專利名稱：胚泡著床相關(guān)因子及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及胚泡著床相關(guān)因子EMO-1在促進(jìn)胚泡著床等方面的用途。
背景技術(shù)：
胚胎著床是哺乳動物生殖過程中所特有的一個重要步驟。因著床過程完成后才算真正懷孕，所以針對胚胎著床過程進(jìn)行生育調(diào)控，不存在倫理問題，是一個理想的生育調(diào)控藥具作用環(huán)節(jié)。此外，隨著卵母細(xì)胞的體外培養(yǎng)和成熟、體外受精、受精卵的體外培養(yǎng)和發(fā)育等技術(shù)不斷提高，移植后胚胎能否順利著床，目前己成為影響人工輔助生育技術(shù)(ART/IVF)成功率的關(guān)鍵。
胚胎相對于母體來說，是一個半異體組織，易受母體排斥，只能在一個特定的時間段內(nèi)(即″著床窗″)才能被母體子宮內(nèi)膜組織接納。胚胎著床過程的完成有賴于母體子宮與胚胎的同步發(fā)育、母體子宮內(nèi)膜容受性和″著床窗″的形成、以及母體子宮組織局部免疫耐受性的形成，涉及細(xì)胞的增殖和分化、局部免疫功能的調(diào)節(jié)。雌、孕激素在著床中的作用已很明確，現(xiàn)有的笛體類避孕藥就是基于它們在生殖過程中的作用發(fā)展起來的。但是，由于雌、孕激素是內(nèi)分泌激素，其作用是全身性的，因此還不是最理想的生育調(diào)控因子。近年來，在胚胎著床期間子宮組織局部發(fā)揮作用的非激素類因子越來越得到人們的重視，己成為生殖生物學(xué)研究領(lǐng)域的一個熱點。
SEC63是一種細(xì)胞膜上信息識別顆粒，在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上也有，參與細(xì)胞信息傳遞，多從上皮細(xì)胞提取，在本發(fā)明之前沒有人從胚泡細(xì)胞提取到該因子，也無人研究其功能，更沒有證實其與胚泡著床的關(guān)系。
由于種種原因，人們對與胚泡著床有關(guān)的因子還知之甚少，因此本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的胚泡著床相關(guān)因子。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的胚泡著床相關(guān)EMO-1因子及其用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供了EMO-1基因(及其編碼蛋白)的用途，它被用作促進(jìn)胚泡著床的促進(jìn)劑。
本發(fā)明還提供了EMO-1基因(及其編碼蛋白)的另一用途，它被用于制備促進(jìn)胚泡著床的藥物。
在本發(fā)明的第二方面，提供了EMO-1拮抗劑的用途，它被用作體外抑制胚泡著床的抑制劑。
本發(fā)明還提供了EMO-1拮抗劑的另一用途，它被用于制備抑制胚泡著床的藥物。
在另一優(yōu)選例中，所述的藥物為避孕藥。
在另一優(yōu)選例中，所述的拮抗劑是EMO-1的反義核酸或抗EMO-1多肽的抗體。
在本發(fā)明的第三方面，提供了EMO-1激動劑的用途，它被用作體外促進(jìn)胚泡著床的促進(jìn)劑。
本發(fā)明還提供了一種EMO-1激動劑的另一用途，它被用于制備促進(jìn)胚泡著床的藥物。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種確定測試化合物是否是EMO-1的拮抗劑或激動劑的方法，它包括步驟(a)將測試化合物和EMO-1多肽加入體外培養(yǎng)的胚泡作為測試組，并將EMO-1多肽加入體外培養(yǎng)的胚泡作為對照組；(b)觀察測試組和對照組胚泡著床情況，如果測試組的胚泡著床數(shù)量大于對照組，則表示測試化合物是EMO-1的激動劑；如果測試組的胚泡著床數(shù)量小于對照組，則表示測試化合物是EMO-1的拮抗劑。
在本發(fā)明的第五方面，提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量(，如0.001-99.9wt％)的EMO-1多肽、其激動劑或其拮抗劑以及藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書所界定的本發(fā)明范圍。
圖1顯示了小鼠EMO-1多肽的全長氨基酸序列。
圖2顯示了EMO-1的反義核酸在體外可有效抑制胚泡發(fā)育。
具體實施例方式
本發(fā)明人通過深入研究發(fā)現(xiàn)，EMO-1基因在著床后小鼠胚胎中的表達(dá)水平明顯高于著床前。研究表明，反義核酸可通過阻斷EMO-1mRNA的翻譯過程，在體外可以有效地抑制胚泡從透明帶中孵化出來，在體內(nèi)則能明顯地降低正常著床的胚胎數(shù)。這說明EMO-1基因在胚胎著床過程中起著重要的促進(jìn)作用。
在本發(fā)明中，術(shù)語“Sec63蛋白”、“Sec63多肽”、“EMO-1蛋白”、“EMO-1多肽”、“EMO-1因子”或“胚泡著床相關(guān)蛋白EMO-1”等可互換使用，都指具有胚泡著床相關(guān)因子EMO-1氨基酸序列(SEQ ID NO2)的蛋白或多肽。它們可含有或不含起始的甲硫氨酸。此外，這些術(shù)語還包括在其他哺乳動物(如人、狗、牛、羊、猴)中的具有促進(jìn)胚泡著床功能的同系物或同源蛋白。
應(yīng)理解，由于鼠等哺乳動物的Sec63蛋白的核酸序列和氨基酸序列都是已知的，可以用本領(lǐng)域常規(guī)的DNA重組技術(shù)而獲得其蛋白。
一類特別優(yōu)選的蛋白是EMO-1類似物，即在其他哺乳動物(如牛、羊、兔、狗、猴、人等)中EMO-1的同源蛋白。這些其他物種的同源蛋白的編碼序列，可根據(jù)EMO-1的序列，通過雜交或擴(kuò)增的方法而獲得，進(jìn)而通過常規(guī)重組方法獲得這些同源蛋白。
如本文所用，“分離的EMO-1蛋白或多肽”是指EMO-1多肽基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化EMO-1多肽?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明還包括EMO-1多肽的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然EMO-1因子相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。
在本發(fā)明中，術(shù)語“EMO-1多肽”指具有促進(jìn)胚泡著床等EMO-1因子活性的SEQ ID NO2序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與EMO-1因子相同功能的、SEQ ID NO2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)一個或多個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或多個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括EMO-1因子的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與EMO-1 DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗EMO-1多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含EMO-1多肽或其片段的融合蛋白(如SEQ ID NO3所示的融合蛋白)。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了EMO-1多肽的可溶性片段。通常，該片段具有EMO-1多肽序列的至少約50個連續(xù)氨基酸，通常至少約100個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約150個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約200個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約300個連續(xù)氨基酸。
本發(fā)明還涉及EMO-1多肽的類似物。這些類似物與天然EMO-1多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然Ｐ揎椷€包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
本發(fā)明的EMO-1核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
EMO-1多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限于)直接做為藥物治療EMO-1因子功能低下或喪失所致的疾病(如因胚泡著床能力低下而導(dǎo)致的不孕)，和用于篩選促進(jìn)或?qū)笶MO-1因子功能的抗體、多肽或其它配體。用表達(dá)的重組EMO-1因子篩選多肽庫可用于尋找有治療價值的能抑制或刺激EMO-1因子功能的多肽分子。
另一方面，本發(fā)明還包括對EMO-1DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于EMO-1基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與EMO-1基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制EMO-1因子的分子，也包括那些并不影響EMO-1因子功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的EMO-1基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的EMO-1基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)EMO-1因子或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷EMO-1功能的抗體以及不影響EMO-1功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用EMO-1基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與EMO-1基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而獲得。
抗EMO-1的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測活檢標(biāo)本中的EMO-1。
本發(fā)明中的抗體作為EMO-1的拮抗劑，還可用于抑制胚泡著床，從而用于避孕。給予適當(dāng)劑量的抗體可以阻斷EMO-1的產(chǎn)生或活性。
利用本發(fā)明蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與EMO-1發(fā)生相互作用的物質(zhì)，如受體、抑制劑、激動劑或拮抗劑等。例如，能與EMO-1結(jié)合的多肽分子可通過篩選由各種可能組合的氨基酸結(jié)合于固相物組成的隨機(jī)多肽庫而獲得。
本發(fā)明蛋白及其抗體、抑制劑、激動劑、拮抗劑或受體等，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)口服、透皮、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、陰道內(nèi)或局部給藥。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明EMO-1多肽或其激動劑、拮抗劑以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約10毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的EMO-1蛋白或其拮抗劑、激動劑施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約1微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約10毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
EMO-1的多聚核苷酸也可用于多種治療目的?；蛑委熂夹g(shù)可用于治療由于EMO-1的無表達(dá)或異常/無活性的EMO-1的表達(dá)所致的胚泡著床水平低下。反義核苷酸可以抑制胚泡著床，從而用于避孕。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測EMO-1水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領(lǐng)域所熟知的，包括放射免疫測定等方法。試驗中所檢測的EMO-1水平，可以用作解釋EMO-1因子在不孕等疾病中的重要性和用于診斷。
一種檢測檢測樣品中是否存在EMO-1因子的方法是利用EMO-1因子的特異性抗體進(jìn)行檢測，它包括將樣品與EMO-1因子特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在EMO-1因子。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于，胚泡著床對EMO-1對有明顯的依賴性，如果缺少EMO-1則著床不能成功。
下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1EMO-1cDNA的克隆1.實驗動物ICR小白鼠，雌性小鼠28±2g，7-8周，成熟期。雄性小鼠30±2g，二雄一雌合籠，第二天早晨，查陰栓，發(fā)現(xiàn)陰栓日為妊娠第一天。
2.胚泡收集小鼠腹部用75％酒精消毒，打開腹腔，取出子宮，用PBS從子宮一端沖出胚泡，置于凹玻片上，在解剖鏡下迅速收集胚泡于一小管，置于液氮，保存待用。
3.總RNA提取應(yīng)用Quickprep Micro mRNA Puriflcation Kit(AmershamPharmacia Biotech)試劑提取總RNA。
4.反轉(zhuǎn)錄(RT)使用兩種酶AMV和MMLV，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄從mRNA得到cDNA(單鏈)。
5.DD-PCR(反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增)單鏈cDNA經(jīng)過DD-PCR得到雙鏈cDNA。擴(kuò)增中使用兩種引物，隨機(jī)引物和錨引物。
6.差異顯示差異顯示使用蛋白測序分析電泳儀(1)電泳儀的裝量，灌膠(6％變性測序膠)(2)上樣各種DD-PCR產(chǎn)物的樣品(3)預(yù)電泳及電泳(4)干膠和曝光(5)刻取差異片段，在沖片后分析差異片段，并進(jìn)行編號，然后參照膠與X光上的標(biāo)記，刻取差異片段。冷凍保存待用。
7.DD-PCR差異片段的回收與擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物的純化。
8.目的片段與載體Pucm-T(購自上海博彩生物科技公司公司)的連接，成為Pucm-T-Tar載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，進(jìn)行克隆(按制造商的產(chǎn)品說明書進(jìn)行)。
9.重組克隆篩選藍(lán)/自斑篩選，重組克隆為白色。
10.插入片段的序列分析，將插入到上述載體Pucm-T中的插入片段用ABI377全自動序列分析儀進(jìn)行分析，獲得各插入片段的全長序列。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)有一個差異表達(dá)蛋白的cDNA如SEQ ID NO1所示，被命名為EMO-1基因。
EMO-1cDNA為2631bp(SEQ ID NO1)，第40-2322位為完整的開放讀框，編碼含760個氨基酸殘基的多肽(圖1和SEQ ID NO2)。
實施例2EMO-1的原位雜交用SEQ ID NO1中第178-355位的核苷酸片段為探針，用以下方法進(jìn)行原位雜交取懷孕第4天，第5天小鼠子宮內(nèi)膜，以4％多聚甲醛室溫固定2.5小時，固定后樣品經(jīng)梯度脫水，石蠟包埋，切片。切片經(jīng)脫蠟與制備好的線性DNA模板探針，進(jìn)行預(yù)雜交和雜交。
結(jié)果表明，EMO-1基因具有較高的胚泡特異性，其他組織無雜交。
實施例3EMO-1反義核酸對胚泡著床的體外抑制作用本實施例使用的反義核酸或?qū)φ蘸怂崛缦路戳x核酸是序列如下的寡核苷酸5’-GTCTTCTGTGGGCTGCTCCTC A-3’(SEQ ID NO3)對照核酸為隨機(jī)序列的寡核苷酸5’-TGAGGAGCAGCCCACAGAAGA C-3’(SEQ ID NO4)將轉(zhuǎn)染劑LipofectAminTM2000 Reagent(Invitrogen公司)和上述反義核酸或?qū)φ蘸怂岬幕旌弦?濃度為1μg/μl)，加入小鼠的胚泡培養(yǎng)液中(每孔加入100μl培養(yǎng)液和6μl混合液，終濃度為O.056μg/μl)，觀察對胚泡生長的影響。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)妊娠第4天的小鼠囊胚，用SEC63(EMO-1)的反義RNA進(jìn)行功能封閉時，可顯著抑制胚泡的生長，抑制胚泡從透明帶逸出(圖2A和2B)。
實施例4EMO-1反義核酸對胚泡著床的體內(nèi)抑制作用本實施例使用的反義核酸或?qū)φ蘸怂崛缦路戳x核酸是序列如下的寡核苷酸5’-GTCTTCTGTGGGCTGCTCCTC A-3’(SEQ ID NO3)對照核酸為隨機(jī)序列的寡核苷酸5’-TGAGGAGCAGCCCACAGAAGA C-3’(SEQ ID NO4)將轉(zhuǎn)染劑Mirus TransITPolymer Solution(Madison公司，WI，USA)和上述反義核酸或?qū)φ蘸怂岬幕旌衔?濃度為1μg/μl)，按表1所示劑量于妊娠第4天下午將反義核酸直接注射入每側(cè)子宮，然后在第9天統(tǒng)計正常著床的胚胎數(shù)。
結(jié)果表明，EMO-1反義核酸能夠明顯降低正常著床的胚胎數(shù)(見表1)。
表1 EMO-1核酸對小鼠著床的影響(重復(fù)2次試驗)

實施例5EMO-1的重組表達(dá)在該實施例中，以抽提的小鼠胚泡mRNA為模板，用序列如下的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增RT-PCR，獲得EMO-1DNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5’端寡核苷酸引物序列為5’-aaaGAATTCatggcgggccagcagttccagtacg-3’(SEQ ID NO5)該引物含有EcoRI限制性內(nèi)切酶的酶切位點，在該酶切位點之后是由起始密碼子開始的部分編碼序列；3’端引物序列為5’-aaaCTCGAGtgtctccaccttcctcttcctcc-3’(SEQ ID NO6)，該引物含有XhoI限制性內(nèi)切酶的酶切位點、翻譯終止子和EMO-1的部分編碼序列。
EMO-1cDNA PCR產(chǎn)物純化后經(jīng)EcoRI/XhoI酶切再與質(zhì)粒pUC18按常規(guī)方法重組并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆鑒定后純化并測序(ABI公司的377型測序儀，BigDye Terminator試劑盒，PE公司)。將正確序列的EMO-1蛋白cDNA EcoRI酶切片段克隆至表達(dá)載體pGEX-2T(Pharmacia，Piscataway，NJ)，形成載體pGEX-2T-EMO-1，然后轉(zhuǎn)化人DH5α。陽性克隆用EcoRI/XhoI酶切鑒定插入方向，酶切產(chǎn)物行2％瓊脂糖凝膠電泳分析。經(jīng)測序證實，己插入了完整的EMO-1編碼序列。
挑表達(dá)EMO-1的陽性DH5α克隆接種于100ml 2×YTA培養(yǎng)基中，37℃ 300rpm振蕩培養(yǎng)12-15hr，1∶10稀釋于預(yù)熱的2×YTA培養(yǎng)基繼續(xù)振蕩培養(yǎng)1.5hr，加100mMIPTG至0.1mM后30℃誘導(dǎo)2-6hr，5,000g 4℃離心10min去上清，置冰上用50ml 1×PBS(0.14M NaCl，2.7mM KCl，10.1mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH7.3)重懸，超聲(B.Braun Labsonic U)破碎后再加入20％Triton X-100至1％輕搖30min，然后12,000g 4℃離心10min，上清用0.8μm濾膜過濾后，過1ml 50％谷胱甘肽Sepharose 4B層析柱，1×PBS充分洗滌后，加入500ul谷胱甘肽洗脫緩沖液(10mM谷胱甘肽，50mM Tris-HCl，pH 8.0)室溫靜置30分鐘后收集洗脫液，重復(fù)洗脫2-3次，得到EMO-1蛋白，分子量大小與預(yù)計值相符。
實施例6抗EMO-1抗體的產(chǎn)生1.多肽的合成以合成多抗原肽(MAP)的方式進(jìn)行多肽的合成，MAP的核心是一種沒有免疫原性的Lys(賴氨酸)核心，目的抗原多肽的C端偶聯(lián)在Lys的兩個氨基酸上?？梢孕纬?個重復(fù)序列的多抗原肽。得到的兩種合成多肽的抗原片段如下抗原多肽EMO-1NGlu-Ser-Arg-Lys-Asn-Trp-Glu-Glu-Phe-Gly-Asn-Pro-Asp-Gly-Pro-Gln-Ala(SEQ ID NO7)抗原多肽EMO-1CSer-Glu-Lys-Glu-Asp-Gly-Ser-Asp-Arg-Glu-Ser-Asp-Arg-Glu-Gln-Asp-Glu(SEQ ID NO8)2.產(chǎn)生抗體用如上合成的2種多肽分別作為免疫原，每次以0.4mg/Kg多點注射兔的皮下，抗原溶于生理鹽水并和等體積的Freund’s完全佐劑乳化，每隔二周進(jìn)行一次加強免疫，用固相酶免疫測定方法，進(jìn)行抗血清效價的鑒測。待抗血清的效價達(dá)到要求時，即可從兔的頸動脈取全血，并分離出血清，得到二種抗EMO-1的抗血清(抗EMO-1N抗血清和抗EMO-1C抗血清)。-20℃冷凍待用。
按實施例4的方法進(jìn)行胚泡著床的體內(nèi)抑制試驗，不同點在于用抗血清(不用轉(zhuǎn)染劑)替換反義核酸。結(jié)果如表2所示。
表2 EMO-1抗血清對小鼠著床的影響

*給藥時間為妊娠第4天下午6:00到下午6:30實施例7篩選EMO-1的拮抗劑按實施例4所述方法，將以下兩組物質(zhì)(替換反義核酸和轉(zhuǎn)染劑)施用于懷孕小鼠，然后觀察對胚泡著床的體內(nèi)抑制作用(a)候選物質(zhì)+EMO-1因子；(b)EMO-1因子。
如果組(a)的胚泡著床率在統(tǒng)計學(xué)上顯著低于組(b)的胚泡著床率，則表明該候選物質(zhì)是EMO-1的拮抗劑。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>上海市計劃生育科學(xué)研究所<120>胚泡著床相關(guān)因子及其用途<130>044189<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2631<212>DNA<213>小鼠(Mus musculus)<220>
<221>CDS<222>(40)..(2322)<223>
<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(2631)<223>n＝a，t，c，g<400>1cgacggcggt gaggggagcg cggcggagga ggcggagcc atg gcg ggc cag cag 54Met Ala Gly Gln Gln1 5ttc cag tac gat gac agc ggg aac acc ttc ttc tac ttc ctc acc tcc102Phe Gln Tyr Asp Asp Ser Gly Asn Thr Phe Phe Tyr Phe Leu Thr Ser10 15 20ttc gtg ggg ctc atc gtg atc ccc gcc acc tac tac ctc tgg ccg cga150Phe Val Gly Leu Ile Val Ile Pro Ala Thr Tyr Tyr Leu Trp Pro Arg25 30 35gac cag aac gcg gag caa att cga tta aag aat atc aga aaa gta tat198Asp Gln Asn Ala Glu Gln Ile Arg Leu Lys Asn Ile Arg Lys Val Tyr40 45 50gga aga tgt atg tgg tat cgt tta cgg tta tta aaa ccc cag cca aat246Gly Arg Cys Met Trp Tyr Arg Leu Arg Leu Leu Lys Pro Gln Pro Asn55 60 65att att cct aca gta aag aaa ata gtt ctg ctt gca gga tgg gca ctg294Ile Ile Pro Thr Val Lys Lys Ile Val Leu Leu Ala Gly Trp Ala Leu70 75 80 85ttc tta ttt crt gca tac aaa gtt tcc aaa aca gac cga gaa tat caa342Phe Leu Phe Leu Ala Tyr Lys Val Ser Lys Thr Asp Arg Glu Tyr Gln90 95 100gag tac aat cct tat gaa gta cta aat ttg gat cct gga gca aca gtg390Glu Tyr Asn Pro Tyr Glu Val Leu Asn Leu Asp Pro Gly Ala Thr Val
105 110 115gca gaa att aag aaa cag tat cgc ttg ttg tca ctt aaa tat cat cca438Ala Glu Ile Lys Lys Gln Tyr Arg Leu Leu Ser Leu Lys Tyr His Pro120 125 130gat aaa gga ggt gat gaa gtc atg ttc atg agg ata gca aaa gca tat486Asp Lys Gly Gly Asp Glu Val Met Phe Met Arg Ile Ala Lys Ala Tyr135 140 145gea gct tta aca gat gaa gag tct cgg aaa aat tgg gaa gaa ttt gga534Ala Ala Leu Thr Asp Glu Glu Ser Arg Lys Asn Trp Glu Glu Phe Gly150 155 160 165aat cca gat ggg cct caa gct aca agc ttt gga att gct ttg cca gct582Asn Pro Asp Gly Pro Gln Ala Thr Ser Phe Gly Ile Ala Leu Pro Ala170 175 180tgg ata gtt gac cag aaa aat tca att ctg gtt tta ctt gtg tat gga630Trp Ile Val Asp Gln Lys Asn Ser Ile Leu Val Leu Leu Val Tyr Gly185 190 195ttg gct ttt atg gtt att ctt cct gtt gtg gtg ggc tct tgg tgg tat678Leu Ala Phe Met Val Ile Leu Pro Val Val Val Gly Ser Trp Trp Tyr200 205 210cgg tca ata cga tat agt gga gac cag att cta ata cgt aca aca cag726Arg Ser Ile Arg Tyr Ser Gly Asp Gln Ile Leu Ile Arg Thr Thr Gln215 220 225att tat aca tac ttt gtt tat aaa act cga aat atg gat atg aaa cgt774Ile Tyr Thr Tyr Phe Val Tyr Lys Thr Arg Asn Met Asp Met Lys Arg230 235 240 245ctc atc atg gtt tta gct gga gct tct gaa ttt gac cct cag tat aat822Leu Ile Met Val Leu Ala Gly Ala Ser Glu Phe Asp Pro Gln Tyr Asn250 255 260aaa gat tcc aca agc agg cca aca gat aat att tta ata cca cag cta870Lys Asp Ser Thr Ser Arg Pro Thr Asp Asn Ile LeuIle Pro Gln Leu265 270 275atc agg gaa att ggc agc ata aat tta aag aag aat gaa cct cca ctc918Ile Arg Glu Ile Gly Ser Ile Asn Leu Lys Lys Asn Glu Pro Pro Leu280 285 290acc tgt cca tac agc ctg aag gcc aga gtt ctt tta ctg tct cat ctt966Thr Cys Pro Tyr Ser Leu Lys Ala Arg Val Leu Leu Leu Ser His Leu295 300 305gct aga atg aaa att cct gag aca ctg gaa gaa gat caa cag ttc atg1014Ala Arg Met Lys Ile Pro Glu Thr Leu Glu Glu Asp Gln Gln Phe Met3l0 315 320 325ctg aaa aaa tgt cct gct ctg ctt caa gaa atg gtt aat gta atc tgc1062Leu Lys Lys Cys Pro Ala Le u Leu Gln Glu Met Val Asn Val Ile Cys330 335 340cag cta ata ata atg gcc cgg ggc cgt gaa gaa agg gag ttt cgt gct1110Gln Leu Ile Ile Met Ala Arg Gly Arg Glu Glu Arg Glu Phe Arg Ala345 350 355cca act ttg gca tcc tta gaa aac tgt atg aag ctt tcc cag atg gct1158Pro Thr Leu Ala Ser Leu Glu Asn Cys Met Lys Leu Ser Gln Met Ala360 365 370gtt cag ggg ctc cag cag ttt aag tct ccc ctt ctg cag ctc cct cat1206Val Gln Gly Leu Gln Gln Phe Lys Ser Pro Leu Leu Gln Leu Pro His
375 380 385att gaa gag gac aat ctt agg aga gtt tcg aat cat aaa aag tac aaa1254Ile Glu Glu Asp Asn Leu Arg Arg Val Ser Asn His Lys Lys Tyr Lys390 395 400 405att aaa act atc cag gat ttg gtt agt tta aaa gaa tca gat cgt cat1302Ile Lys Thr Ile Gln Asp Leu Val Ser Leu Lys Glu Ser Asp Arg His410 415 420agt ctg cta cac ttc ctt gaa gat gaa aag tat gaa gag gtc atg gcg1350Ser Leu Leu His Phe Leu Glu Asp Glu Lys Tyr Glu Glu Val Met Ala425 430 435gtc ctt ggg agt ttc ccg tat gtg acc atg gac ata aaa tca cag gtc1398Val Leu Gly Ser Phe Pro Tyr Val Thr Met Asp Ile Lys Ser Gln Val440 445 450ttg gat gat gaa gat agc aac aac atc aca gta gga tcc cta gtt aca1446Leu Asp Asp Glu Asp Ser Asn Asn Ile Thr Val Gly Ser Leu Val Thr455 460 465gtg ttg gtt aag ttg acg agg cag acc atg gct gaa gtg ttt gaa aag1494Val Leu Val Lys Leu Thr Arg Gln Thr Met Ala Glu Val Phe G1u Lys470 475 480 485gag cag tcc atc tgc gcc gct gag gag cag ccc aca gaa gac ggg cag1542Glu Gln Ser Ile Cys Ala Ala Glu Glu Gln Pro Thr Glu Asp Gly Gln490 495 500agt gat gcc aac aag atc aag gca aaa gga gga tgg cag cag aag aac1590Ser Asp Ala Asn Lys Ile Lys Ala Lys Gly Gly Trp Gln Gln Lys Asn505 510 515aaa gga ccc aag aaa atg ccc aaa tcc aaa aaa aag aag cct tta aaa1638Lys Gly Pro Lys Lys Met Pro Lys Ser Lys Lys Lys Lys Pro Leu Lys520 525 530aag aaa ccc aca act gta ccc tta cct cag gca aag cag cag aag caa1686Lys Lys Pro Thr Thr Val Pro Leu Pro Gln Ala Lys Gln Gln Lys Gln535 540 545aag caa gca aat gga gtt gtt ggg agt gaa gct gca ata aag gag gaa1734Lys Gln Ala Asn Gly Val Val Gly Ser Glu Ala Ala Ile Lys Glu Glu550 555 560 565gaa gac gac att tct gac aag ggc agt gat tct gaa gag gaa gaa acc1782Glu Asp Asp Ile Ser Asp Lys Gly Ser Asp Ser Glu Glu Glu Glu Thr570 575 580aat aga gat tct cag agt gag aaa gaa gat ggt agt gac agg gag tct1830Asn Arg Asp Ser Gln Ser Glu Lys Glu Asp Gly Ser Asp Arg Glu Ser585 590 595gat aga gag caa gat gag aaa caa agc aaa gat gat gaa gca gag tgg1878Asp Arg Glu Gln Asp Glu Lys Gln Ser Lys Asp Asp Glu Ala Glu Trp600 605 610caa gag tta caa cag agt ata cag agg aaa gag aga gct ctt ctg gag1926Gln Glu Leu Gln Gln Ser Ile Gln Arg Lys Glu Arg Ala Leu Leu Glu615 620 625acc aag tca aag ata aca cac cct gtc tat agt ctc tac ttt cct gag1974Thr Lys Ser Lys Ile Thr His Pro Val Tyr Ser Leu Tyr Phe Pro Glu630 635 640 645gaa aaa caa gag tgg tgg tgg ctt tat att gca gat agg gaa gaa caa2022Glu Lys Gln Glu Trp Trp Trp Leu Tyr Ile Ala Asp Arg Glu Glu Gln
650 655 660aca tta ata tcc atg cca tat cat gtg tgc aca ctg aag gat aca gaa2070Thr Leu Ile Ser Met Pro Tyr His Val Cys Thr Leu Lys Asp Thr Glu665 670 675gag gta gaa ctg aag ttt ccc gca ccc ggc aag cct gga aat tat cag2118Glu Val Glu Leu Lys Phe Pro Ala Pro Gly Lys Pro Gly Asn Tyr Gln680 685 690tat aca gtg ttc ctg aga tca gac tcc cat atg ggc ttg gac cag att2166Tyr Thr Val Phe Leu Arg Ser Asp Ser His Met Gly Leu Asp Gln Ile695 700 705aaa cca ctg aag ttg gaa gtt cat gag gcc aag cct gtg cca gaa aac2214Lys Pro Leu Lys Leu Glu Val His Glu Ala Lys Pro Val Pro Glu Asn710 715 720 725cac cca cag tgg gac acg gcg ata gaa ggt gac gaa gac cag gaa gac2262His Pro Gln Trp Asp Thr Ala Ile Glu Gly Asp Glu Asp Gln Glu Asp730 735 740agt gaa gga ttt gaa gac agc ttt gag gaa gag gag gag gaa gag gaa2310Ser Glu Gly Phe Glu Asp Ser Phe Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu745 750 755ggt gga gac taa cccgagtgag tggactacag cgtttgcaca tccttgcaaa2362Gly Gly Asp760cattgctgct ctgtgagagg tcataaagca gcagcagtga gggctgatat ggagggaagg 2422gttgccgact ttactagaaa cggatgcaaa aaagaggccg ctggtgccag ggtacgatct 2482gaaaagggtt tttaaagcct ttcaggtatg gggtggtgcg tttatctcat ctgcaaatga 2542taataaatcc tttgatgttc caactgtcca aaaaaaaana aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2602aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa2631<210>2<211>760<212>PRT<213>小鼠(Mus musculus)<400>2Met Ala Gly Gln Gln Phe Gln Tyr Asp Asp Ser Gly Asn Thr Phe Phe1 5 10 15Tyr Phe Leu Thr Ser Phe Val Gly Leu Ile Val Ile Pro Ala Thr Tyr20 25 30Tyr Leu Trp Pro Arg Asp Gln Asn Ala Glu Gln Ile Arg Leu Lys Asn35 40 45Ile Arg Lys Val Tyr Gly Arg Cys Met Trp Tyr Arg Leu Arg Leu Leu50 55 60Lys Pro Gln Pro Asn Ile Ile Pro Thr Val Lys Lys Ile Val Leu Leu65 70 75 80Ala Gly Trp Ala Leu Phe Leu Phe Leu Ala Tyr Lys Val Ser Lys Thr85 90 95Asp Arg Glu Tyr Gln Glu Tyr Asn Pro Tyr Glu Val Leu Asn Leu Asp100 105 110Pro Gly Ala Thr Val Ala Glu Ile Lys Lys Gln Tyr Arg Leu Leu Ser115 120 125
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530 535 540Lys Gln Gln Lys Gln Lys Gln Ala Asn Gly Val Val Gly Ser Glu Ala545 550 555 560Ala Ile Lys Glu Glu Glu Asp Asp Ile Ser Asp Lys Gly Ser Asp Ser565 570 575Glu Glu Glu Glu Thr Asn Arg Asp Ser Gln Ser Glu Lys Glu Asp Gly580 585 590Ser Asp Arg Glu Ser Asp Arg Glu Gln Asp Glu Lys Gln Ser Lys Asp595 600 605Asp Glu Ala Glu Trp Gln Glu Leu Gln Gln Ser Ile Gln Arg Lys Glu610 615 620Arg Ala Leu Leu Glu Thr Lys Ser Lys Ile Thr His Pro Val Tyr Ser625 630 635 640Leu Tyr Phe Pro Glu Glu Lys Gln Glu Trp Trp Trp Leu Tyr Ile Ala645 650 655Asp Arg Glu Glu Gln Thr Leu Ile Ser Met Pro Tyr His Val Cys Thr660 665 670Leu Lys Asp Thr Glu Glu Val Glu Leu Lys Phe Pro Ala Pro Gly Lys675 680 685Pro Gly Asn Tyr Gln Tyr Thr Val Phe Leu Arg Ser Asp Set His Met690 695 700Gly Leu Asp Gln Ile Lys Pro Leu Lys Leu Glu Val His Glu Ala Lys705 710 715 720Pro Val Pro Glu Asn His Pro Gln Trp Asp Thr Ala Ile Glu Gly Asp725 730 735Glu Asp Gln Glu Asp Ser Glu Gly Phe Glu Asp Ser Phe Glu Glu Glu740 745 750Glu Glu Glu Glu Glu Gly Gly Asp755 760<210>3<211>22<212>DNA<213>小鼠(Mus musculus)<400>3gtcttctgtg ggctgctcct ca 22<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>寡核苷酸<400>4tgaggagcag cccacagaag ac 22<210>5
<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>5aaagaattca tggcgggcca gcagttccag tacg 34<210>6<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>6aaactcgagt gtctccacct tcctcttcct cc 32<210>7<211>17<212>PRT<213>小鼠(Mus musculus)<400>7Glu Ser Arg Lys Asn Trp Glu Glu Phe Gly Asn Pro Asp Gly Pro Gln1 5 10 15Ala<210>8<211>17<212>PRT<213>小鼠(Mus musculus)<400>8Ser Glu Lys Glu Asp Gly Ser Asp Arg Glu Ser Asp Arg Glu Gln Asp1 5 10 15Glu
權(quán)利要求
1.一種EMO-1基因的用途，其特征在于，它被用作促進(jìn)胚泡著床的促進(jìn)劑。
2.一種EMO-1基因的用途，其特征在于，它被用于制備促進(jìn)胚泡著床的藥物。
3.一種EMO-1拮抗劑的用途，其特征在于，它被用作體外抑制胚泡著床的抑制劑。
4.一種EMO-1拮抗劑的用途，其特征在于，它被用于制備抑制胚泡著床的藥物。
5.如權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，所述的藥物為避孕藥。
6.如權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，所述的拮抗劑是EMO-1的反義核酸或抗EMO-1多肽的抗體。
7.一種EMO-1激動劑的用途，其特征在于，它被用作體外促進(jìn)胚泡著床的促進(jìn)劑。
8.一種EMO-1激動劑的用途，其特征在于，它被用于制備促進(jìn)胚泡著床的藥物。
9.一種確定測試化合物是否是EMO-1的拮抗劑或激動劑的方法，其特征在于，它包括步驟(a)將測試化合物和EMO-1多肽加入體外培養(yǎng)的胚泡作為測試組，并將EMO-1多肽加入體外培養(yǎng)的胚泡作為對照組；(b)觀察測試組和對照組胚泡著床情況，如果測試組的胚泡著床數(shù)量大于對照組，則表示測試化合物是EMO-1的激動劑；如果測試組的胚泡著床數(shù)量小于對照組，則表示測試化合物是EMO-1的拮抗劑。
10.一種藥物組合物，其特征在于，它含有安全有效量的EMO-1多肽、其激動劑或其拮抗劑以及藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種胚泡著床相關(guān)因子－EMO－1。EMO－1因子具有促進(jìn)胚泡著床的功能，而EMO－1的反義核酸及其多肽抗體可抑制胚泡著床。本發(fā)明還公開了利用這種EMO－1因子篩選促進(jìn)或抑制胚泡著床的化合物的方法。
文檔編號A61P15/18GK1769449SQ200410067768
公開日2006年5月10日 申請日期2004年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月3日
發(fā)明者劉承權(quán), 袁瑤, 王健, 王忠興 申請人:上海市計劃生育科學(xué)研究所