專利名稱：中藥誘導骨髓間質細胞分化為神經(jīng)元樣細胞的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種骨髓間質細胞的定向分化技術。
骨髓間質細胞(mesenchymal stem cell MSC)屬于成體干細胞(AdultStem cell AS細胞)，它具有自我更新，高度增殖和多向分化潛能，它除具有向中胚層來源的組織，如軟骨、骨、肌、肌腱和脂肪等組織分化外，還可跨胚層分化，向內(nèi)胚層神經(jīng)外胚層來源的組織，如肝、肺和神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞分化。由于MSC取材方便，可大量擴增，而且自身移植可避免免疫排斥反應。故成為組織工程中理想的種子細胞。如果在體外用特殊方法誘導MSC定向向某種組織細胞分化后進行移植。用于治療某些疾病，如軟骨、骨、肌肉及肌腱缺損，帕金森氏病、老年性癡呆、中風和脊髓損傷等疾病有重要意義。目前國內(nèi)外大都采用β-羥基醇、二甲基亞酚、丁羥基茴謎和維生素A酸等體外誘導MCE向神經(jīng)元分化。而用中藥或中藥有效成分誘導間質細胞向神經(jīng)元分化的技術未見深入研究。
本發(fā)明的目的是研究能誘導間質細胞向神經(jīng)元分化的中藥及用中藥或中藥有效成分誘導MCE向神經(jīng)元分化的技術，為將來治療中樞神經(jīng)損傷，如帕金森氏病、老年性癡呆、中風、腦缺血和脊髓損傷等疾病奠定基礎。
三七總皂甙是從五加科人參屬植物三七根提取的有效成分，而川芎嗪提取的一種生物堿單體，主要成分是四甲基比嗪，它們都是治療心腦血管疾病的傳統(tǒng)中藥，具有活血祛瘀，通脈止血。對受損的視神經(jīng)和脊髓具有保護作用。
本發(fā)明提出用中藥三七總皂甙或川芎嗪等中藥成分，在體外誘導骨髓間質細胞向神經(jīng)元分化的方法，其中包括bFGF預誘導和定向誘導MSC向神經(jīng)元樣細胞分化兩個步驟(1)bFGF預誘導用含有胚牛血清和bFGF的低糖DMEM培養(yǎng)；(2)定向誘導MSC向神經(jīng)元樣細胞分化用含有中藥成分的無血清低糖DMEM中誘導。
其中，bFGF預誘導步驟為用5代以后的MSC以1～3×105/ml接種到6孔培養(yǎng)板中，用含有5～15％胚牛血清和5～15ng/ml的bFGF的低糖DMEM培養(yǎng)12～48h。
定向誘導MSC向神經(jīng)元樣細胞分化步驟為用含有中藥成分的無血清低糖DMEM中誘導0.5～8h。
所述的中藥成分為三七總皂甙或川芎嗪。
三七總皂甙的濃度為0.1～0.5mg/ml。川芎嗪的濃度為0.05～2mg/ml。
本發(fā)明的優(yōu)點在于1、高效 免疫組織化學檢測約有75％左右細胞呈神經(jīng)元樣細胞特異性標記陽性，但不表達膠質細胞特異性標記，表明該中藥中誘導MSC向神經(jīng)元樣細胞分化。
2、安全性好 由于分化后的細胞貼壁生長，向來分化的細胞培養(yǎng)一段時間后，死亡或生理狀態(tài)不佳易于被PBS沖洗去掉。此外，分化后的細胞只含神經(jīng)元樣細胞，不含神經(jīng)膠質樣細胞。將來用于移植時，可免除形成膠質細胞疤痕之憂。
3、來源豐富經(jīng)濟 三七總皂甙和川芎嗪均是臨床常用治療心腦血管和中樞神經(jīng)損傷疾患的藥物，來源豐富、價廉、副作用少。
下面給出實施例。
(1)bFGF預誘導用5代以后的MSC以1～3×105/ml接種到6孔培養(yǎng)板中，用含有5～15％胚牛血清和5～15ng/ml的bFGF的低糖DMEM培養(yǎng)12～48h。
(2)定向誘導MSC向神經(jīng)元樣細胞分化用含有0.1～0.5mg/ml的三七總皂甙或0.05～2mg/ml的川芎嗪的無血清低糖DMEM中誘導0.5～8h，間質干細胞胞體增大，伸出細長突起，部分突起交織成網(wǎng)，免疫組織化學顯示這些細胞均呈神經(jīng)元特異性標記，如神經(jīng)絲蛋白(NF-M)，神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)，微管相關蛋白-2(MAP-2)和巢蛋白(nestin)陽性，而神經(jīng)膠質細胞特異性標記，如膠質纖維酸性蛋白(GFAP)則呈陰性。
權利要求
1.一種中藥誘導骨髓間質細胞分化為神經(jīng)元樣細胞的方法，其特征在于包括bFGF預誘導和定向誘導MSC向神經(jīng)元樣細胞分化兩個步驟(1)bFGF預誘導用含有胚牛血清和bFGF的低糖DMEM培養(yǎng)；(2)定向誘導MSC向神經(jīng)元樣細胞分化用含有中藥成分的無血清低糖DMEM中誘導。
2.根據(jù)權利要求1所述的中藥誘導骨髓間質細胞分化為神經(jīng)元樣細胞的方法，其特征在于bFGF預誘導步驟為用5代以后的MSC以1～3×105/ml接種到6孔培養(yǎng)板中，用含有5～15％胚牛血清和5～15ng/ml的bFGF的低糖DMEM培養(yǎng)12～48h。
3.根據(jù)權利要求1所述的中藥誘導骨髓間質細胞分化為神經(jīng)元樣細胞的方法，其特征在于定向誘導MSC向神經(jīng)元樣細胞分化步驟為用含有中藥成分的無血清低糖DMEM中誘導0.5～8h。
4.根據(jù)權利要求3所述的中藥誘導骨髓間質細胞分化為神經(jīng)元樣細胞的方法，其特征在于所述的中藥成分為三七總皂甙或川芎嗪。
5.根據(jù)權利要求4所述的中藥誘導骨髓間質細胞分化為神經(jīng)元樣細胞的方法，其特征在于三七總皂甙的濃度為0.1～0.5mg/ml；川芎嗪的濃度為0.05～2mg/ml。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種骨髓間質細胞的定向分化技術。本技術包括bFGF預誘導和定向誘導MSC向神經(jīng)元樣細胞分化兩個步驟(1)bFGF預誘導用含有胚牛血清和bFGF的低糖DMEM培養(yǎng)；(2)定向誘導MSC向神經(jīng)元樣細胞分化用含有中藥成分的無血清低糖DMEM中誘導。本發(fā)明具有高效、安全性好、來源豐富經(jīng)濟等優(yōu)點。
文檔編號C12N5/08GK1410530SQ0213498
公開日2003年4月16日 申請日期2002年10月18日 優(yōu)先權日2002年10月18日
發(fā)明者李海標, 撒亞蓮 申請人:中山大學