專利名稱：和厚樸酚在制備抗腫瘤靶點(diǎn)藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬天然化合物的用途，涉及從植物提取的和厚樸酚的新用途，尤其涉及和厚樸酚在制備抗腫瘤多個(gè)特異性靶點(diǎn)藥物中的用途。
背景技術(shù)：
近年來，抗腫瘤藥物的研制已從過去的傳統(tǒng)的單純的細(xì)胞毒化療藥轉(zhuǎn)向靶向藥物。靶向藥物的最大優(yōu)點(diǎn)是比傳統(tǒng)化療藥毒性小和療效好。
腫瘤細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)是近年來被明確的抗腫瘤靶點(diǎn)，原因如下腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的HIF-1α有多種作用，使腫瘤細(xì)胞不易發(fā)生凋亡、在腫瘤細(xì)胞的多條細(xì)胞信號(hào)通路起重要作用導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生長旺盛，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，可導(dǎo)致腫瘤內(nèi)血管增生、等，臨床表現(xiàn)為預(yù)后差。
腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular endothelial growthfactor，VEGF)是當(dāng)前公認(rèn)的治療腫瘤的靶點(diǎn)。腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生VEGF是腫瘤血管生成的關(guān)鍵因子，阻斷腫瘤細(xì)胞的VEGF表達(dá)或功能都可有效地治療腫瘤。最近，美國的Genetech公司的產(chǎn)品Avastin已進(jìn)入臨床III期試驗(yàn)。Avastin為一個(gè)抗血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的單克隆抗體，若通過臨床III期，也將成為第一個(gè)抗腫瘤VEGF的靶點(diǎn)藥。
可誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)是另一治療腫瘤的靶點(diǎn)。細(xì)胞內(nèi)的一氧化氮(NO)主要由iNOS催化產(chǎn)生。NO在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的功能可概括為(1)激活多條腫瘤細(xì)胞生長相關(guān)的細(xì)胞通路，使腫瘤細(xì)胞惡性生長；(2)使腫瘤細(xì)胞抗凋亡；(3)刺激低氧誘導(dǎo)因子-1和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的合成；(4)促進(jìn)腫瘤向惡性程度進(jìn)化和轉(zhuǎn)移；(5)抑制機(jī)體的腫瘤免疫功能。
熱休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)與腫瘤細(xì)胞的生長密切相關(guān)，HSP70在腫瘤細(xì)胞中的高表達(dá)導(dǎo)致臨床腫瘤的治療和預(yù)后不佳。因此研發(fā)HSP70的靶向藥是當(dāng)前的一個(gè)方向。
化療是治療腫瘤的一種主要手段，然而腫瘤化療往往會(huì)因腫瘤的抗藥性而失敗。腫瘤化療失敗的原因之一是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生抗細(xì)胞凋亡的特性，如在腫瘤細(xì)胞內(nèi)抗凋亡因子如Bcl-xL表達(dá)增加，而促凋亡因子如Bid表達(dá)減小，使得腫瘤細(xì)胞內(nèi)的凋亡調(diào)控失去平衡。因此，當(dāng)前的抗腫瘤藥物的研究方向之一是通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞內(nèi)的凋亡來治療腫瘤。
和厚樸酚是從植物厚樸中提取的一種天然化合物。其化學(xué)結(jié)構(gòu)如下 和厚樸酚在對(duì)其抗血栓、抗焦慮等體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時(shí)，證明能被胃腸道吸收，并具有體內(nèi)滯留時(shí)間較長、沒有明顯毒副作用等特點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供和厚樸酚在制備抗腫瘤靶點(diǎn)藥物中的用途，該和厚樸酚英文名為honokiol，CAS number35354-74-6，分子量266.33，化學(xué)命名為3，5’-diallyl-4，2’-dihydroxybiphenyl，分子式為C18H18O2，對(duì)人體毒性小，本發(fā)明所述的腫瘤靶點(diǎn)是指低氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)，一氧化氮合成酶(iNOS)，熱休克蛋白質(zhì)70(HSP70)，調(diào)控細(xì)胞凋亡的因子如Bcl-2家族成員和天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(caspase)家族成員。
本發(fā)明所述的和厚樸酚與制劑允許的藥物賦形劑或載體制成的制劑形式主要包括液體制劑、顆粒劑、片劑、沖劑、膠丸、膠囊、滴丸劑或注射劑。
本發(fā)明的有益效果有(1)提出了和厚樸酚的新用途；(2)由于HIF-1，VEGF，iNOS，HSP70，Bcl-xL，Bid，caspase這些因子在腫瘤細(xì)胞生長、血管的生成、腫瘤轉(zhuǎn)移等方面起至關(guān)重要的作用，因此和厚樸酚具有腫瘤靶點(diǎn)藥的應(yīng)用前景；(3)和厚樸酚可引起腫瘤細(xì)胞凋亡，具有制備臨床抗腫瘤藥的應(yīng)用前景；(4)和厚樸酚毒性低，而目前所用的臨床抗腫瘤藥物對(duì)人體都有較大的毒性，因此可解決長期困繞抗腫瘤藥毒性大的問題；(5)本發(fā)明用體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明和厚樸酚可有效抑制腫瘤。


圖1A為和厚樸酚對(duì)人結(jié)腸上皮癌細(xì)胞系RKO細(xì)胞內(nèi)低氧誘導(dǎo)因子-1mRNA含量的影響。
圖1B為和厚樸酚對(duì)RKO細(xì)胞內(nèi)低氧誘導(dǎo)因子-1mRNA含量影響的直方圖。
圖2A為和厚樸酚對(duì)RKO細(xì)胞內(nèi)低氧誘導(dǎo)因子-1蛋白質(zhì)含量的影響。
圖2B為和厚樸酚對(duì)RKO細(xì)胞內(nèi)低氧誘導(dǎo)因子-1蛋白質(zhì)含量影響的直方圖。
圖3A為和厚樸酚對(duì)RKO細(xì)胞內(nèi)血管生長因子mRNA含量影響。
圖3B為和厚樸酚對(duì)RKO細(xì)胞內(nèi)血管生長因子mRNA含量影響的直方圖。
圖4為和厚樸酚對(duì)RKO細(xì)胞內(nèi)血管生長因子蛋白質(zhì)含量的影響。
圖5A為和厚樸酚對(duì)RKO細(xì)胞內(nèi)一氧化氮合成酶的蛋白質(zhì)含量的影響。
圖5B為和厚樸酚對(duì)RKO細(xì)胞內(nèi)一氧化氮合成酶的蛋白質(zhì)含量影響的直方圖。
圖6A為和厚樸酚對(duì)RKO細(xì)胞內(nèi)熱休克蛋白70的mRNA含量的影響。
圖6B為和厚樸酚對(duì)RKO細(xì)胞內(nèi)熱休克蛋白70的mRNA含量影響的直方圖。
圖7A為和厚樸酚對(duì)RKO細(xì)胞內(nèi)熱休克蛋白70的蛋白質(zhì)含量的影響。
圖7B為和厚樸酚對(duì)RKO細(xì)胞內(nèi)熱休克蛋白70的蛋白質(zhì)含量影響的直方圖。
圖8為和厚樸酚對(duì)RKO細(xì)胞內(nèi)Bcl-2和Bax的mRNA水平的影響。
圖9為和厚樸酚對(duì)RKO細(xì)胞內(nèi)Bcl-xL和Bid的mRNA水平的影響。
圖8為和厚樸酚對(duì)RKO細(xì)胞內(nèi)Bcl-2和Bax的蛋白質(zhì)水平的影響。
圖9為和厚樸酚對(duì)RKO細(xì)胞內(nèi)Bcl-xL和Bid的蛋白質(zhì)水平的影響。
圖12為和厚樸酚對(duì)RKO細(xì)胞內(nèi)caspase-3的表達(dá)的影響。
圖13為和厚樸酚對(duì)RKO細(xì)胞內(nèi)caspase-7的表達(dá)的影響。
圖14為和厚樸酚對(duì)RKO細(xì)胞內(nèi)caspase-9的表達(dá)的影響。
圖15為和厚樸酚作用于RKO細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)DNA呈梯帶的電泳圖。
圖16為和厚樸酚對(duì)荷人大腸癌RKO細(xì)胞異種移植物的Balb/C裸鼠的治療作用。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述。
實(shí)施例1和厚樸酚對(duì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)低氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)mRNA的抑制(1)實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞株大腸癌細(xì)胞株RKO來源于美國American Type CultureCollection(ATCC)公司。
試劑和厚樸酚，中國藥品與生物制品鑒定所；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promage，美國)，逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒，熱穩(wěn)定DNA合成酶(Taq酶上海生工)。
儀器培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)板，二氧化碳培養(yǎng)箱，PCR儀，F(xiàn)CM儀。
(2)實(shí)驗(yàn)方法細(xì)胞培養(yǎng)分組根據(jù)不同和厚樸酚濃度分為5組，分別以1、2、3、4、5表示。1組為對(duì)照；2組加氯化鈷(CoCl2)(150μM)；3組CoCl2(150μM)+和厚樸酚0.1μg/ml；4組CoCl2(150μM)+和厚樸酚0.5μg/ml；5組CoCl2(150μM)+和厚樸酚1μg/ml。
藥物誘導(dǎo)RKO細(xì)胞2×104每孔接種于24孔板，每組3個(gè)復(fù)孔；用含10％小牛血清的RPIM1640培養(yǎng)基稀釋和厚樸酚儲(chǔ)存液(5mg/ml)，充分混勻，配成所需濃度，并以此更換細(xì)胞培養(yǎng)液；藥物作用1小時(shí)后加入CoCl2(對(duì)照組除外)，使其終濃度為150μM，繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)。收集細(xì)胞，提取RNA或蛋白質(zhì)，做相應(yīng)的RT-PCR。
RT-PCR收集細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，冰生理鹽水洗3次后用RNA提取試劑Trizol(每孔400ul)提取細(xì)胞RNA(按Trizol試劑說明進(jìn)行)。RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒方案進(jìn)行，引物為寡核苷酸脫氧胸腺嘧啶(Oligo dT)。PCR的引物如下(引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成)引物 上游引物(5’-3’) 下游引物(5’-3’)PCR產(chǎn)物(bp)HIF-1αCCAGTTACGTTCCTTCGATCAGCTTTTCCTGCTCTGTTTGGTGA 143PCR的反應(yīng)體系按照PCR試劑盒方案進(jìn)行。
PCR條件如下HIF-194℃5分鐘→35循環(huán){94℃30秒→54℃30秒→72℃30秒}→72℃5分鐘。
PCR產(chǎn)物電泳用1×TAE三羥甲基氨基甲烷(tris)-冰醋酸-二乙胺四乙酸(EDTA)電泳緩沖液配制1.5％瓊脂糖凝膠，加0.1％溴化乙啶(EB)按說明制成水平DNA電泳膠塊。加2×上樣緩沖液，加樣于加樣孔，100V恒壓電泳約20分鐘。紫外成像儀上攝像。
(3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果參見圖1A和圖1B，圖1A用RT-PCR法檢測(cè)，細(xì)胞在化學(xué)低氧環(huán)境下用不同濃度和厚樸酚處理4小時(shí)?？梢婋S著和厚樸酚濃度增加，HIF-1 mRNA含量減小，圖中泳道1常氧對(duì)照；泳道2CoCl2；泳道3CoCl2+0.1μg/ml和厚樸酚；泳道4CoCl2+0.5μg/ml和厚樸酚；泳道5CoCl2+1.0μg/ml和厚樸酚；β-actin為內(nèi)對(duì)照。圖1B各組HIF-1αRT-PCR產(chǎn)物的條帶灰度值分別除去相應(yīng)β-actin條帶的影響因子，圖中組別1-5分別代表常氧對(duì)照、CoCl2低氧對(duì)照、CoCl2+0.1μg/ml和厚樸酚、CoCl2+0.5μg/ml和厚樸酚和CoCl2+1.0μg/ml和厚樸酚。CoCl2(150μM)誘導(dǎo)3hrs對(duì)RKO細(xì)胞HIF-1αmRNA表達(dá)有微弱的上調(diào)。和厚樸酚濃度依賴性下調(diào)RKO細(xì)胞HIF-1αmRNA表達(dá)，0.1、0.5和1μg/ml三個(gè)濃度分別比CoCl2對(duì)照組下調(diào)7.6％、15.9％和46.7％，說明和厚樸酚0.1-1μg/ml之間濃度時(shí)抑制HIF-1α基因轉(zhuǎn)錄。
實(shí)施例2和厚樸酚對(duì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)低氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)蛋白質(zhì)的抑制實(shí)施例1表明和厚樸酚可抑制HIF-1的基因轉(zhuǎn)錄，但并沒有證明和厚樸酚可使腫瘤細(xì)胞中的HIF-1蛋白質(zhì)含量也下降。該實(shí)施例證明和厚樸酚有此作用。
(1)實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞株大腸癌細(xì)胞株RKO來源于美國ATCC公司。
試劑和厚樸酚，中國藥品與生物制品鑒定所；聚偏氟乙烯膜(PVDF)膜(Bio-Rad公司)，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠抗體(KPL，美國)，鼠抗人HIF-1α(NeoMarkers，美國)，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)ECL反應(yīng)液(SantaCruz公司)，蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(DC Protein Assay Kit，Bio-Rad公司)，免疫組織化學(xué)試劑盒(福州邁新公司)。
儀器培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)板，二氧化碳培養(yǎng)箱，電泳儀，電轉(zhuǎn)膜儀。
(2)實(shí)驗(yàn)方法細(xì)胞培養(yǎng)分組根據(jù)不同和厚樸酚濃度分為5組，分別以1、2、3、4、5表示。1組為對(duì)照；2組加CoCl2(150μM)；3組CoCl2(150μM)+和厚樸酚0.1μg/ml；4組CoCl2(150μM)+和厚樸酚0.5μg/ml；5組CoCl2(150μM)+和厚樸酚1μg/ml。
藥物誘導(dǎo)RKO細(xì)胞2×104每孔接種于24孔板，每組3個(gè)復(fù)孔；用含3％小牛血清的RPIM1640培養(yǎng)基稀釋和厚樸酚儲(chǔ)存液(5mg/ml)，充分混勻，配成所需濃度，并以此更換細(xì)胞培養(yǎng)液；藥物作用1小時(shí)后加入CoCl2(對(duì)照組除外)，使其終濃度為150μM，繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)。收集細(xì)胞，提取RNA或蛋白質(zhì)，做西部印跡法(Western Blot)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的HIF-1蛋白質(zhì)含量。
Western blot收集培養(yǎng)細(xì)胞，用生理鹽水洗兩次，細(xì)胞沉淀加入1×蛋白提取緩沖液(protein extract buffer)，吹散，沸水中煮15min，13000轉(zhuǎn)速(rpm)離心20分鐘，取上清測(cè)定蛋白質(zhì)濃度(按DC Protein Assay Kit說明書進(jìn)行)。取蛋白提取物50μg，加入等量的2×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸5分鐘，做SDS-PAGE電泳，積層膠恒壓50V，分離膠恒壓100V，電泳至溴酚藍(lán)染料到達(dá)凝膠最前沿，停止電泳。
轉(zhuǎn)膜電泳結(jié)束后揭膠，并將凝膠浸于適量的轉(zhuǎn)膜緩沖液(Transferbuffer)中，平衡30分鐘。同時(shí)截取適當(dāng)大小的PVDF膜和2張3M濾紙，將PVDF膜先在無水甲醇中浸濕，然后同濾紙-同浸于轉(zhuǎn)膜緩沖液中，平衡10～15分鐘，膜放陽極、膠放陰極，兩面各墊2張3M濾紙，恒流110mA，4℃層析柜中轉(zhuǎn)膜過夜。
封閉將轉(zhuǎn)有蛋白的膜浸于含10％脫脂奶粉的緩沖液(TBST)中封閉1hr。雜交取出已封閉的膜，然后浸于1∶400-500稀釋的鼠抗人HIF-1(用含5％脫脂奶粉的TBST、pH7.4配制)中，4℃過夜，TBST漂洗5min×5次，再浸于1∶10000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體(用含5％脫脂奶粉的TBST、pH7.4配制)中，TBST漂洗5分鐘×5次。
壓片、洗片取出膜，配制顯色液(ECL A液0.7ml+ECL B液0.7ml)，加在膜上，5分鐘后吸去多余液體，保鮮膜封膜，固定在暗盒內(nèi)，壓片，洗片。
(3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果參見圖2A和圖2B，圖2A細(xì)胞在化學(xué)低氧環(huán)境下用不同濃度和厚樸酚處理4小時(shí)。用Western Blot方法檢測(cè)，可見隨著和厚樸酚濃度增加，HIF-1蛋白質(zhì)含量A表達(dá)減小，泳道1常氧對(duì)照；泳道2CoCl2；泳道3CoCl2+0.1μg/ml和厚樸酚；泳道4CoCl2+0.5μg/ml和厚樸酚；泳道5CoCl2+1.0μg/ml和厚樸酚。β-actin為內(nèi)對(duì)照。圖2B各組HIF-1α蛋白條帶的灰度值分別去除相應(yīng)β-actin條帶的影響因子。圖中組別1-5分別代表常氧對(duì)照、CoCl2低氧對(duì)照、CoCl2+0.1μg/ml和厚樸酚、CoCl2+0.5μg/ml和厚樸酚和CoCl2+1.0μg/ml和厚樸酚。RKO細(xì)胞基礎(chǔ)水平HIF-1α蛋白表達(dá)較低，不易檢測(cè)到。CoCl2150μM誘導(dǎo)3小時(shí)顯著上調(diào)RKO細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)。和厚樸酚濃度依賴性下調(diào)CoCl2(150μM)所致的RKO細(xì)胞HIF-1α蛋白積聚(參見圖2A)。把western blot結(jié)果用圖像軟件(Scion Image)換算成灰度值，并作直方圖(參見圖2B)，可以看出，CoCl2(150μM)誘導(dǎo)的HIF-1α蛋白積聚比1組(空白對(duì)照組)增加約13倍。和厚樸酚0.1μg/ml濃度時(shí)，對(duì)CoCl2所致的HIF-1α蛋白積聚沒有明顯影響，而0.5和1μg/ml濃度時(shí)，梯度抑制CoCl2所致的HIF-1α蛋白上調(diào)，與2組(CoCl2對(duì)照組)相比分別下調(diào)28％和63.9％。和厚樸酚三個(gè)濃度對(duì)RKO細(xì)胞HIF-1mRNA及蛋白水平的影響趨勢(shì)基本一致。此結(jié)果說明和厚樸酚可使細(xì)胞內(nèi)的HIF-1α蛋白質(zhì)含量下降。
實(shí)施例3和厚樸酚對(duì)RKO細(xì)胞血管生長因子(VEGF)mRNA表達(dá)的影響(1)實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞大腸癌細(xì)胞株RKO來源于美國ATCC公司。
試劑逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒為美國Promega公司產(chǎn)品。和厚樸酚，中國藥品與生物制品鑒定所。
儀器PCR儀。
(2)實(shí)驗(yàn)方法藥物誘導(dǎo)RKO細(xì)胞2×105接種于6孔板，用含10％小牛血清的RPIM1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)24小時(shí)，使貼壁；用含3％小牛血清的RPIM1640培養(yǎng)基稀釋和厚樸酚儲(chǔ)存液(5mg/ml)，充分混勻，配成所需濃度，并以此更換細(xì)胞培養(yǎng)液；藥物作用1小時(shí)后加入CoCl2(對(duì)照組除外)，使其終濃度為150μM，培養(yǎng)4小時(shí)后更換培養(yǎng)液，以除去CoCl2，繼續(xù)用不同濃度的和厚樸酚作用3小時(shí)。收集細(xì)胞，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，做PCR檢測(cè)VEGF的豐度。PCR引物如下(引物由上海生工生物有限工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成)引物 上游引物(5’-3’)下游引物(5’-3’) 產(chǎn)物(bp)VEGF-A GCAGAATCATCACGAAGTGG GCATGGTGATGTTGGACTCC 212反應(yīng)條件如下VEGF-A95℃5分鐘→35循環(huán){95℃30秒，56℃30秒，72℃1分鐘}→72℃7分鐘。
PCR產(chǎn)物電泳用1×TAE電泳緩沖液配制1.5％瓊脂糖凝膠，加0.1％EB按說明制成水平DNA電泳膠塊。加2×上樣緩沖液，加樣于加樣孔，100V恒壓電泳約20分鐘。紫外成像儀上攝像。
(3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同濃度和厚樸酚作用于常氧或CoCl2(150μM)模擬低氧組RKO細(xì)胞4hrs，取總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，作PCR分析。參見圖3A和圖3B，圖3A細(xì)胞在化學(xué)低氧環(huán)境下用不同濃度和厚樸酚處理4小時(shí)，用RT-PCR方法檢測(cè)，可見隨著和厚樸酚濃度增加，VEGF的mRNA含量減小。泳道1常氧對(duì)照；泳道2CoCl2；泳道3CoCl2+0.1μg/ml和厚樸酚；泳道4CoCl2+0.5μg/ml和厚樸酚；泳道5CoCl2+1.0μg/ml和厚樸酚，β-actin為內(nèi)對(duì)照。圖3B各組VEGFRT-PCR產(chǎn)物的條帶分別除去其相應(yīng)β-actin條帶的影響因子，其中組別1-5分別代表常氧對(duì)照、CoCl2低氧對(duì)照、CoCl2+0.1μg/ml和厚樸酚、CoCl2+0.5μg/ml和厚樸酚和CoCl2+1.0μg/ml和厚樸酚。CoCl2(150μM)顯著上調(diào)RKO細(xì)胞VEGF mRNA表達(dá)，PCR產(chǎn)物條帶的灰度值是對(duì)照組的1.7倍。和厚樸酚0.1-1μg/ml濃度時(shí)，劑量依賴性下調(diào)模擬低氧引起的VEGF mRNA表達(dá)上調(diào)。1μg/ml濃度時(shí)灰度值比低氧對(duì)照組下調(diào)44％，具有顯著差異，說明和厚樸酚抑制VEGF的表達(dá)。
實(shí)施例4和厚樸酚對(duì)RKO細(xì)胞VEGF蛋白質(zhì)表達(dá)的影響實(shí)施例3證明和厚樸酚處理腫瘤細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)VEGF mRNA水平下降，但不表明細(xì)胞內(nèi)VEGF的蛋白質(zhì)水平下降。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)VEGF蛋白質(zhì)的水平是必需的。
(1)實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞大腸癌細(xì)胞株RKO來源于美國ATCC公司。
試劑鼠抗人VEGF和免疫熒光試劑盒為福州邁新公司產(chǎn)品。和厚樸酚，中國藥品與生物制品鑒定所。
儀器德國蔡氏熒光顯微鏡。
(2)實(shí)驗(yàn)方法藥物誘導(dǎo)RKO細(xì)胞2×105接種于6孔板，用含10％小牛血清的RPIM1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)24小時(shí)，使貼壁；用含3％小牛血清的RPIM1640培養(yǎng)基稀釋和厚樸酚儲(chǔ)存液(5mg/ml)，充分混勻，配成所需濃度，并以此更換細(xì)胞培養(yǎng)液；藥物作用1小時(shí)后加入CoCl2(對(duì)照組除外)，使其終濃度為150μM，培養(yǎng)4小時(shí)后更換培養(yǎng)液，以除去CoCl2，繼續(xù)用不同濃度的和厚樸酚作用3小時(shí)。收集細(xì)胞，用鼠抗人VEGF與細(xì)胞溫育，再用熒光素FITC標(biāo)記兔抗鼠IgG標(biāo)記細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。熒光越強(qiáng)表示VEGF含量越高。
(3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果RKO細(xì)胞經(jīng)150μMCoCl2作用4小時(shí)，并用不同濃度和厚樸酚處理8小時(shí)，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)高分子量VEGF(34-50kDa)的表達(dá)量。34-50kDa蛋白是細(xì)胞內(nèi)非分泌形式的VEGF，當(dāng)被剪接成189kDa、165kDa、121kDa等活性分子后，即被分泌出細(xì)胞，產(chǎn)生血管內(nèi)皮生長因子的生理作用。我們用FITC熒光標(biāo)記的二抗結(jié)合經(jīng)VEGF-抗作用的細(xì)胞涂片，在熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)150μMCoCl2作用后的RKO細(xì)胞高分子量VEGF陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加，熒光主要分布在細(xì)胞質(zhì)，不同濃度和厚樸酚(0.1-1μg/ml)作用8小時(shí)明顯減少模擬低氧引起的陽性細(xì)胞增加。每組隨機(jī)取150個(gè)細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果參見圖4，細(xì)胞在化學(xué)低氧環(huán)境下用不同濃度和厚樸酚處理8小時(shí)，用熒光免疫組織化學(xué)法檢測(cè)RKO細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度，熒光值反映VEGF的表達(dá)量，可見隨著和厚樸酚濃度增加，高分子量VEGF的蛋白表達(dá)量減少，組別1-5分別代表常氧對(duì)照、CoCl2低氧對(duì)照、CoCl2+0.1μg/ml和厚樸酚、CoCl2+0.5μg/ml和厚樸酚和CoCl2+1.0μg/ml和厚樸酚，“**”表示與常氧對(duì)照組相比P＜0.01；“#”表示與低氧對(duì)照組相比P＜0.05；“##”表示與低氧對(duì)照組相比P＜0.01。
CoCl2(150μM)作用4小時(shí)明顯上調(diào)RKO細(xì)胞內(nèi)VEGF蛋白表達(dá)，其熒光值比對(duì)照組增加5.6倍，T檢驗(yàn)兩組間差異非常顯著(P＜0.01)。和厚樸酚0.1-1μg/ml均表現(xiàn)為下調(diào)CoCl2引起的VEGF表達(dá)增加，其中H0.1組比單獨(dú)低氧組減少29.5％(P＜0.01)，H0.5組和H1組分別減少76.4％和80％，與單獨(dú)低氧組相比均有顯著差異(P＜0.05)。該實(shí)驗(yàn)證明，和厚樸酚處理腫瘤細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)VEGF蛋白質(zhì)含量下降。
實(shí)施例5和厚樸酚對(duì)誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)的影響(1)實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞細(xì)胞RKO細(xì)胞來源于美國ATCC公司。
試劑和厚樸酚，中國藥品與生物制品鑒定所；鼠抗人iNOS(NeoMarkers，美國)，HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體(Santa Cruz，美國)。化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)ECL反應(yīng)液(Santa Cruz，美國)儀器電泳儀，電轉(zhuǎn)膜儀(2)實(shí)驗(yàn)方法藥物誘導(dǎo)RKO細(xì)胞2×104每孔接種于24孔板，每組3個(gè)復(fù)孔；用含3％小牛血清的RPIM1640培養(yǎng)基稀釋和厚樸酚儲(chǔ)存液(5mg/ml)，充分混勻，配成所需濃度，并以此更換細(xì)胞培養(yǎng)液；藥物作用1小時(shí)后加入CoCl2(對(duì)照組除外)，使其終濃度為150μM，繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)。收集細(xì)胞，提取RNA或蛋白質(zhì)，做Western Blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的HIF-1蛋白質(zhì)含量。
Western blot收集培養(yǎng)細(xì)胞，用生理鹽水洗兩次，細(xì)胞沉淀加入1×蛋白提取緩沖液，吹散，沸水中煮15分鐘，13000轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)離心20分鐘，取上清測(cè)定蛋白質(zhì)濃度(按DC Protein Assay Kit說明書進(jìn)行)。取蛋白提取物50μg，加入等量的2×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸5分鐘，做SDS-PAGE電泳，積層膠恒壓50V，分離膠恒壓100V，電泳至溴酚藍(lán)染料到達(dá)凝膠最前沿，停止電泳。
轉(zhuǎn)膜電泳結(jié)束后揭膠，并將凝膠浸于適量的轉(zhuǎn)膜緩沖液中，平衡30分鐘。同時(shí)截取適當(dāng)大小的PVDF膜和2張3M濾紙，將PVDF膜先在無水甲醇中浸濕，然后同濾紙一同浸于轉(zhuǎn)膜緩沖液中，平衡10～15分鐘，膜放陽極、膠放陰極，兩面各墊2張3M濾紙，恒流110mA，4℃層析柜中轉(zhuǎn)膜過夜。
封閉將轉(zhuǎn)有蛋白的膜浸于含10％脫脂奶粉的TBST中封閉1小時(shí)。雜交取出已封閉的膜，然后浸于1∶400-500稀釋的鼠抗人iNOS(用含5％脫脂奶粉的TBST、pH7.4配制)中，4℃過夜，TBST漂洗5分鐘×5次，再浸于1∶10000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體(用含5％脫脂奶粉的TBST、pH7.4配制)中，TBST漂洗5分鐘×5次。壓片、洗片取出膜，配制顯色液(ECLA液0.7ml+ECL B液0.7ml)，加在膜上，5分鐘后吸去多余液體，保鮮膜封膜，固定在暗盒內(nèi)，壓片，洗片。
(3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果參見圖5A和圖5B，圖5A細(xì)胞在化學(xué)低氧環(huán)境下用不同濃度和厚樸酚處理4小時(shí)，用Western Blot法檢測(cè)，可見隨著和厚樸酚濃度增加，iNOS蛋白含量減小，β-actin為內(nèi)對(duì)照。圖5B各組iNOS蛋白條帶分別除去其相應(yīng)β-actin條帶的影響因子，圖中組別分別代表常氧(N)和低氧(H)時(shí)不同和厚樸酚(0-1μg/ml)作用濃度。每組取50μg蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)，RKO細(xì)胞基礎(chǔ)水平iNOS蛋白表達(dá)豐度較高。CoCl2(150μM)模擬低氧時(shí)，輕度上調(diào)RKO細(xì)胞iNOS蛋白表達(dá)，其Western blot條帶的灰度值與常氧對(duì)照組相比增強(qiáng)了21.4％。常氧組和厚樸酚1μg/ml濃度時(shí)顯著下調(diào)iNOS。比較常氧組與低氧組Western blot條帶的灰度值，發(fā)現(xiàn)相同劑量和厚樸酚對(duì)RKO細(xì)胞iNOS蛋白表達(dá)的影響與環(huán)境氧含量無明顯相關(guān)，說明和厚樸酚對(duì)RKO細(xì)胞iNOS蛋白的調(diào)節(jié)不受氧分壓影響。
該實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明和厚樸酚可抑制iNOS的表達(dá)。
實(shí)施例6和厚樸酚對(duì)RKO細(xì)胞HSP70mRNA的影響。
(1)實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞RKO細(xì)胞來源于美國ATCC公司。
試劑和厚樸酚，中國藥品與生物制品鑒定所；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒為美國Promega公司產(chǎn)品。
儀器PCR儀。
(2)實(shí)驗(yàn)方法藥物誘導(dǎo)RKO細(xì)胞2×105接種于6孔板，用含10％小牛血清的RPIM1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)24小時(shí)，使貼壁；用含3％小牛血清的RPIM1640培養(yǎng)基稀釋和厚樸酚儲(chǔ)存液(5mg/ml)，充分混勻，配成所需濃度，并以此更換細(xì)胞培養(yǎng)液；藥物作用1小時(shí)后加入CoCl2(對(duì)照組除外)，使其終濃度為150μM，培養(yǎng)4小時(shí)后更換培養(yǎng)液，以除去CoCl2，繼續(xù)用不同濃度的和厚樸酚作用3小時(shí)。收集細(xì)胞，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，做PCR檢測(cè)HSP70的豐度。PCR引物如下(引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成)引物上游引物(5’-3’)下游引物(5’-3’) 產(chǎn)物(bp)HSP70 CAAGATCAGCGAGGCTGACAAG AACTGTACACAGGGTGGCAGTG500反應(yīng)條件如下HSP7095℃5分鐘→35個(gè)循環(huán){95℃30秒，56℃30秒，72℃1分鐘}→72℃7分鐘PCR產(chǎn)物電泳用1×TAE電泳緩沖液配制1.5％瓊脂糖凝膠，加0.1％EB按說明制成水平DNA電泳膠塊。加2×上樣緩沖液，加樣于加樣孔，100V恒壓電泳約20分鐘。紫外成像儀上攝像。
(3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果參見圖6A和圖6B，圖6A細(xì)胞在化學(xué)低氧環(huán)境下用不同濃度和厚樸酚處理4小時(shí)，用RT-PCR法檢測(cè)，可見隨著和厚樸酚濃度增加，HSP70 mRNA含量減小，泳道1常氧對(duì)照；泳道2CoCl2；泳道3CoCl2+0.1μg/ml和厚樸酚；泳道4CoCl2+0.5μg/ml和厚樸酚；泳道5CoCl2+1.0μg/ml和厚樸酚。β-actin為內(nèi)對(duì)照。圖6B各組HSP70RT-PCR產(chǎn)物條帶分別除去其相應(yīng)β-actin條帶的影響因子，圖中組別1-5分別代表常氧對(duì)照、CoCl2低氧對(duì)照、CoCl2+0.1μg/ml和厚樸酚、CoCl2+0.5μg/ml和厚樸酚、CoCl2+1.0μg/ml和厚樸酚。CoCl2(150μM)上調(diào)RKO細(xì)胞HSP70mRNA表達(dá)，其PCR產(chǎn)物條帶的灰度值比對(duì)照組上調(diào)224％。和厚樸酚濃度依賴性下調(diào)化學(xué)低氧所致的RKO細(xì)胞HSP70mRNA上調(diào)，PCR產(chǎn)物條帶的灰度值與CoCl2單獨(dú)作用組相比分別減少了73.1％、76.5％和87.8％。這個(gè)結(jié)果說明和厚樸酚可抑制HSP70的表達(dá)。
實(shí)施例7和厚樸酚對(duì)RKO細(xì)胞HSP70蛋白質(zhì)的影響。
(1)實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞RKO細(xì)胞來源于美國ATCC公司。
試劑和厚樸酚，中國藥品與生物制品鑒定所；鼠抗人HSP70(NeoMarkers，美國)，HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體(Santa Cruz，美國)。化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)ECL反應(yīng)液(Santa Cruz，美國)儀器電泳儀，電轉(zhuǎn)膜儀。
(2)實(shí)驗(yàn)方法藥物誘導(dǎo)RKO細(xì)胞2×104每孔接種于24孔板，每組3個(gè)復(fù)孔；用含3％小牛血清的RPIM1640培養(yǎng)基稀釋和厚樸酚儲(chǔ)存液(5mg/ml)，充分混勻，配成所需濃度，并以此更換細(xì)胞培養(yǎng)液；藥物作用1小時(shí)后加入CoCl2(對(duì)照組除外)，使其終濃度為150μM，繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)。收集細(xì)胞，提取蛋白質(zhì)，做Western Blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的HSP70蛋白質(zhì)含量。
Western blot收集培養(yǎng)細(xì)胞，用生理鹽水洗兩次，細(xì)胞沉淀加入1×蛋白質(zhì)提取緩沖液(protein extract buffer)，吹散，沸水中煮15min，13000rpm離心20min，取上清測(cè)定蛋白質(zhì)濃度(按DC Protein Assay Kit說明書進(jìn)行)。取蛋白提取物50μg，加入等量的2×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸5min，做SDS-PAGE電泳，積層膠恒壓50V，分離膠恒壓100V，電泳至溴酚藍(lán)染料到達(dá)凝膠最前沿，停止電泳。轉(zhuǎn)膜電泳結(jié)束后揭膠，并將凝膠浸于適量的轉(zhuǎn)膜緩沖液中，平衡30min。同時(shí)截取適當(dāng)大小的PVDF膜和2張3M濾紙，將PVDF膜先在無水甲醇中浸濕，然后同濾紙一同浸于轉(zhuǎn)膜緩沖液中，平衡10～15min，膜放陽極、膠放陰極，兩面各墊2張3M濾紙，恒流110mA，4℃層析柜中轉(zhuǎn)膜過夜。封閉將轉(zhuǎn)有蛋白的膜浸于含10％脫脂奶粉的TBST中封閉1hr。雜交取出已封閉的膜，然后浸于1∶400-500稀釋的鼠抗人HSP70(用含5％脫脂奶粉的TBST、pH7.4配制)中，4℃過夜，TBST漂洗5min×5次，再浸于1∶10000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體(用含5％脫脂奶粉的TBST、pH7.4配制)中，TBST漂洗5min×5次。壓片、洗片取出膜，配制顯色液(ECL A液0.7ml+ECL B液0.7ml)，加在膜上，5min后吸去多余液體，保鮮膜封膜，固定在暗盒內(nèi)，壓片，洗片。
(3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果每組取10μg蛋白進(jìn)行western blot檢測(cè)。結(jié)果參見圖7A和圖7B，圖7A細(xì)胞在化學(xué)低氧環(huán)境下用不同濃度和厚樸酚處理4小時(shí)，用Western Blot法檢測(cè)，可見隨著和厚樸酚濃度增加，HSP70蛋白含量減小，泳道1常氧對(duì)照；泳道2CoCl2；泳道3CoCl2+0.1μg/ml和厚樸酚；泳道4CoCl2+0.5μg/ml和厚樸酚；泳道5CoCl2+1.0μg/ml和厚樸酚。β-actin為內(nèi)對(duì)照。圖7B各組HSP70蛋白條帶分別除去其相應(yīng)β-actin條帶的影響因子，圖中組別1-5分別代表常氧對(duì)照、CoCl2低氧對(duì)照、CoCl2+0.1μg/ml和厚樸酚、CoCl2+0.5μg/ml和厚樸酚、CoCl2+1.0μg/ml和厚樸酚。CoCl2(150μM)模擬低氧上調(diào)RKO細(xì)胞HSP70蛋白表達(dá)，western blot條帶的灰度值與對(duì)照組相比增強(qiáng)了195.4％，具有顯著差異。和厚樸酚0.1-1μg/ml濃度時(shí)劑量依賴性抑制CoCl2對(duì)RKO細(xì)胞HSP70蛋白表達(dá)的影響，抑制率分別為22.8％、35.8％和75.2％。這個(gè)結(jié)果與實(shí)施例5共同說明和厚樸酚可抑制細(xì)胞內(nèi)HSP70的表達(dá)，使細(xì)胞內(nèi)HSP70的含量降低，后者含量的降低可導(dǎo)致HIF-1α的降解。
實(shí)施例8和厚樸酚下調(diào)Bcl-xL，上調(diào)Bid。
(1)實(shí)驗(yàn)材料鼠抗人單抗P53(NeoMarkers，美國)；兔抗人多抗Bcl-2(武漢博士德公司)；兔抗人多抗Bcl-XL(武漢博士德公司)；兔抗人多抗Bid(武漢博士德公司)；兔抗人多抗Bax(武漢博士德公司)；HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗(KPL公司，美國)；HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體(北京中山生物制品公司)；化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)ECL反應(yīng)液(Santa Cruz公司，美國)；蛋白質(zhì)定量試劑盒(DC proteinassay)(Bio-Rad公司，美國)；RT-PCR試劑盒(Promega公司，美國)；Trizol試劑(Invitrogen公司，美國)；Protein MW marker(Fermentas公司，美國)；逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega，美國)；RNA酶抑制劑(Promega，美國)；Taq酶(上海生工)。
(2)實(shí)驗(yàn)方法細(xì)胞培養(yǎng)與藥物處理取對(duì)數(shù)生長期人結(jié)腸癌RKO細(xì)胞，用含10％滅活小牛血清的RPIM1640培養(yǎng)基，于37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)。用含10％小牛血清的新鮮RPIM1640培養(yǎng)基稀釋和厚樸酚母液(5mg/ml)，使成所需濃度(5-15μg/ml)，作用細(xì)胞48hrs。
RT-PCR細(xì)胞總RNA提取取經(jīng)不同濃度和厚樸酚作用48hrs的RKO細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，收集細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，冰生理鹽水洗3次后用RNA提取試劑Trizol(每孔400ul)提取細(xì)胞RNA(按Trizol試劑說明進(jìn)行)。RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒方案進(jìn)行，引物為寡核苷酸脫氧胸腺嘧啶(OligodT)。
引物序列如下(引物全由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成)上游引物(5’-3’) 下游引物(5’-3’) PCR產(chǎn)物大小(堿基對(duì))Bax ACCAAGAAGCTGAGCGAGTGT ACAAAGATGGTCACGGTCTGC 332Bcl-xl GGAGCTGGTGGTTGACTTTCT CCGGAAGAGTTCATTCACTAC 379Bid GACCCGGTGCCTCAGGA ATGGTCACGGTCTGCCA 586Bcl-2TTGTGGCCTTCTTTGAGTTCG TACTGCTTTAGTGAACCTTTT 332βAGGCCAACCGCGAGAAGATGA GAAGTCCAGGGCGACGTAGCAC 350-actin CCPCR條件Bax，Bcl-xl，Bid，Bcl-294℃5分鐘→32循環(huán){92℃1分鐘→55℃30秒→72℃90秒}→72℃5分鐘→4℃保存β-actin95℃5分鐘→25-28循環(huán){95℃20秒→55℃20秒→72℃30秒→72℃7分鐘→4℃保持。
西部印跡法(Western blot)收集培養(yǎng)細(xì)胞，用生理鹽水洗兩次，細(xì)胞沉淀加入1×蛋白提取緩沖液(protein extract buffer)，吹散，沸水中煮15min，13000轉(zhuǎn)速(rpm)離心20分鐘，取上清測(cè)定蛋白質(zhì)濃度(按蛋白質(zhì)定量試劑盒(DC protein assay)說明書進(jìn)行)。取蛋白提取物20μg，加入等量的2×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸5分鐘，做SDS-PAGE電泳，積層膠恒壓50V，分離膠恒壓100V，電泳至溴酚藍(lán)染料到達(dá)凝膠最前沿，停止電泳。
轉(zhuǎn)膜電泳結(jié)束后揭膠，并將凝膠浸于適量的轉(zhuǎn)膜緩沖液(Transferbuffer)中，平衡30分鐘。同時(shí)截取適當(dāng)大小的PVDF膜和2張3M濾紙，將PVDF膜先在無水甲醇中浸濕，然后同濾紙一同浸于轉(zhuǎn)膜緩沖液中，平衡10～15分鐘，膜放陽極、膠放陰極，兩面各墊2張3M濾紙，恒流110mA，4℃層析柜中轉(zhuǎn)膜過夜。
封閉將轉(zhuǎn)有蛋白的膜浸于含10％脫脂奶粉的TBST中封閉1hr。
雜交取出已封閉的膜，然后浸于1∶400-500稀釋的一抗(用含5％脫脂奶粉的TBST、pH7.4配制)中，4℃過夜，TBST漂洗5min×5次，再浸于1∶10000稀釋的二抗(用含5％脫脂奶粉的TBST、pH7.4配制)中，TBST漂洗5min×5次。
壓片、洗片取出膜，配制顯色液(ECL A液0.7ml+ECL B液0.7ml)，加在膜上，5min后吸去多余液體，保鮮膜封膜，固定在暗盒內(nèi)，壓片，分別于1min、2min和5min洗片。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果p53和Bcl-2家族成員是細(xì)胞凋亡調(diào)控的關(guān)鍵因子。Bcl-2家族成員Bax和Bcl-xl是抑制凋亡的因子，在腫瘤細(xì)胞中常為高表達(dá)，Bcl-2和Bid是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的因子，在腫瘤細(xì)胞中常為低表達(dá)3。
參見圖8，和厚樸酚處理腫瘤細(xì)胞RKO后，Bax和Bcl-2在mRNA水平上與對(duì)照組相比無明顯差別，圖中M為分子量標(biāo)記；1為對(duì)照，即0μg/ml的和厚樸酚處理；2為用5μg/ml和厚樸酚處理；3為用10μg/ml和厚樸酚處理；β-actin為PCR的內(nèi)標(biāo)。
參見圖9，和厚樸酚處理RKO細(xì)胞后，Bcl-XL的mRNA含量顯著下降，Bid的mRNA含量則顯著增加，圖中M為分子量標(biāo)記；1為對(duì)照，即0μg/ml的和厚樸酚處理；2為用5μg/ml和厚樸酚處理；3為用10μg/ml和厚樸酚處理；β-actin為PCR的內(nèi)標(biāo)。
參見圖10，和厚樸酚處理RKO細(xì)胞后，Bax，Bcl-2和p53在蛋白質(zhì)水平上與對(duì)照組相比無明顯差別，圖中honokiol為和厚樸酚的英文名，蛋白表達(dá)量用內(nèi)標(biāo)β-actin作為質(zhì)控。
參見圖11，和厚樸酚處理RKO細(xì)胞后，Bcl-XL的蛋白質(zhì)含量顯著下降，Bid的蛋白質(zhì)含量則顯著增加，圖中honokiol為和厚樸酚的英文名，蛋白表達(dá)量用內(nèi)標(biāo)β-actin作為質(zhì)控。
結(jié)論和厚樸酚可下調(diào)腫瘤細(xì)胞內(nèi)抑細(xì)胞凋亡因子Bcl-xL，上調(diào)促細(xì)胞凋亡因子Bid。
實(shí)施例9 和厚樸酚上調(diào)并激活腫瘤細(xì)胞內(nèi)Caspase成員實(shí)驗(yàn)材料鼠抗人單抗caspase-3(NeoMarkers，美國)；鼠抗人單抗Caspase-7(NeoMarkers，美國)；鼠抗人單抗Caspase-9(NeoMarkers，美國)；HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗(KPL公司，美國)。
實(shí)驗(yàn)方法細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理取對(duì)數(shù)生長期人結(jié)腸癌RKO細(xì)胞，用含10％滅活小牛血清的RPIM1640培養(yǎng)基，于37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)。用含10％小牛血清的新鮮RPIM1640培養(yǎng)基稀釋和厚樸酚母液(5mg/ml)，使成所需濃度(5-15μg/ml)，作用細(xì)胞48hrs。
西部印跡法(Western blot)收集培養(yǎng)細(xì)胞，用生理鹽水洗兩次，細(xì)胞沉淀加入1×蛋白提取緩沖液(protein extract buffer)，吹散，沸水中煮15min，13000轉(zhuǎn)速(rpm)離心20分鐘，取上清測(cè)定蛋白質(zhì)濃度(按蛋白質(zhì)定量試劑盒(DC protein assay)說明書進(jìn)行)。取蛋白提取物20μg，加入等量的2×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸5分鐘，做SDS-PAGE電泳，積層膠恒壓50V，分離膠恒壓100V，電泳至溴酚藍(lán)染料到達(dá)凝膠最前沿，停止電泳。
轉(zhuǎn)膜電泳結(jié)束后揭膠，并將凝膠浸于適量的轉(zhuǎn)膜緩沖液(Transferbuffer)中，平衡30分鐘。同時(shí)截取適當(dāng)大小的PVDF膜和2張3M濾紙，將PVDF膜先在無水甲醇中浸濕，然后同濾紙一同浸于轉(zhuǎn)膜緩沖液中，平衡10～15分鐘，膜放陽極、膠放陰極，兩面各墊2張3M濾紙，恒流110mA，4℃層析柜中轉(zhuǎn)膜過夜。
封閉將轉(zhuǎn)有蛋白的膜浸于含10％脫脂奶粉的TBST中封閉1hr。
雜交取出已封閉的膜，然后浸于1∶400-500稀釋的一抗(用含5％脫脂奶粉的TBST、pH7.4配制)中，4℃過夜，TBST漂洗5min×5次，再浸于1∶10000稀釋的二抗(用含5％脫脂奶粉的TBST、pH7.4配制)中，TBST漂洗5min×5次。
壓片、洗片取出膜，配制顯色液(ECLA液0.7ml+ECLB液0.7ml)，加在膜上，5min后吸去多余液體，保鮮膜封膜，固定在暗盒內(nèi)，壓片，分別于1min、2min和5min洗片。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(caspases)家族是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者。Caspase在細(xì)胞中有兩種形式，無活性的酶元(procaspase)和有活性的酶。和厚樸酚處理RKO腫瘤細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的酶元procaspase-3，-7，和-9含量顯著增加(圖12，13，14)，而且細(xì)胞內(nèi)被激活的caspase-3的含量也顯著增加(圖13)。激活的caspase-3是細(xì)胞發(fā)生凋亡的關(guān)鍵點(diǎn)(Wang KW.Trends in<p>表CLi3-xMIIMIV(PO4)3MIV＝Zr、TiMII＝能夠具有+2氧化態(tài)的任何過渡金屬

(1)取自R.D.Shannon，Acta Cryst.A32，751(1976)。
(2)在每種情形下，MII與脫出的鋰離子數(shù)目成比例地氧化成更高的氧化態(tài)，因?yàn)閆rIV和TiIV不會(huì)氧化。
(3)RMM是相對(duì)分子質(zhì)量。
(4)“脫出的鋰離子數(shù)目”一詞是基于一個(gè)化學(xué)式。
表2.和厚樸酚對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞RKO細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用

和厚樸酚可誘導(dǎo)RKO腫瘤細(xì)胞內(nèi)DNA呈特異性梯帶，參見圖15，其中條帶1對(duì)照；條帶25μg/ml和厚樸酚；條帶310μg/ml和厚樸酚條帶415μg/ml和厚樸酚。DNA特異性梯帶是確定細(xì)胞凋亡的標(biāo)志。
實(shí)施例11和厚樸酚在體對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞系RKO細(xì)胞所致實(shí)體瘤及腹水瘤的抑制作用(1)實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞系人結(jié)腸癌細(xì)胞系RKO來源于美國ATCC公司；和厚樸酚，中國藥品與生物制品鑒定所。
動(dòng)物Babl/c小鼠(上海動(dòng)物中心)無菌飼養(yǎng)室及飼料(浙江省中醫(yī)學(xué)院提供)(2)實(shí)驗(yàn)方法腹水瘤模型取對(duì)數(shù)生長期RKO細(xì)胞→0.25％胰酶消化片刻→離心、生理鹽水洗3次，徹底去除胰酶→細(xì)胞沉淀溶于無血清RPIM1640培養(yǎng)基，使成2×106/ml→每鼠腹腔接種100μl(含2×105細(xì)胞)→觀察腹部膨隆情況。
實(shí)體瘤模型取腹水瘤鼠一只→引頸處死→碘酊消毒皮膚，75％乙醇浸泡片刻→剪開腹壁皮膚，無菌生理鹽水1000μl沖淋腹腔→收集沖洗液→每鼠50μl(約含2×105細(xì)胞)接種于腋部皮下→隔天稱量體重，卡尺測(cè)量瘤體體積。
分組及用藥腹水瘤及實(shí)體瘤各分為3組空白對(duì)照組、溶劑組、用藥組。和厚樸酚溶于PEG400/蔗糖(體積比7∶3)溶液，使成25mg/ml，放置37℃搖床振蕩2小時(shí)，分裝備用。用藥組隔天每鼠灌胃5mg(100μl)和厚樸酚溶液，溶劑組給予等體積PEG400/蔗糖溶液，對(duì)照組給予等體積生理鹽水，隔天一次，連續(xù)用藥至對(duì)照組死亡。隔天稱量體重及測(cè)量瘤體大小或腹部膨隆情況。
(3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果&lt;1&gt;和厚樸酚對(duì)RKO細(xì)胞成腹水瘤的抑制作用腹水瘤組在腹腔接種當(dāng)天開始用藥，每天觀測(cè)腹部膨隆，隔天記錄體重。比較各組平均生存時(shí)間。結(jié)果如表4所示，溶劑組和對(duì)照組的平均壽命分別是28.8天和29.7天，兩組之間無顯著差異。和厚樸酚用藥組平均壽命50.9天，比對(duì)照組延長22.18天，平均生存時(shí)間是對(duì)照組的176.7％，兩組之間有顯著差異(P＜0.05)，說明和厚樸酚能有效抑制RKO細(xì)胞形成腹水瘤，并延長荷瘤鼠的生存時(shí)間。
表3和厚樸酚對(duì)荷人RKO腹水瘤Balb/C裸鼠的平均生存時(shí)間和生存延長時(shí)間的影響實(shí)驗(yàn)分組動(dòng)物數(shù) MST(天) T/C(％)對(duì)照組 7 28.8 100溶劑組 6 29.7 104.5和厚樸酚7 50.9 176.7*平均生存時(shí)間(mean survival time，MST)。生存時(shí)間延長率(The survivalrate，T/C％)，T/C(％)＝[試驗(yàn)組的平均生存時(shí)間/對(duì)照組的平均生存時(shí)間]×100％.*P＜0.01，與溶劑組相比。
&lt;2&gt;和厚樸酚對(duì)RKO細(xì)胞成實(shí)體瘤的抑制作用取Babl/c小鼠10只，待瘤體增長至約5×5mm時(shí)，隨機(jī)分為對(duì)照組(3只)、溶劑組(3只)與用藥組(4只)。用藥組每次灌胃5mg和厚樸酚，隔天一次，持續(xù)21天。溶劑組給予等體積溶劑(PEG400/蔗糖)，對(duì)照組給予等體積生理鹽水。隔天稱重及測(cè)量瘤體大小，以每周最后一次的數(shù)據(jù)作圖，結(jié)果參見圖16，Y軸代表腫瘤體積，X-軸代表藥物治療天數(shù)，可見和厚樸酚可顯著遏制腫瘤的生長，“*”表示與對(duì)照組相比P＜0.05。
結(jié)果為對(duì)照組和用藥組開始時(shí)的平均瘤體體積分別為0.185cm3和0.171cm3，一周后兩組的增長率分別是361％和198％，相差1.8倍，但統(tǒng)計(jì)表明無組間差異(P＝0.055＞0.05)。第2周時(shí)對(duì)照組14天平均增長1182％，而用藥組只增長710％，前者與后者的比值為1.66，但統(tǒng)計(jì)表明有組間差異(P＝0.011＜0.05)。第3周時(shí)用藥組的增長明顯減慢，21天平均增長率是901％，而對(duì)照組達(dá)到1626％，兩組間差異顯著(P＜0.05)。第4周時(shí)對(duì)照組動(dòng)物陸續(xù)死亡，而用藥組也停止給藥，但瘤體增長未見明顯增快，反而其中一只出現(xiàn)瘤體脫落現(xiàn)象。溶劑組與對(duì)照組無組間差異。以上結(jié)果表明，和厚樸酚對(duì)RKO細(xì)胞所致實(shí)體瘤具有顯著的抑瘤效果。
實(shí)施例1-9證明和厚樸酚的作用靶點(diǎn)為低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)，血管生長因子(VEGF)、一氧化氮合成酶、HSP70、Bcl-xL、Bid、和caspase；而實(shí)施例10和11用體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)充分證明和厚樸酚通過作用于這些靶點(diǎn)可有效抑制腫瘤。研發(fā)抗腫瘤的靶點(diǎn)藥是當(dāng)前的趨勢(shì)。
無需進(jìn)一步詳細(xì)闡述，相信采用前面所公開的內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員可最大限度地應(yīng)用本發(fā)明。因此，前面的實(shí)施方案應(yīng)理解為僅是舉例說明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
本發(fā)明涉及的部分參考文獻(xiàn)1.Ross JS，Schenkein DP，Peitrusko R，et al.Am J Clin Pathol.122598-609，2004.
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權(quán)利要求
1.和厚樸酚在制備抗腫瘤靶點(diǎn)藥物中的用途，和厚樸酚，英文名為honokiol，CAS number35354-74-6，分子量266.33，化學(xué)命名為3，5’-diallyl-4，2’-dihydroxybiphenyl，分子式為C18H18O2，腫瘤靶點(diǎn)是指低氧誘導(dǎo)因子-1、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、氧化氮合成酶、熱休克蛋白質(zhì)-70、細(xì)胞凋亡的相關(guān)蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的和厚樸酚在制備抗腫瘤靶點(diǎn)藥物中的用途，其特征是在制備針對(duì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)低氧誘導(dǎo)因子-1來治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的和厚樸酚在制備抗腫瘤靶點(diǎn)藥物中的用途，其特征是在制備抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)低氧誘導(dǎo)因子-1α的合成及其積聚的抗腫瘤藥物中的用途。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的和厚樸酚在制備抗腫瘤靶點(diǎn)藥物中的用途，其特征是在制備針對(duì)腫瘤細(xì)胞的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子來治療腫瘤的藥物中的用途。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的和厚樸酚在制備抗腫瘤靶點(diǎn)藥物中的用途，其特征是在制備抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的合成的抗腫瘤藥物中的用途。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的和厚樸酚在制備抗腫瘤靶點(diǎn)藥物中的用途，其特征是在制備針對(duì)腫瘤細(xì)胞的一氧化氮合成酶來治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的和厚樸酚在制備抗腫瘤靶點(diǎn)藥物中的用途，其特征是在制備調(diào)控腫瘤細(xì)胞內(nèi)的一氧化氮合成酶的合成的藥物中的用途。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的和厚樸酚在制備抗腫瘤靶點(diǎn)藥物中的用途，其特征是在制備針對(duì)腫瘤細(xì)胞的熱休克蛋白質(zhì)-70來治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的和厚樸酚在制備抗腫瘤靶點(diǎn)藥物中的用途，其特征是在制備調(diào)控腫瘤細(xì)胞內(nèi)的熱休克蛋白質(zhì)-70的合成的抗腫瘤藥物中的用途。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的和厚樸酚在制備抗腫瘤靶點(diǎn)藥物中的用途，其特征是在制備針對(duì)腫瘤細(xì)胞的調(diào)控細(xì)胞凋亡的因子來治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述根據(jù)權(quán)利要求8所述的和厚樸酚在制備抗腫瘤靶點(diǎn)藥物中的用途，其特征是在制備抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)抗凋亡因子Bcl-XL，增強(qiáng)促凋亡因子Bid的抗腫瘤藥物中的用途。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的和厚樸酚在制備抗腫瘤靶點(diǎn)藥物中的用途，其特征是在制備誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-10所述的任一和厚樸酚在制備抗腫瘤靶點(diǎn)藥物中的用途，其特征是制備的藥物是由和厚樸酚與制劑允許的藥物賦形劑或載體組合，其制劑形式為液體制劑、顆粒劑、片劑、沖劑、膠丸、膠囊、緩釋劑、滴丸劑或口崩制劑。
全文摘要
本發(fā)明提供和厚樸酚在制備抗腫瘤靶點(diǎn)藥物中的用途，該和厚樸酚英文名為honokiol，CAS number35354－74－6，分子量266.33，化學(xué)命名為3，5’－diallyl－4，2’－dihydroxybiphenyl，分子式為C
文檔編號(hào)A61K31/05GK1633997SQ200410067749
公開日2005年7月6日 申請(qǐng)日期2004年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月29日
發(fā)明者胡汛, 陳菲, 徐棟, 潘鏘榮, 顧影, 王弢 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)