專利名稱：大鼠骨髓msc體內(nèi)移植定向分化為視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)定向分化為視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的方法。
背景技術(shù)：
視網(wǎng)膜疾病占重癥眼病的一半以上，因而自身修復(fù)效果往往不好，對(duì)于較輕的視網(wǎng)膜損傷目前主要采取抗炎治療或營(yíng)養(yǎng)因子治療，而對(duì)重度損傷迄今尚無很好的治療方法，主要是玻璃體止血、促進(jìn)凝血的吸收。許多病例由于未能及時(shí)治療或無藥可就而導(dǎo)致視力下降甚至失明，因此尋找更好的治療方法對(duì)于治療視網(wǎng)膜疾病至關(guān)重要。
干細(xì)胞工程的研究為視網(wǎng)膜損傷的治療提供了一種新的途徑。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)，是在骨髓中類似成纖維細(xì)胞的一類細(xì)胞，具有多方向分化潛能，可以向多種組織細(xì)胞轉(zhuǎn)化。自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞還具有取材方便、無免疫原性、具有多向分化潛能、合乎倫理學(xué)要求并且無致瘤性，具有其它干細(xì)胞不可比擬的優(yōu)勢(shì)。
由于視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)復(fù)雜、組成細(xì)胞種類多，加之此處為免疫赦免區(qū)，血液內(nèi)的干細(xì)胞很難達(dá)到。即使骨髓內(nèi)的干細(xì)胞、具有分化為視網(wǎng)膜的能力也很難達(dá)到損傷部位。因此，探討MSCs向視網(wǎng)膜細(xì)胞誘導(dǎo)分化條件及細(xì)胞移植方式將對(duì)損傷視網(wǎng)膜的修復(fù)治療具有深遠(yuǎn)意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了提供一種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)移植定向分化為視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的方法。采用以下技術(shù)方案1)從大鼠骨髓中分離出的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)進(jìn)行定向誘導(dǎo)分化的方案，其特征在于利用特定的細(xì)胞密度(2×105/mL)進(jìn)行體內(nèi)移植；2)將MSCs移植到大鼠體內(nèi)，其特征在于移植時(shí)使用的體積為10μL/眼，采用單點(diǎn)注射；3)將MSCs移植到大鼠體內(nèi)，其特征在于注射方式為視網(wǎng)膜下移植；4)將MSCs移植到大鼠體內(nèi)，其特征在于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在原位分化成的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)包括視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、視錐、視桿細(xì)胞、雙極細(xì)胞及節(jié)細(xì)胞。
本發(fā)明的內(nèi)容未公開發(fā)表，本領(lǐng)域的技術(shù)人員如不花費(fèi)創(chuàng)造性勞動(dòng)根本不能根據(jù)現(xiàn)有的技術(shù)推斷得到本發(fā)明的分離方法。
具體實(shí)施例方式
1.大鼠MSCs的體外培養(yǎng)(全過程注意無菌操作，戴滅菌手套)6周齡雄性大鼠斷頸處死，75％酒精中浸泡1min，于超凈臺(tái)內(nèi)消毒腰盤中剝?nèi)ゴ笫笃?，做MSCs的分離培養(yǎng)，具體步驟為①去雙側(cè)股骨，剝凈上面的肌肉，用D-Hank’s液沖洗；②將兩頭的關(guān)節(jié)面小心橫斷切開，用注射器帶9號(hào)針頭吸取2mL含10％胎牛血清(Hyclone)的低糖DMEM插入骨髓腔沖洗；③如此反復(fù)沖洗4-5遍，1500rpm×5min離心收集細(xì)胞，用培養(yǎng)液洗滌一次，離心；④現(xiàn)配Percoll將骨髓細(xì)胞重懸于2-3mL培養(yǎng)液中，3000rpm×30min離心，吸取界面上的細(xì)胞層(其中含有紅細(xì)胞，界面呈淺紅色)，用培養(yǎng)液稀釋至5mL，1500rpm×5min離心收集細(xì)胞；⑤以2.3×105cell/well接種于Φ30mm的塑料平皿中。
2.視網(wǎng)膜下移植治療并觀察MSCs移植均采取如下方法①細(xì)胞經(jīng)0.25％胰酶消化，至終濃度為2×105/mL，用50μL微量注射器吸取10μL備用；②大鼠(♀)于麻醉后即刻沿結(jié)膜顳側(cè)邊緣1mm處剪開約1/2，以能夠暴露顳側(cè)眼球?yàn)闇?zhǔn)；③用6.5號(hào)針頭斜向插入顳側(cè)鞏膜，再將吸取細(xì)胞的微量注射器的針頭沿外切方向插入此孔，針面對(duì)準(zhǔn)視網(wǎng)膜，輕輕將細(xì)胞液體注入到視網(wǎng)膜下，滴加抗生素類眼藥防止外傷感染。
3.大鼠Y染色體sry基因的獲得及sry基因探針標(biāo)記①設(shè)計(jì)針對(duì)大鼠sry基因的擴(kuò)增引物根據(jù)文獻(xiàn)確定sry基因兩端引物為primer 15′-AGA TCT TGA TTT TTA GTG TTC-3′primer 25′-TGC AGC TCT ACT CCA GTC TTG-3′②從雄性大鼠腎臟提取基因組DNA，利用PCR擴(kuò)增sry基因片段；
③sry探針的DIG標(biāo)記應(yīng)用PCR DIG probc synthesis kit(Rochc，cat#1 636 090)對(duì)探針進(jìn)行PCR方法的DIG標(biāo)記，利用Roche High Pure PCR product purification kit回收；④組織切片的檢測(cè)將組織切片先行HE染色，觀察其結(jié)構(gòu)，進(jìn)行掃描式的切片進(jìn)行原位DNA雜交檢測(cè)。
結(jié)果在正常大鼠注射MSCs組各層均發(fā)現(xiàn)sry雜交陽性細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)與各層細(xì)胞相符。
權(quán)利要求
1.一種富集大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為原代至2代細(xì)胞。
2.按權(quán)利要求1的分離方法分離出的細(xì)胞在體內(nèi)進(jìn)行定向誘導(dǎo)分化的方案，其特征在于以特定的細(xì)胞密度及注射體積進(jìn)行移植。
3.按權(quán)利要求2的方法將分離出的細(xì)胞在體內(nèi)進(jìn)行定向誘導(dǎo)分化的方案，其特征在于注射方式為視網(wǎng)膜下注射。
4.按權(quán)利要求3的方法將分離出的細(xì)胞在體內(nèi)進(jìn)行定向誘導(dǎo)分化的方案，其特征在于使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在原位分化為視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)(包括視錐、視桿細(xì)胞、雙極細(xì)胞及節(jié)細(xì)胞)。
全文摘要
本發(fā)明為大鼠骨髓MSCs體內(nèi)移植定向分化為視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的方法。本發(fā)明的目的是提供一種將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植于視網(wǎng)膜下并在原位分化為視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案分離出的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)進(jìn)行定向誘導(dǎo)分化的方案，其特征在于利用特定的細(xì)胞密度和注射方式使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在原位分化為視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)(包括視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、視錐、視桿細(xì)胞、雙極細(xì)胞及節(jié)細(xì)胞)。本發(fā)明提供了神經(jīng)細(xì)胞缺失后的補(bǔ)充來源，為臨床研制視網(wǎng)膜損傷修復(fù)供體奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)A61F2/14GK1611597SQ20031010339
公開日2005年5月4日 申請(qǐng)日期2003年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月31日
發(fā)明者裴雪濤, 張 杰, 單清, 錢煥文, 馬萍 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所