòu)成前-siRNA莖干的第二個部分；兩個最后的殘基UU，其突出的方式使得得到下列結(jié)構(gòu) 或備選地為轉(zhuǎn)錄前-miRNA的序列；d)來源于U1 snRNA基因3’端序列的終止序列，其對于正確形成前-siRNA或前-miRNA的3’端是必須且足夠的。
2.權(quán)利要求1所述的載體，其中轉(zhuǎn)錄前-siRNA的序列5’端的克隆位點(diǎn)為Bgl II。
3.權(quán)利要求1所述的載體，其中轉(zhuǎn)錄前-siRNA的序列進(jìn)一步在5’末端和3’末端包括使得轉(zhuǎn)錄的前-siRNA具有下述結(jié)構(gòu)的序列 其中N為A、U、G或C，以及N’為其互補(bǔ)核苷酸。
4.權(quán)利要求3所述的載體，其中轉(zhuǎn)錄前-siRNA的序列在5’末端和3’末端含有使得轉(zhuǎn)錄的前-siRNA具有下述結(jié)構(gòu)的序列
5.權(quán)利要求4所述的載體，其中來源于U1 snRNA基因3’端序列的終止序列如下所示CCCCTG/ACTTTCTGGAGTTTCAAAAGTAGAC。
6.前述任一權(quán)利要求所述的載體，進(jìn)一步包括使RNA pol II啟動子可誘導(dǎo)的合適序列。
7.包括前述任一權(quán)利要求所述載體的用于基因治療的組合物。
8.權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的載體在治療應(yīng)用中的用途。
全文摘要
本發(fā)明人描述了可在哺乳動物細(xì)胞中正確、穩(wěn)定并有效表達(dá)siRNA的表達(dá)系統(tǒng)，其包括a)來源于U1 RNA基因的聚合酶II RNA－依賴型啟動子；該序列下游b)用于克隆轉(zhuǎn)錄前－siRNA的序列的合適的限制性位點(diǎn)；所述位點(diǎn)下游c)來源于U1 snRNA基因3’端序列的序列，其對于正確形成前siRNA的3’端是必須且足夠的。
文檔編號A61K31/713GK1820074SQ200480019454
公開日2006年8月16日 申請日期2004年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月9日
發(fā)明者I·博佐尼, M·A·登蒂, A·羅薩 申請人:羅馬“智慧”大學(xué)