專利名稱：用于傳遞治療劑的以環(huán)糊精為基礎(chǔ)的聚合物的制作方法
背景技術(shù)：
由于其不良的藥理學(xué)性質(zhì)，一些小分子治療劑如喜樹堿的藥物傳遞一直都很成問題。這些治療劑的水溶性通常很低，其生物活性形式與無活性的形式之間存在平衡，或者這些物質(zhì)的高全身濃度會導(dǎo)致毒副作用。解決其傳遞問題的一些方法是將所說的物質(zhì)直接與水溶性聚合物如甲基丙烯酸羥丙基酯(HPMA)、聚乙二醇和聚-L-谷氨酸軛合到一起。在一些情況中，該類軛合物已經(jīng)成功增溶或穩(wěn)定了所說治療劑的生物活性形式，或者得到了避免了與該物質(zhì)的高全身濃度有關(guān)的并發(fā)癥的緩釋制劑。
解決藥物傳遞問題的另一種方法是在治療劑和環(huán)糊精或其衍生物之間形成主體/客體包合物復(fù)合體。環(huán)糊精(α、β、γ)以及其氧化形式具有獨(dú)特的物理-化學(xué)性質(zhì)如良好的水溶性、低毒性和低免疫響應(yīng)性。迄今為止，用環(huán)糊精進(jìn)行的大多數(shù)藥物傳遞研究一至聚焦于其形成超分子復(fù)合體的能力，其中環(huán)糊精與治療劑分子形成主體/客體包合物復(fù)合體并且從而改變了這些客體分子的物理、化學(xué)和/或生物學(xué)性質(zhì)。
US 5,276,088描述了一種通過將聚乙烯醇或纖維素或其衍生物與環(huán)糊精衍生物進(jìn)行反應(yīng)或者通過環(huán)糊精衍生物與醋酸乙烯酯或甲基丙烯酸甲酯的共聚反應(yīng)來合成包含環(huán)糊精的聚合物的方法。
US 5,855,900描述了一種可生物降解的包含環(huán)糊精的聚合物。該專利公開了一種超分子結(jié)構(gòu)可生物降解的聚合集合體，其包含多種藥物修飾的α、β、γ-環(huán)糊精和穿過環(huán)糊精結(jié)構(gòu)空穴的線性聚合鏈。
不斷需要傳遞藥理學(xué)性質(zhì)差的小分子治療劑如喜樹堿、紫杉醇、阿霉素和環(huán)孢菌素A的新方法。
本發(fā)明的概述本發(fā)明涉及作為傳遞治療劑的載體的新型聚合物軛合物的組合物，其被定義為與治療劑/生物活性劑共價偶聯(lián)的聚合材料。一方面，本發(fā)明提供了水溶性的生物相容性聚合物軛合物，其含有通過可以在生理學(xué)條件下裂解從而釋放生物活性部分的連接與生物活性部分共價連接的水溶性的生物相容性聚合物。在某些該類實(shí)施方案中，該聚合物包含與連接基部分交替的環(huán)狀部分，所說的連接基部分將所說的環(huán)狀結(jié)構(gòu)連接到例如直鏈或支鏈聚合物上，優(yōu)選將其連接到直鏈聚合物上。該聚合物可以是一種聚陽離子、聚陰離子或非離子聚合物。生物活性劑可以是一種治療劑、診斷劑或助劑，優(yōu)選其占所說軛合物的至少5％、10％、15％、20％、25％、30％或甚至35％重量。在某些實(shí)施方案中，藥物的釋放速率主要取決于水解速率。在某些其它實(shí)施方案中，藥物釋放速率主要取決于酶解。
本發(fā)明提供了用于這些治療劑的藥物傳遞的包含環(huán)糊精的高分子化合物。本發(fā)明還提供了用于控制藥物傳遞的化合物，其能以靶向的、可預(yù)測的和受控的速率釋放治療劑。
因此，本發(fā)明的一個方面是一種包含環(huán)糊精部分、治療劑、以及任選的配體靶向劑的聚合物軛合物。該聚合物可以是直鏈或支鏈的，并且可以通過包含環(huán)糊精的單體的縮聚反應(yīng)、一種或多種包含環(huán)糊精的單體和一種或多種不包含環(huán)糊精部分的共聚單體之間的共聚反應(yīng)來形成。此外，本發(fā)明還考慮通過將環(huán)糊精部分接枝到已經(jīng)形成的聚合物上所形成的包含環(huán)糊精的聚合物。本發(fā)明所考慮的環(huán)糊精部分非限制性地包括α、β和γ環(huán)糊精以及其氧化形式。根據(jù)所需的藥物/聚合物比例，該治療劑可以在聚合步驟前通過任選的連接基被連接到單體上，或者可以隨后通過一種任選的連接基被接枝到該聚合物上。同樣，該靶向配體可以在聚合步驟之前通過一種任選的連接基被連接到一種單體上，或者可以隨后通過一種任選的連接基被接枝到該聚合物上，或者可以以包合復(fù)合體或主體-客體相互作用的形式被連接到該聚合物上。
為了進(jìn)行進(jìn)一步說明，本發(fā)明的一個實(shí)施方案是式I所示的高分子化合物 其中P表示直鏈或支鏈的聚合物鏈；CD表示環(huán)狀部分如環(huán)糊精部分；L1、L2和L3每次出現(xiàn)時可以各自獨(dú)立地不存在或表示連接基基團(tuán)；D每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示治療劑或其前體藥物；T每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示靶向配體或其前體；a、m和v每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示1至10的整數(shù)(優(yōu)選1至8，1至5，或甚至1至3)；b表示1至約30,000(優(yōu)選＜25,000、＜20,000、＜15,000、＜10,000、＜5,000、＜1,000、＜500、＜100、＜50、＜25、＜10，或甚至＜5)的整數(shù)；和n和w每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示0至約30,000(優(yōu)選＜25,000、＜20,000、＜15,000、＜10,000、＜5,000、＜1,000、＜500、＜100、＜50、＜25、＜10，或甚至＜5)的整數(shù)，其中該聚合物鏈包含環(huán)糊精部分或n至少是1。
本發(fā)明的另一個實(shí)施方案是式II所示的化合物 其中P表示聚合物的單體單元；T每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示靶向配體或其前體；L6、L7、L8、L9和L10每次出現(xiàn)時可以各自獨(dú)立地不存在或表示連接基基團(tuán)；CD每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示環(huán)狀部分如環(huán)糊精部分或其衍生物；D每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示治療劑或其前體藥物形式；m每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示1至10(優(yōu)選1至8，1至5，或甚至1至3)的整數(shù)；o表示1至約30,000(優(yōu)選＜25,000、＜20,000、＜15,000、＜10,000、＜5,000、＜1,000、＜500、＜100、＜50、＜25、＜10，或甚至＜5)的整數(shù)；和p、n和q每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示0至10(優(yōu)選0至8，0至5，0至3，或甚至0至約2)的整數(shù)，其中CD和D優(yōu)選各自存在于該化合物的至少1個位置(優(yōu)選至少5、10、25、50或甚至＞100個位置)上。
本發(fā)明的另一個實(shí)施方案是式III所示的化合物 其中CD表示環(huán)狀部分如環(huán)糊精部分或其衍生物；L4、L5、L6和L7每次出現(xiàn)時可以各自獨(dú)立地不存在或表示連接基基團(tuán)；D和D′每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示相同或不同的治療劑或其前體藥物；T和T′每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示相同或不同的靶向配體或其前體；f和y每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示1至10(優(yōu)選1至8，1至5，或甚至1至3)的整數(shù)；g和z每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示0至10(優(yōu)選0至8，0至5，0至3，或甚至0至約2)的整數(shù)；和h表示1至30,000(優(yōu)選＜25,000、＜20,000、＜15,000、＜10,000、＜5,000、＜1,000、＜500、＜100、＜50、＜25、＜10，或甚至＜5)的整數(shù)，其中出現(xiàn)至少一次(并且優(yōu)選出現(xiàn)至少5、10或甚至至少20、50或＞100次)的g表示大于0的整數(shù)。
本發(fā)明另一方面是一種制備這里所描述的包含環(huán)糊精的治療性聚合軛合物的方法。
本發(fā)明另一方面是一種包含上面所討論的化合物或聚合物的藥物組合物。
本發(fā)明另一方面是一種包含這里所討論的聚合軛合物的藥物劑型。
本發(fā)明另一方面是一種對個體進(jìn)行治療的方法，其包括施用治療有效量的本文所述的任何聚合軛合物。
本發(fā)明另一方面是一種實(shí)施藥學(xué)商務(wù)的方法，其包括制造、許可或分銷包含或涉及本文所述的任何聚合軛合物的試劑盒。
在某些實(shí)施方案中，當(dāng)被體內(nèi)應(yīng)用時，這些治療性聚合物軛合物改善了這些治療劑的藥物穩(wěn)定性和/或溶解度。此外，通過從各種連接基基團(tuán)中進(jìn)行選擇，該聚合物軛合物給出了控制治療劑和/或生物活性劑的釋放或改善治療劑/生物活性劑的體內(nèi)安全性和/或治療效力的方法。在某些實(shí)施方案中，該聚合物軛合物是可生物侵蝕的或可生物降解的。
附圖簡要說明

圖1顯示了改變聚合物軛合物以協(xié)調(diào)其特性的策略。
圖2證明了肽系鏈長度(tether length)對負(fù)載藥物CD的聚合物的藥物釋放速率的影響。
圖3給出了系鏈的(tethering)喜樹堿對增強(qiáng)喜樹堿穩(wěn)定性，例如抑制內(nèi)酯開環(huán)作用的影響。
圖4表明了在pH 7.4 KH2PO4緩沖液中對內(nèi)酯開環(huán)作用進(jìn)行的研究。
圖5a和5b表明了通過調(diào)節(jié)聚合時間進(jìn)行的聚合控制。
圖6說明了在37℃下，在pH范圍為1.1至13.1的緩沖溶液中24小時后CPT從HG6和HGGG6的釋放。
圖7顯示了CD-BisCys-SS-Peg3400聚合物的降解HPLC分析。
圖8顯示了D5W、CPT、伊立替康、在其最高的無毒試驗(yàn)劑量(18mgCPT/kg)下的LGGG10、以及其它三種與高M(jìn)W聚合物的軛合物(HGGG6、HG6、HGGG10)在其MTD下在異種移植小鼠中腫瘤生長曲線與時間的函數(shù)關(guān)系。
圖9給出了HGGG6、HG6和HGGG10在異種移植小鼠中的腫瘤生長中值曲線。
圖10給出了各自以9mg CPT/kg給藥的LGGG10和HGGG10在異種移植小鼠中的腫瘤生長中值曲線。
圖11給出了D5W、CPT、伊立替康和三種包含高M(jìn)W聚合物的軛合物在其MTD下在異種移植小鼠中平均體重(MBW)損失與時間的關(guān)系圖。
圖12表明了CPT濃度(ng/mg組織)與異種移植小鼠腫瘤大小(mg)的相互關(guān)系。
發(fā)明詳述I.總述本發(fā)明涉及新型的用于傳遞治療劑的包含環(huán)糊精的治療性高分子化合物的組合物。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)被體內(nèi)應(yīng)用時，這些包含環(huán)糊精的聚合物改善了藥物穩(wěn)定性和/或溶解度和/或降低了毒性和/或改善了小分子治療劑的效力。在某些實(shí)施方案中，可以用該聚合物傳遞治療劑如喜樹堿、紫杉酚、阿霉素和兩性霉素。此外，通過對各種連接基基團(tuán)和/或靶向配體進(jìn)行選擇，可以減少藥物由該聚合物的釋放速率以控制傳遞。本發(fā)明還涉及用本文所述的治療組合物對個體進(jìn)行治療的方法。本發(fā)明還涉及用于進(jìn)行藥學(xué)商務(wù)的方法，其包括制造、許可或分銷包含或涉及本文所述的高分子化合物的試劑盒。
更一般地，本發(fā)明提供了水溶性的生物相容性聚合物軛合物，其含有通過可以在生理學(xué)條件下裂解從而釋放生物活性部分的連接與生物活性部分共價連接的水溶性的生物相容性聚合物。在某些該類實(shí)施方案中，該聚合物包含與連接基部分交替的環(huán)狀部分，所說的連接基部分將所說的環(huán)狀結(jié)構(gòu)連接到例如直鏈或支鏈聚合物上，優(yōu)選將其連接到直鏈聚合物上。該環(huán)狀部分可以是任何適宜的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，如環(huán)糊精、冠醚(例如，18-冠-6、15-冠-5、12-冠-4等等)、環(huán)狀寡肽(例如，包含5至10個氨基酸殘基)、穴狀配體或穴狀化合物(例如，穴狀配體[2.2.2]、穴狀配體-2，1，1、以及其復(fù)合體)、杯芳烴或cavitands或其任何組合。該環(huán)狀結(jié)構(gòu)優(yōu)選是(或者被改性成)水溶性的。在某些實(shí)施方案中，例如，在需要線性聚合物的情況中，對該環(huán)狀結(jié)構(gòu)進(jìn)行選擇從而使得在聚合條件下，各環(huán)狀結(jié)構(gòu)的恰好兩個部分可以與該連接基部分進(jìn)行反應(yīng)，從而使得所得的聚合物包含一系列交替的環(huán)狀部分和連接基部分(或基本上由其組成)，如至少四個各類型的部分。適宜的雙官能化環(huán)狀部分包括許多可以通過商業(yè)途徑獲得和/或可以用所公開的方案來制備的物質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，軛合物在水中可溶解至至少0.1g/mL，優(yōu)選至少0.25g/mL的濃度。
該聚合物可以是聚陽離子、聚陰離子或非離子聚合物。聚陽離子或聚陰離子聚合物具有至少一種分別帶有正電荷或負(fù)電荷的部位。在某些該類實(shí)施方案中，該連接基部分和環(huán)狀部分中的至少一種包含該類荷電部位，從而使得該部分每次出現(xiàn)時都包括荷電部位。
生物活性劑可以是治療劑、診斷劑或助劑(如放射致敏劑或單獨(dú)給藥沒有顯著活性但是可以增強(qiáng)另一種治療劑的活性的化合物)，其優(yōu)選占該軛合物的至少5％、10％、15％、20％、25％、30％或甚至35％重量。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將該聚合物給藥于患者使得可以在至少6小時，優(yōu)選至少12或18小時的時期內(nèi)釋放所說的生物活性劑。例如，該活性劑可以在6小時至一個月、6小時至兩周、6小時至3天等等的時間范圍內(nèi)被釋放。在某些實(shí)施方案中，藥物釋放的速率主要取決于水解速率(與酶解截然不同)，例如，在存在水解酶的情況下，釋放速率改變的因子小于5，優(yōu)選小2。在其它實(shí)施方案中，藥物的釋放速率可能主要取決于酶解速率。
本發(fā)明的聚合軛合物可用于改善生物活性劑/治療劑的溶解度和/或穩(wěn)定性、降低藥物-藥物相互作用、降低與包括血漿蛋白在內(nèi)的血液元素的相互作用、降低或消除免疫原性、保護(hù)所說的活性劑不被代謝、調(diào)控藥物釋放動力學(xué)、改善循環(huán)時間、改善藥物半衰期(例如，在血清或所選擇的組織，如腫瘤中的半衰期)、降低毒性、改善功效、將不同種屬、種族和/或人種個體之間的藥物代謝標(biāo)準(zhǔn)化和/或?yàn)樘囟ǖ募?xì)胞或組織提供靶向傳遞。溶解性差和/或有毒的化合物與其可以通過混入到本發(fā)明的高分子化合物中獲益。
II.定義(a)一般術(shù)語這里所用的術(shù)語‘助劑’是一種其本身幾乎沒有或沒有治療價值，但是增加了治療劑效力的化合物。助劑的實(shí)例包括放射致敏劑、轉(zhuǎn)染-增強(qiáng)劑(如氯奎以及其類似物)、趨化劑和化學(xué)引誘劑、調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附力和/或細(xì)胞運(yùn)動性的肽、細(xì)胞透化劑、多重耐藥性抑制劑和/或流出泵等等。
這里所用的術(shù)語“激動劑”指的是可以模擬或上調(diào)(例如，加強(qiáng)或補(bǔ)充)感興趣的蛋白的生物活性的物質(zhì)或有助于或可促進(jìn)(例如，加強(qiáng)或補(bǔ)充)多肽之間或多肽和另一種分子(例如，類固醇、激素、核酸、小分子等等)之間的相互作用的物質(zhì)。激動劑可以是一種野生型蛋白或其具有至少一種該野生型蛋白的生物活性的衍生物。激動劑還可以是可上調(diào)基因表達(dá)或增加蛋白的至少一種生物活性的小分子。激動劑還可以是可增加感興趣的多肽與另一種分子，例如，目標(biāo)肽或核酸之間的相互作用的蛋白或小分子。
這里所用的“拮抗劑”指的是可以下調(diào)(例如，禁止或抑制)感興趣的蛋白的生物活性的物質(zhì)或可抑制/禁止或降低(例如，去穩(wěn)定或減少)多肽或其它分子(例如類固醇、激素、核酸等等)之間的相互作用的物質(zhì)。拮抗劑還可以是可下調(diào)感興趣的基因的表達(dá)或降低野生型蛋白的存在量的化合物。拮抗劑還可以是可減少或抑制感興趣的多肽與另外的小分子，例如，目標(biāo)肽或核酸的相互作用的蛋白或小分子。
當(dāng)涉及聚合物時所用的術(shù)語“生物相容性聚合物”和“生物相容性”涉及現(xiàn)有技術(shù)中公認(rèn)的聚合物。例如，可生物降解的聚合物包括其本身對主體(例如，動物或人)無毒，也不會以在主體體內(nèi)產(chǎn)生毒性濃度的單體或寡聚子單元或其它副產(chǎn)品的速率降解(如果該聚合物降解的話)。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，生物降解一般包括聚合物在生物體中降解成例如已知實(shí)際上無毒的其單體子單元。但是，由該類降解產(chǎn)生的中間的寡聚產(chǎn)品可能具有不同的毒理學(xué)性質(zhì)，或者生物降解可能涉及產(chǎn)生除該聚合物的單體子單元之外的分子的氧化或其它生物化學(xué)反應(yīng)。因此，在某些實(shí)施方案中，可以在一種或多種毒性分析后確定用于體內(nèi)應(yīng)用，如植入或注射到患者體內(nèi)的可生物降解聚合物的毒性。任何主題組合物不一定都具有被認(rèn)為是生物相容性的100％的純度。因此，一種主題組合物可包含99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％、75％或甚至更少的生物相容性聚合物，例如，包括本文所述的聚合物和其它材料和賦形劑，并且仍然是生物相容性的。
為了確定一種聚合物或其它材料是否是生物相容性的，其必需進(jìn)行毒性分析。該類分析在現(xiàn)有技術(shù)中是眾所周知的。該類分析的一個實(shí)例可以使用活的癌細(xì)胞，如GT3TKB腫瘤細(xì)胞以下面的方式來進(jìn)行將樣品在37℃下在1M NaOH中降解至觀察到完全降解。然后，將該溶液用1M HCl中和。將約200μL各種濃度的降解了的樣品產(chǎn)物放置到96-孔組織培養(yǎng)板中并用人胃癌細(xì)胞(GT3TKB)以104/孔的密度對其接種。將該降解了的樣品產(chǎn)物與該GT3TKB細(xì)胞一起培養(yǎng)48小時?？梢杂孟鄬ιL％對組織培養(yǎng)孔中被降解的樣品的濃度對該分析的結(jié)果作圖。此外，還可以用眾所周知的用于證實(shí)其在皮下植入部位不會產(chǎn)生顯著水平的刺激或炎癥的體內(nèi)試驗(yàn)，例如皮下植入到大鼠體內(nèi)對來本發(fā)明的聚合物和制劑進(jìn)行評估。
術(shù)語“可生物降解的”在現(xiàn)有技術(shù)中是公知的，并且包括在應(yīng)用過程中會降解的聚合物、組合物和制劑，如本文所述的這些物質(zhì)?？缮锝到獾木酆衔镆话闩c不可生物降解的聚合物不同，前者可以在應(yīng)用期間降解。在某些實(shí)施方案中，該類使用涉及體內(nèi)應(yīng)用，如在體內(nèi)治療中的應(yīng)用，并且在其它某些實(shí)施方案中，該類應(yīng)用涉及體外應(yīng)用。一般而言，歸于生物降解的降解涉及可生物降解的聚合物降解成其組成子單元的降解，或消化，例如，該聚合物通過生物化學(xué)過程被降解成更小的非高分子的子單元的消化。在某些實(shí)施方案中，通?？梢源_定兩種不同類型的生物降解。例如，一種類型的生物降解可能涉及聚合物主鏈中鍵(不管是共價鍵還是其它鍵)的裂解。在該類生物降解中，一般產(chǎn)生單體和低聚物，并且更典型地，該類生物降解是通過連接聚合物的一個或多個子單元的鍵的裂解發(fā)生的。相反，另一種類型的生物降解可能涉及內(nèi)部至側(cè)鏈的或?qū)?cè)鏈連接到該聚合物主鏈上的鍵(不管是共價鍵還是其它鍵)的裂解。例如，通過生物降解可以將作為側(cè)鏈連接到該聚合物主鏈上的治療劑或其它化學(xué)部分釋放出來。在某些實(shí)施方案中，在聚合物的應(yīng)用過程中可能發(fā)生該生物降解的一種或另一種一般類型，或兩種同時發(fā)生。
這里所用的術(shù)語“生物降解”包括兩種一般類型的生物降解?？缮锝到獾木酆衔锏慕到馑俾食３２糠秩Q于各種因素，包括負(fù)責(zé)任何降解的鍵的化學(xué)特性、分子量、結(jié)晶性、生物穩(wěn)定性和該類聚合物的交聯(lián)程度、植入物的物理特性(例如，形狀和大小)和給藥的方式和位置。例如，分子量越高、結(jié)晶度越高和/或生物穩(wěn)定性越高，可生物降解的聚合物的生物降解通常就越慢。術(shù)語“可生物降解的”涵蓋了也被稱為“可生物侵蝕的”材料和方法。
在其中所說的可生物降解的聚合物還帶有治療劑或與其結(jié)合的其它材料的某些實(shí)施方案中，該類聚合物的生物降解速率的特征在于該類材料的釋放速率。在該類情況中，生物降解速率可能不僅取決于該聚合物的化學(xué)特性和物理特性，而且還取決于其中所包含材料的特性。該組合物的降解不僅包括分子內(nèi)鍵的裂解，例如通過氧化和/或水解進(jìn)行裂解，而且還包括分子間鍵的瓦解，如通過與外來包合主體競爭形成復(fù)合體而產(chǎn)生的主體/客體復(fù)合體的解離。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的聚合體制劑可以在所需應(yīng)用中在可接受的時期內(nèi)生物降解。在某些實(shí)施方案中，如在體內(nèi)治療中，在與pH為6至8的溫度為25至37℃的生理學(xué)溶液接觸時，該類降解通常發(fā)生在小于約5年、一年、六個月、三個月、一個月、十五天、五天、三天或甚至一天的時間內(nèi)。在其它實(shí)施方案中，根據(jù)所需的應(yīng)用，該聚合物在約一小時至幾星期的時期內(nèi)降解。
這里所用的術(shù)語“可生物侵蝕的”指的是可以在所需的時期內(nèi)持續(xù)向靶組織傳遞有效量治療劑的聚合物。因此，在一方面，在位于主體組織等等的生物學(xué)環(huán)境中時，本發(fā)明的聚合物暴露在水解酶和氧化性物質(zhì)之下，并且與主體的炎癥響應(yīng)成比例。其通過共價連接鍵的斷裂使所說的治療劑釋放出來。因此，在某些實(shí)施方案中，如上文所述的那樣，本發(fā)明的材料在降解時利用了哺乳動物固有的傷口愈合修復(fù)過程。
已經(jīng)對可生物降解的聚合物——聚乳酸、聚乙醇酸和聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)的納米微粒制劑進(jìn)行了廣泛研究。這些聚合物是在被植入到體內(nèi)時經(jīng)歷簡單水解的聚酯。該類水解的產(chǎn)物是可生物相容的和可代謝的部分(例如，乳酸和乙醇酸)，其最后通過檸檬酸循環(huán)從體內(nèi)被除去。聚合物生物降解產(chǎn)物是以十分低的速率形成的，因此不會影響正常的細(xì)胞功能。使用這些聚合物的一些植入研究已經(jīng)證明了其在藥物傳遞應(yīng)用中的安全性，其是以基質(zhì)(matrices)、微球、骨植入材料、手術(shù)縫合線的形式被應(yīng)用的，并且還用于長效的避孕藥應(yīng)用。這些聚合物還可用作用于人造器官的移植材料，并且最近還被用作組織工程學(xué)研究中的基底膜。Nature Med.824-826(1996)。因此，這些聚合物已經(jīng)在各種應(yīng)用中歷經(jīng)考驗(yàn)并且已經(jīng)證明其對于人的應(yīng)用而言是安全的。最重要的是，這些聚合物已經(jīng)被FDA批準(zhǔn)用于人。
當(dāng)用這些聚合物來體內(nèi)傳遞藥理學(xué)活性物質(zhì)時，這些聚合物本身必需無毒并且在該聚合物被體液侵蝕時其降解成無毒的降解產(chǎn)物。但是，許多合成的可生物降解的聚合物在體內(nèi)侵蝕時產(chǎn)生對周圍組織有不利相互作用的低聚物和單體。D.F.Williams，J.Mater.Sci.1233(1982)。為了將完整聚合物載體以及其降解產(chǎn)物的毒性最小化，已經(jīng)以天然存在的代謝物為基礎(chǔ)設(shè)計了一些聚合物。該類聚合物中進(jìn)行了最廣泛研究的實(shí)例可能是得自乳酸或乙醇酸的聚酯和得自氨基酸的聚酰胺。
許多可生物侵蝕的或可生物降解的聚合物是已知的并且可用于控制藥物的釋放。該類聚合物在，例如，US 4,291,013；US 4,347,234；US4,525,495；US 4,570,629；US 4,572,832；US 4,587,268；US 4,638,045；US4,675,381；US 4,745,160；和US 5,219,980中進(jìn)行了描述。
生物可水解的鍵(例如，酯、酰胺、碳酸酯、氨基甲酸酯或亞胺)指的是在生理學(xué)條件下可裂解的鍵(例如，酯裂解形成羥基和羧酸)。生理學(xué)條件包括消化道(例如，胃、腸等等)的酸性和堿性環(huán)境、腫瘤的酸性環(huán)境、酶解、代謝和其它生物學(xué)過程，并且優(yōu)選指的是脊椎動物如哺乳動物體內(nèi)的生理學(xué)條件。
這里所用的術(shù)語“共聚單體A前體”、“連接基”“連接基基團(tuán)”和“連接基部分”指的是在與環(huán)糊精單體前體或其它適宜的環(huán)狀部分反應(yīng)時將兩個該類部分連接到一起的任何直鏈或支鏈、對稱或不對稱的化合物。在某些實(shí)施方案中，共聚單體A前體是一種包含至少兩個官能團(tuán)的化合物，通過與其反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)與環(huán)糊精單體的連接。各共聚單體A前體的官能團(tuán)可以是相同或不同的、末端或內(nèi)部的，其實(shí)例非限制性地包括氨基、酸、咪唑、羥基、巰基、酰鹵、-C＝C-或-C≡C-以及其衍生物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所說的兩個官能團(tuán)可以相同并且可以位于該共聚單體的末端。在某些實(shí)施方案中，共聚單體A前體包含一個或多個具有至少一個可以通過其進(jìn)行反應(yīng)的官能團(tuán)的側(cè)基，從而可以實(shí)現(xiàn)治療劑或靶向配體的連接，或者可以實(shí)現(xiàn)支化聚合。各共聚單體A前體的側(cè)基的官能團(tuán)可以是相同或不同的、末端或內(nèi)部的，其實(shí)例非限制性地包括氨基、酸、咪唑、羥基、巰基、酰鹵、乙烯和乙炔基以及其衍生物。在某些實(shí)施方案中，該側(cè)基是(未)被取代的任選地在鏈或環(huán)中包含一個或多個雜原子例如N、O、S的支鏈、環(huán)狀或直鏈C1-C10(優(yōu)選C1-C6)烷基或芳基烷基。
在共聚單體A前體與環(huán)糊精單體前體共聚反應(yīng)時，可以通過將一個環(huán)糊精單體的伯羥基側(cè)與另一個環(huán)糊精單體的伯羥基側(cè)相結(jié)合、將一個環(huán)糊精單體的仲羥基側(cè)與另一個環(huán)糊精單體的仲羥基側(cè)相結(jié)合或通過將一個環(huán)糊精單體的伯羥基側(cè)與另一個環(huán)糊精單體的仲羥基側(cè)相結(jié)合來將兩種環(huán)糊精單體連接起來。因此，該類鍵合的組合可存在于最終的共聚物中。最終共聚物的共聚單體A前體和共聚單體A都可以是中性、陽離子性(例如，包含質(zhì)子化基團(tuán)，如例如季銨基團(tuán))或陰離子性(例如，包含去質(zhì)子化基團(tuán)，如，例如，硫酸根、磷酸根、硼酸根或羧酸根)?？梢酝ㄟ^調(diào)節(jié)pH條件來調(diào)節(jié)該共聚物共聚單體A的電荷。適宜共聚單體A前體的實(shí)例非限制性地包括琥珀酰亞胺(例如，二巰基雙(琥珀酰亞胺基丙酸酯)DSP和雙琥珀酰亞胺基辛二酸酯(DSS)、谷氨酸酯和天門冬氨酸酯)。
本發(fā)明包含環(huán)糊精的聚合物可以是線性、支鏈或接枝的。這里所用的術(shù)語“包含環(huán)糊精的線性聚合物”指的是包含被插入到聚合物鏈內(nèi)部的(α、β或γ)環(huán)糊精分子或其衍生物的聚合物。這里所用的術(shù)語“包含環(huán)糊精的接枝聚合物”指的是包含懸掛在該聚合物鏈外的(α、β或γ)環(huán)糊精分子或其衍生物的聚合物。這里所用的術(shù)語“接枝聚合物”指的是沿著聚合物的主鏈以懸掛基團(tuán)的形式連接有另外的部分的聚合物分子。術(shù)語“接枝聚合”指的是其中將側(cè)鏈接枝到聚合物主鏈上的聚合反應(yīng)，所說的側(cè)鏈包含一種或多種其它單體。所得接枝共聚物的性質(zhì)如，例如，溶解度、熔點(diǎn)、吸水性、潤濕性、機(jī)械性能、吸附行為等等隨著所接枝單體的類型和數(shù)量與初始聚合物的這些性質(zhì)有著較大或較小的差異。這里所用的術(shù)語“接枝比”指的是以該聚合物的重量為基礎(chǔ)的被接枝單體數(shù)量的重量百分比。這里所用的包含環(huán)糊精的支鏈聚合物指的是具有多個分支點(diǎn)的聚合物主鏈，其中各分支點(diǎn)也是另一條聚合物主鏈的起點(diǎn)，并且聚合物主鏈的各段可以具有許多被插入到或接枝到該鏈上的(α、β或γ)環(huán)糊精分子或其衍生物。
術(shù)語“環(huán)糊精部分”指的是可以為其氧化或還原形式的(α、β或γ)環(huán)糊精分子或其衍生物。環(huán)糊精部分可以包含任選的連接基。還可以通過任選的連接基進(jìn)一步向這些部分中連接任選的治療劑和/或靶向配體。該鍵合可以是共價的(任選地通過可生物水解的鍵，例如，酯、酰胺、氨基甲酸酯和碳酸酯鍵連接)或者可以是環(huán)糊精衍生物和治療劑和/或靶向配體或各任選的連接基之間的主體-客體復(fù)合體。環(huán)糊精部分可進(jìn)一步包含一種或多種直接(即通過碳水化合物鍵合)或通過連接基基團(tuán)連接到該環(huán)狀核上的碳水化合物部分，優(yōu)選簡單的碳水化合物部分如半乳糖。
術(shù)語“ED50”指的是產(chǎn)生其最大響應(yīng)或作用50％的響應(yīng)或作用的藥物劑量。
在涉及對個體進(jìn)行治療的方法時，各化合物的‘有效量’指的是制劑中治療劑的量，當(dāng)以所需劑量方案的一部分應(yīng)用時，根據(jù)臨床可接受的標(biāo)準(zhǔn)，其可以提供治療或預(yù)防特定病癥的益處。
術(shù)語“健康護(hù)理人員”指的是為個人、團(tuán)體等等提供健康護(hù)理服務(wù)的個體或組織?！敖】底o(hù)理人員”的實(shí)例包括醫(yī)生、醫(yī)院、繼續(xù)護(hù)理退休團(tuán)體、熟練的護(hù)理機(jī)構(gòu)、亞急性護(hù)理機(jī)構(gòu)、診所、多科診所、獨(dú)立的急救中心、家庭保健服務(wù)機(jī)構(gòu)和HMO′s。
這里所用的“說明”指的是描述附屬于試劑盒的相關(guān)材料或與之有關(guān)的操作的文件。這些材料可包括任何下面物質(zhì)的組合背景信息、組分以及其來源信息(購買信息等等)的列表、使用該試劑盒的簡單或詳細(xì)方案、故障檢查、參考資料、技術(shù)支持和任何其它相關(guān)文件。這些說明可以與試劑盒一起被提供，或者可以以獨(dú)立的組成部分被提供，其可以為紙件形式或者在計算機(jī)可讀存儲設(shè)備上提供或?yàn)榭梢詮膰H互聯(lián)網(wǎng)站上下載的電子形式，或者可以為錄音介紹的形式。這些說明可以包含一種或多種文件，并且包括未來可能有的最新資料。
這里所用的“試劑盒”指的是至少兩種組成該試劑盒的組分的集合。該組分一起組成了用于給定目的的功能單位。各組成部分可以在物理上被包裝在一起或者被獨(dú)立包裝。例如，包含用于使用該試劑盒的說明的試劑盒可以包含或不包含其它各組成部分的說明?；蛘?，該說明可以以獨(dú)立的組成部分的形式提供，其可以為紙件形式或可以從國際互聯(lián)網(wǎng)站上下載的電子形式，或者可以為錄音介紹的形式。
術(shù)語“LD50”指的是50％試驗(yàn)個體死亡的藥物劑量。
用主題方法治療的“患者”或“個體”指的是人或非人的個體。
本發(fā)明的“聚合反應(yīng)”包括游離基、陰離子和陽離子機(jī)理，以及雙官能分子的反應(yīng)(與尼龍的形成相似，例如，將分別帶有兩個或多個不同的可彼此反應(yīng)的反應(yīng)部分的分子進(jìn)行反應(yīng)(但是優(yōu)選通過空間、構(gòu)象或其它約束限制分子內(nèi)反應(yīng))，或者將兩種或多種不同的化合物進(jìn)行反應(yīng)，各化合物帶有兩個或多個僅與不同化合物的反應(yīng)部分反應(yīng)(即，分子間的反應(yīng))的反應(yīng)部分)、以及金屬催化的聚合反應(yīng)，如本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的烯烴交換、以及其它聚合反應(yīng)。
術(shù)語“預(yù)防或治療性”處理在現(xiàn)有技術(shù)中是公知的，并且包括給主體施用一種或多種主題組合物。如果在臨床上表現(xiàn)出不希望的情況(例如主體動物的疾病或其它不希望的狀態(tài))前進(jìn)行給藥，則該處理是預(yù)防性的，即，其保護(hù)主體不形成不希望的情況，而如果在表現(xiàn)出不希望的情況后給藥，則該處理是治療性的(即，用以減少、改善或穩(wěn)定已經(jīng)存在的不希望的情況或其副作用)。
術(shù)語“防止”是本領(lǐng)域公知的，并且當(dāng)用于一種情況，如局部復(fù)發(fā)(例如，疼痛)、疾病如癌癥、綜合征狀如心衰或任何其它醫(yī)學(xué)情況時，其在本領(lǐng)域可以被充分理解，并且包括使用一種相對于未使用該組合物的個體而言可以降低個體醫(yī)學(xué)情況的癥狀的頻率或延遲其出現(xiàn)的組合物。因此，癌癥的預(yù)防包括，例如，降低接受預(yù)防性處理的患者群中可察覺的癌生長的數(shù)量(相對于未進(jìn)行處理的對照群體而言)和/或延遲進(jìn)行了處理的群體中可探測的癌生長的出現(xiàn)(相對于未進(jìn)行處理的對照而言)，例如，其以統(tǒng)計學(xué)和/或臨床顯著的數(shù)量被降低或延遲。感染的預(yù)防包括例如相對于未進(jìn)行處理的對照群體而言，降低了進(jìn)行了處理的群體診斷出感染的數(shù)量和/或延遲了其癥狀發(fā)作。疼痛的預(yù)防包括例如相對于未進(jìn)行處理的對照群體而言，降低了進(jìn)行了處理的群體中個體經(jīng)歷疼痛感覺的頻率或者延遲了其所經(jīng)歷的疼痛感覺。
本文所述的術(shù)語“治療劑”包括當(dāng)給藥于生物體(人或非人的動物)時通過局部和/或全身作用誘導(dǎo)了所需的藥理學(xué)、致免疫性和/或生理學(xué)作用的任何合成或天然的生物學(xué)活性化合物或組合物。因此，該術(shù)語包括一般被稱為藥物、疫苗和生物藥劑(包括分子如蛋白、肽、激素、核酸、基因構(gòu)建體等等)的化合物或化學(xué)品。更具體地，術(shù)語“治療劑”包括用于所有主要治療領(lǐng)域的化合物或組合物，非限制性地包括助劑；抗感染劑如抗生素和抗病毒劑；鎮(zhèn)痛劑和鎮(zhèn)痛劑組合、減食欲劑、抗炎劑、抗癲癇劑、局部和全身麻醉劑、安眠劑、鎮(zhèn)靜劑、抗精神病藥物、精神抑制劑、抗抑郁劑、抗焦慮劑、拮抗劑、神經(jīng)阻滯劑、抗膽堿能藥和擬膽堿能藥、抗毒蕈堿藥和毒蕈堿藥、抗腎上腺素能藥、抗心律失常藥、抗高血壓藥、激素和營養(yǎng)物、抗關(guān)節(jié)炎藥、止喘藥、抗驚厥藥、抗組胺藥、止惡心藥、抗腫瘤藥、止癢劑、退熱劑；鎮(zhèn)痙劑、心血管制劑(包括鈣通道阻滯劑、β-阻滯劑、β-激動劑和抗心律失常藥)、抗高血壓藥、利尿劑、血管舒張藥；中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮劑；咳嗽和感冒制劑；減充血劑；診斷劑；激素；骨生長促進(jìn)劑和骨再吸收抑制劑；免疫抑制劑；肌肉松弛藥；精神興奮劑；鎮(zhèn)靜劑；安定藥；蛋白、肽、以及其片段(無論是天然的、化學(xué)合成的還是重組產(chǎn)生的)；和核酸分子(兩個或多個核苷酸(核糖核苷酸(RNA)或脫氧核糖核苷酸(DNA)，包括雙鏈和單鏈分子)的聚合形式、基因構(gòu)建體、表達(dá)載體、反義分子等等)、小分子(例如，阿霉素)和其它生物活性大分子如，例如，蛋白和酶。這些活性劑可以是醫(yī)學(xué)(包括獸醫(yī))應(yīng)用和農(nóng)業(yè)如植物以及其它領(lǐng)域所用的生物學(xué)活性劑。術(shù)語治療劑還非限制性地包括藥物；維生素；礦物補(bǔ)充物；用于治療、預(yù)防、診斷、治愈或減輕疾病的物質(zhì)；或影響機(jī)體結(jié)構(gòu)或功能的物質(zhì)；或在被放置到預(yù)定的生理學(xué)環(huán)境中后變得有生物活性或者生物學(xué)活性更強(qiáng)的前體藥物。
這里所用的術(shù)語“低水溶性”指的是在水中溶解度差的水不溶性化合物，即在生理學(xué)pH(6.5-7.4)下在水中的溶解度＜5mg/ml的物質(zhì)。其水溶性優(yōu)選＜1mg/ml，更優(yōu)選＜0.1mg/ml。希望在分散體形式時該藥物在水中是穩(wěn)定的；否則的話，需要使用冷凍干燥或噴霧干燥的固體形式。
一些優(yōu)選的水不溶性藥物的實(shí)例包括免疫抑制劑如環(huán)孢菌素類物質(zhì)，包括環(huán)孢菌素(環(huán)孢菌素A)、免疫活化劑、抗病毒和抗真菌劑、抗腫瘤藥、鎮(zhèn)痛劑和抗炎劑、抗生素、抗癲癇劑、麻醉劑、安眠劑、鎮(zhèn)靜劑、抗精神病藥物、精神抑制劑、抗抑郁劑、抗焦慮劑、抗驚厥劑、拮抗劑、神經(jīng)阻滯劑、抗膽堿能藥和擬膽堿能藥、抗毒蕈堿藥和毒蕈堿藥、抗腎上腺素能藥和抗心律失常藥、抗高血壓藥、激素和營養(yǎng)物。對這些物質(zhì)和其它適宜藥物的詳細(xì)描述可見Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，1990，Mack Publishing Co.Philadelphia，Pa。
術(shù)語“治療指數(shù)”指的是被定義為LD50/ED50的藥物治療指數(shù)。
在涉及治療方法時，化合物的“治療有效量”指的是當(dāng)作為給藥于哺乳動物、優(yōu)選人的所需劑量方案的一部分進(jìn)行給藥時，根據(jù)待處理病癥或情況或美容目的的臨床可接受的標(biāo)準(zhǔn)，例如在適用于任何醫(yī)學(xué)處理的合理的益處/風(fēng)險比下可以緩解癥狀、改善情況或減緩疾病情況出現(xiàn)的制劑中的化合物的量。
在涉及治療方法時，化合物的“治療有效的日劑量”指的是當(dāng)作為給藥于哺乳動物、優(yōu)選人的所需日劑量方案的一部分進(jìn)行給藥時，根據(jù)待處理病癥或情況或美容目的的臨床可接受的標(biāo)準(zhǔn)，例如在適用于任何醫(yī)學(xué)處理的合理的益處/風(fēng)險比下可以緩解癥狀、改善情況或減緩疾病情況出現(xiàn)的制劑中的化合物的量。
(b)化學(xué)術(shù)語脂族鏈包括下面所定義類型的烷基、鏈烯基和炔基。直脂族鏈被限定為無分支碳鏈的基團(tuán)。這里所用的術(shù)語“脂族基團(tuán)”指的是直鏈、支鏈或環(huán)狀脂族烴基并且包括飽和和不飽和的脂族基團(tuán)，如烷基、鏈烯基和炔基。
烷基指的是具有所指定碳原子數(shù)的或者在沒有具體指定時具有最多30個碳原子的全飽和支鏈或直鏈的碳鏈基團(tuán)。例如，1至8個碳原子的烷基指甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基和辛基等基團(tuán)，以及這些基團(tuán)的位置異構(gòu)體。10至30個碳原子的烷基包括癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基、二十一烷基、二十二烷基、二十三烷基和二十四烷基。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，直鏈或支鏈烷基在其主鏈上具有30或更少數(shù)目的碳原子(例如，對于直鏈而言為C1-C30，對于支鏈而言為C3-C30)，并且更優(yōu)選20或更少。同樣，優(yōu)選的環(huán)烷基在其環(huán)結(jié)構(gòu)中具有3-10個碳原子，并且更優(yōu)選在環(huán)結(jié)構(gòu)中具有5、6或7個碳原子。
此外，在說明書、實(shí)施例以及權(quán)利要求中所用的術(shù)語“烷基”(或“低級烷基”)既包括“未取代的烷基”，又包括“取代的烷基”，后者指的是具有代替該烴主鏈一個或多個碳上的氫的取代基的烷基部分。所述類取代基可以包括，例如，鹵素、羥基、羰基(如羧基、烷氧基羰基、甲?；蝓；?、硫代羰基(如硫代酸酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、磷?；?、磷酸酯、膦酸酯、次膦酸酯、氨基、酰氨基、脒、氰基、硝基、巰基、烷硫基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺?；?、磺酰氨基、磺?；?、雜環(huán)基、芳烷基或芳族或雜芳族部分。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)清楚的是，如果適宜的話，該烴鏈上的取代部分本身可以被取代。例如，取代的烷基的取代基可以包括取代和未取代形式的氨基、疊氮基、亞氨基、酰氨基、磷?；?包括膦酸酯和次膦酸酯)、磺?；?包括硫酸酯、磺酰氨基、氨磺?；突撬狨?和甲硅烷基，以及醚類、烷硫基、羰基(包括酮類、醛類、羧酸酯和酯)、-CF3、-CN等等。在下面對取代的烷基的實(shí)例進(jìn)行了描述。環(huán)烷基可進(jìn)一步被烷基、鏈烯基、烷氧基、烷硫基、氨基烷基、羰基-取代的烷基、-CF3、-CN等等取代。
除非具體指定了碳數(shù)，否則這里所用的“低級烷基”指的是上面所定義的但是在其主鏈結(jié)構(gòu)上具有1至10個碳原子，更優(yōu)選1至6個碳原子的烷基如甲基、乙基、正-丙基、異丙基、正-丁基、異丁基、仲-丁基和叔-丁基。同樣，“低級鏈烯基”和“低級炔基”具有相似的鏈長度。
在本申請中，優(yōu)選的烷基是低級烷基。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，這里被稱為烷基的取代基是低級烷基。
術(shù)語“烷硫基”指的是具有連接到其上的硫基團(tuán)的上面所定義的烷基。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，“烷硫基”部分是由-(S)-烷基、-(S)-鏈烯基、-(S)-炔基和-(S)-(CH2)m-R1中的一種表示的，其中R1的定義如下所述。典型的烷硫基包括甲硫基、乙硫基等等。
鏈烯基指的是具有所指定碳原子數(shù)或如果沒有指明碳原子數(shù)限度的話具有最多26個碳原子的任何支鏈或直鏈的不飽和碳鏈；并且在該基團(tuán)中具有1個或多個雙鍵。6至26個碳原子的鏈烯基的實(shí)例有為其各種異構(gòu)體形式的己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基、癸烯基、十一碳烯基、十二碳烯基、十三碳烯基、十四碳烯基、十五碳烯基、十六碳烯基、十七碳烯基、十八碳烯基、十九碳烯基、二十碳烯基、二十一碳烯基、二十二碳烯基、二十三碳烯基和二十四碳烯基，其中的不飽和鍵可以位于該基團(tuán)中的任何位置并且雙鍵可以具有(Z)或(E)構(gòu)型。
炔基指的是鏈烯基范圍內(nèi)的烴基，但是在該基團(tuán)內(nèi)具有1或多個三鍵。
這里所用的術(shù)語“烷氧基”指的是下面所定義的具有連接到其上的氧基的烷基。典型的烷氧基包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、叔-丁氧基等等。“醚”是通過氧被共價連接起來的兩個烴。因此，使該烷基成為一種醚的烷基的取代基是烷氧基或類似于烷氧基，如可以由-O-烷基、-O-鏈烯基、-O-炔基、-O-(CH2)m-R1中的一種來表示，其中m和R1如下所述。
術(shù)語“胺”和“氨基”在本領(lǐng)域是公知的并且指的是未取代和取代的胺，例如，可以由下面的通式所表示的部分 或 其中R3、R5和R6各自獨(dú)立地表示氫、烷基、鏈烯基、-(CH2)m-R1，或R3和R5和與其相連的N原子合在一起形成在環(huán)結(jié)構(gòu)中具有4至8個原子的雜環(huán)；R1表示鏈烯基、芳基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、雜環(huán)基或多環(huán)基；并且m是0或1至8的整數(shù)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，R3或R5中僅有一個可以是羰基，例如，R3、R5和氮一起不形成酰亞胺。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，R3和R5(和任選的R6)各自獨(dú)立地表示氫、烷基、鏈烯基或-(CH2)m-R1。因此，這里所用的術(shù)語“烷基胺”指的是具有連接到其上的取代或未取代的烷基的上面所定義的胺基團(tuán)，即，R3和R5中至少有一個是烷基。在某些實(shí)施方案中，氨基或烷基胺是堿性的，即，其具有＞7.00的pKa。相對于水而言，該官能團(tuán)的質(zhì)子化形式具有高于7.00的pKa。
術(shù)語“羰基”在本領(lǐng)域是公知的并且包括可以由下述通式表示的基團(tuán) 或 其中X是鍵或表示氧或硫，并且R7表示氫、烷基、鏈烯基、-(CH2)m-R1，或其可藥用的鹽，R8表示氫、烷基、鏈烯基或-(CH2)m-R1，其中m和R1的定義如上所述。在X是氧并且R7或R8不是氫的情況中，該式表示一種“酯”。在X是氧，并且R7具有上述定義的情況中，該部分在這里被稱為羧基，并且特別是當(dāng)R7是氫時，該式表示一種“羧酸”。在X是氧，并且R8是氫的情況中，該式表示一種“甲酸酯”。一般而言，在上式的氧原子被硫代替的情況中，該式表示一種“硫代羰基”基團(tuán)。在X是硫并且R7或R8不是氫的情況中，該式表示一種“硫代酸酯”基團(tuán)。在X是硫并且R7是氫的情況中，該式表示一種“硫代羧酸”基團(tuán)。在X是硫并且R8是氫的情況中，該式表示一種“硫代甲酸酯”基團(tuán)。另一方面，在X是鍵，并且R7不是氫的情況中，上時表示一種“酮基”。在X是鍵，并且R7是氫的情況中，上時表示一種“醛”基。
術(shù)語“被衍生化”指的是對分子進(jìn)行化學(xué)修飾。該化學(xué)修飾可以是人工的如藥物的形成，天然的如代謝物的形成。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將易于意識到有許多方法可以對分子進(jìn)行修飾，如氧化、還原、親電/親核取代、烷基化、酯/酰胺形成等等。例如，在被共價連接到所說的聚合物基質(zhì)上之前，可以用胺化、甲苯磺?；虻饣瘉韺Ρ景l(fā)明的環(huán)糊精進(jìn)行化學(xué)修飾。同樣，可以通過制備前體藥物(例如，甘氨酸-喜樹堿)來對治療劑進(jìn)行化學(xué)修飾。
術(shù)語“雜環(huán)基”或“雜環(huán)基團(tuán)”指的是3-至10-元環(huán)結(jié)構(gòu)，更優(yōu)選3-至7-元環(huán)，其環(huán)結(jié)構(gòu)包含1至4個雜原子。這些雜環(huán)還可以是多環(huán)。雜環(huán)基包括，例如，噻吩、噻蒽、呋喃、吡喃、異苯并呋喃、色烯、氧雜蒽、phenoxathiin、吡咯、咪唑、吡唑、異噻唑、異噁唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、噠嗪、吲嗪、異吲哚、吲哚、吲唑、嘌呤、喹嗪、異喹啉、喹啉、酞嗪、萘啶、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、蝶啶、咔唑、咔啉、菲啶、吖啶、嘧啶、菲咯啉、吩嗪、吩砒嗪、吩噻嗪、呋咱、吩噁嗪、吡咯烷、氧雜環(huán)戊烷、硫雜環(huán)戊烷、噁唑、哌啶、哌嗪、嗎啉、內(nèi)酯、內(nèi)酰胺如氮雜環(huán)丁酮和吡咯烷酮、磺內(nèi)酰胺、磺酸內(nèi)酯等等。該雜環(huán)可以在一個或多個位置上被上述的取代基所取代，所說的取代基如例如鹵素、烷基、芳烷基、鏈烯基、炔基、環(huán)烷基、羥基、氨基、硝基、巰基、亞氨基、酰氨基、磷酸酯、膦酸酯、次膦酸酯、羰基、羧基、甲硅烷基、氨磺?；喕酋；?、醚、烷硫基、磺?；⑼?、醛、酯、雜環(huán)基、芳族或雜芳族部分、-CF3、-CN等。
這里所用的術(shù)語“取代的”包括有機(jī)化合物所有可能的取代基。在更廣意義上，允許的取代基包括開鏈?zhǔn)胶铜h(huán)狀、支鏈和直鏈的、碳環(huán)和雜環(huán)的、芳族和非芳族的有機(jī)化合物的取代基。說明性取代基的實(shí)例包括例如上述這些基團(tuán)。對于適宜的有機(jī)化合物，允許的取代基可以是一種或多種并且是相同或不同的。對于本發(fā)明的目的而言，雜原子如氮可以具有氫取代基和/或任何允許的可以滿足該雜原子的化合價的本文所述的有機(jī)化合物的取代基。這些允許的有機(jī)化合物的取代基不以任何方式對本發(fā)明形成限制。
術(shù)語“烴基”指的是包含具有最多26個碳原子的碳鏈或環(huán)的單價烴基團(tuán)，所說的碳上可以連接有氫原子。該術(shù)語包括烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基和芳基、具有飽和和不飽和鍵混合物的基團(tuán)、碳環(huán)，并且包括所述基團(tuán)的組合。其可以指直鏈、支鏈、環(huán)狀結(jié)構(gòu)或其組合。
術(shù)語“亞烴基”指的是二價烴基。典型實(shí)例包括亞烷基、亞苯基或亞環(huán)己基。該亞烴基鏈優(yōu)選是全飽和的和/或具有1-10個碳原子的鏈。
這里所用的術(shù)語“硝基”指的是-NO2；術(shù)語“鹵素”指的是-F、-Cl、-Br或-I；術(shù)語“巰基”指的是-SH；術(shù)語“羥基”指的是-OH；并且術(shù)語“磺酰基”指的是-SO2-。
應(yīng)當(dāng)清楚的是，“取代基”或“被……取代”包括的暗含條件是該類取代基與被取代原子和取代基所允許的化學(xué)價相一致，并且該取代基可以產(chǎn)生穩(wěn)定的化合物，例如，其不會自動進(jìn)行轉(zhuǎn)化如通過重排、環(huán)化、消除等等來進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
可以對鏈烯基和炔基進(jìn)行類似取代從而產(chǎn)生例如，氨基鏈烯基、氨基炔基、酰氨基鏈烯基、酰氨基炔基、亞氨基鏈烯基、亞氨基炔基、鏈烯硫基、炔硫基、羰基-取代的鏈烯基或炔基。
當(dāng)在任何結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)一次以上時，這里所用的各種表述例如烷基、m、n等等的定義與其在同一結(jié)構(gòu)中的其它定義是彼此獨(dú)立的。
術(shù)語三氟甲磺?；?、甲苯磺酰基、甲磺酰基和九氟丁磺?；诒绢I(lǐng)域是公知的并且分別指的是三氟甲磺?；?、對-甲苯磺酰基、甲磺酰基和九氟丁磺?；Ｐg(shù)語三氟甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、甲磺酸酯和九氟丁磺酸酯在本領(lǐng)域是公知的并且分別指三氟甲磺酸酯、對-甲苯磺酸酯、甲磺酸酯和九氟丁烷磺酸酯官能基和包含所說基團(tuán)的分子。
縮寫Me、Et、Ph、Ms分別表示甲基、乙基、苯基和甲磺?；ournalof Organic Chemistry各卷第一次發(fā)行中給出了本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所用縮寫更全面的列表；該列表一般存在于標(biāo)題為標(biāo)準(zhǔn)縮寫列表的表中。所說列表中所包含的縮寫以及有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域普通技術(shù)人員所用的所有縮寫在這里都被引入作為參考。
本發(fā)明的某些化合物可以以幾何或立體異構(gòu)形式存在。本發(fā)明包括所有該類化合物，包括順式-和反式-異構(gòu)體、(R)-和(S)-對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體、(d)-異構(gòu)體、(l)-異構(gòu)體、其外消旋混合物和其它混合物，這些都落在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在取代基如烷基中可以存在另外的不對稱碳原子。所有該類異構(gòu)體以及其混合物都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
例如，如果需要本發(fā)明化合物的特定對映異構(gòu)體，則可以通過不對稱合成來制備，或者通過用手性助劑衍生化，其中將所得的非對映異構(gòu)的混合物分離出來并將該輔助基團(tuán)裂解下來從而提供所需的純對映異構(gòu)體?；蛘?，在該分子包含堿性官能團(tuán)如氨基或酸性官能團(tuán)如羧基的情況中，可以用適宜的光學(xué)活性酸或堿來形成非對映異構(gòu)的鹽，然后用現(xiàn)有技術(shù)中眾所周知的分級結(jié)晶或色譜法將所形成的非對映異構(gòu)體拆分，隨后可以回收純對映異構(gòu)體。
所考慮的上述化合物的等同物包括與其相當(dāng)并且具有與其性質(zhì)相同的一般性質(zhì)的其它化合物，其中對取代基進(jìn)行了一種或多種不會對化合物的功效產(chǎn)生不利影響的簡單變化。一般而言，本發(fā)明的化合物可以用常規(guī)反應(yīng)流程圖如下面所述的流程圖所述的方法或者其變型，用易于獲得的起始材料、試劑和常規(guī)合成操作來進(jìn)行制備。在這些反應(yīng)中，其還可以使用本身已知但是這里沒有提及的變型。
對于本發(fā)明的目的而言，根據(jù)化學(xué)和物理手冊，第67版，1986-87內(nèi)封面上的CAS版元素周期表對這些化學(xué)元素進(jìn)行確定。對于本發(fā)明的目的而言，術(shù)語“烴”還包括具有至少一個氫和一個碳原子的所有可允許的化合物。在廣義上講，所說的可允許的烴包括開鏈?zhǔn)胶铜h(huán)狀、支鏈和直鏈的、碳環(huán)和雜環(huán)的、芳族和非芳族的取代或未取代的有機(jī)化合物。
III.方法和組合物的應(yīng)用實(shí)例(a)組合物實(shí)例本發(fā)明包括聚合物軛合物，如包含環(huán)糊精的聚合物軛合物，其中共價連接了一種或多種治療劑/生物活性劑。在某些實(shí)施方案中，該治療劑是小分子、大分子、抗體、肽、蛋白、酶、核酸或具有治療功能的聚合物。該聚合物包括直鏈或支鏈的包含環(huán)糊精的聚合物和用環(huán)糊精接枝的聚合物。在US 6,509,223，公開的US申請20020151523和申請序號為60/417373和10/372723的US專利申請中教導(dǎo)了可以如本文所述進(jìn)行修飾的包含環(huán)糊精的聚合物的實(shí)例。這些聚合物可用作傳遞小分子治療劑的載體，并且可以改善藥物穩(wěn)定性和體內(nèi)使用時的溶解度。
因此，本發(fā)明的一個實(shí)施方案是式I所示的高分子化合物
其中P表示直鏈或支鏈的聚合物鏈；CD表示環(huán)狀部分如環(huán)糊精部分；L1、L2和L3每次出現(xiàn)時可以各自獨(dú)立地不存在或表示連接基基團(tuán)；D每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示治療劑或其前體藥物；T每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示靶向配體或其前體；a、m和v每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示1至10的整數(shù)(優(yōu)選1至8，1至5，或甚至1至3)；b表示1至約30,000(優(yōu)選＜25,000、＜20,000、＜15,000、＜10,000、＜5,000、＜1,000、＜500、＜100、＜50、＜25、＜10，或甚至＜5)的整數(shù)；和n和w每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示0至約30,000(優(yōu)選＜25,000、＜20,000、＜15,000、＜10,000、＜5,000、＜1,000、＜500、＜100、＜50、＜25、＜10，或甚至＜5)的整數(shù)，其中P包含環(huán)糊精部分或者n至少是1。
在某些實(shí)施方案中，與接枝到聚合物鏈的懸掛基團(tuán)上的環(huán)糊精部分相反，P在聚合物鏈中包含多個環(huán)糊精部分。因此，在某些實(shí)施方案中，式I的聚合物鏈還包含n′個單位的U，其中n′表示1至約30,000(優(yōu)選＜25,000、＜20,000、＜15,000、＜10,000、＜5,000、＜1,000、＜500、＜100、＜50、＜25、＜10，或甚至＜5)的整數(shù)；并且U如下面的通式所示 其中CD表示環(huán)狀部分，如環(huán)糊精部分或其衍生物；
L4、L5、L6和L7每次出現(xiàn)時可以各自獨(dú)立地不存在或表示連接基基團(tuán)；D和D′每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示相同或不同的治療劑或其前體藥物形式；T和T′每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示相同或不同的靶向配體或其前體；f和y每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示1至10的整數(shù)；和g和z每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示0至10的整數(shù)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，L4和L7表示連接基基團(tuán)。
在某些實(shí)施方案中，該聚合物可選自多糖類物質(zhì)、其它非蛋白性可生物降解的聚合物以及其組合，其包含至少一個末端羥基，如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇(PEG)、聚琥珀酸酐、聚癸酸、PEG-磷酸酯、聚谷氨酸酯、聚乙烯亞胺、馬來酸酐二乙烯醚(DIVMA)、纖維素、支鏈淀粉、菊粉、聚乙烯醇(PVA)、N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)、葡聚糖和羥乙基淀粉(HES)，并且具有任選的用于接枝治療劑、靶向配體和/或環(huán)糊精部分的側(cè)基。在某些實(shí)施方案中，該聚合物可以是可生物降解的如聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(烷基2-氰基丙烯酸酯)、聚酐和聚原酸酯，或可生物侵蝕的聚合物如聚丙交酯-乙交酯共聚物以及其衍生物、非肽性聚氨基酸、聚亞氨基碳酸酯、聚α-氨基酸、聚烷基-氰基-丙烯酸酯、聚磷腈或酰氧基甲基聚天門冬氨酸酯和聚谷氨酸酯共聚物以及其混合物。
本發(fā)明的另一個實(shí)施方案是通式II所示的高分子化合物
其中P表示聚合物的單體單元；T每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示靶向配體或其前體；L6、L7、L8、L9和L10每次出現(xiàn)時可以各自獨(dú)立地不存在或表示連接基基團(tuán)；CD每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示環(huán)糊精部分或其衍生物；D每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示治療劑或其前體藥物形式；m每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示1至10(優(yōu)選1至8，1至5，或甚至1至3)的整數(shù)；o表示1至約30,000(優(yōu)選＜25,000、＜20,000、＜15,000、＜10,000、＜5,000、＜1,000、＜500、＜100、＜50、＜25、＜10，或甚至＜5)的整數(shù)；和p、n和q每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示0至10(優(yōu)選0至8，0至5，0至3，或甚至0至約2)的整數(shù)，其中CD和D優(yōu)選各自存在于該化合物的至少1個位置上(優(yōu)選至少5、10、25，或甚至50或100個位置上)。
本發(fā)明的另一個實(shí)施方案是下式所示的化合物 其中CD表示環(huán)狀部分，如環(huán)糊精部分，或其衍生物；L4、L5、L6和L7每次出現(xiàn)時可以各自獨(dú)立地不存在或表示連接基基團(tuán)；
D和D′每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示相同或不同的治療劑或其前體藥物；T和T′每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示相同或不同的靶向配體或其前體；f和y每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示1至10(優(yōu)選1至8，1至5，或甚至1至3)的整數(shù)；g和z每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示0至10(優(yōu)選0至8，0至5，0至3，或甚至0至約2)的整數(shù)；和h表示1至30,000(優(yōu)選＜25,000、＜20,000、＜15,000、＜10,000、＜5,000、＜1,000、＜500、＜100、＜50、＜25、＜10，或甚至＜5)的整數(shù)，其中出現(xiàn)至少一次(并且優(yōu)選出現(xiàn)至少5、10或甚至至少20、50或100次)的g表示大于0的整數(shù)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，L4和L7表示連接基基團(tuán)。
在某些實(shí)施方案中，基礎(chǔ)的聚合物是線性的包含環(huán)糊精的聚合物，例如，該聚合物主鏈包括環(huán)糊精部分。例如，該聚合物可以是通過提供至少一種被修飾為在恰好兩個位置的各位置上帶有一種反應(yīng)性位點(diǎn)的環(huán)糊精衍生物并將該環(huán)糊精衍生物與恰好具有兩個能與所說的反應(yīng)位點(diǎn)在聚合反應(yīng)條件下形成共價鍵的反應(yīng)部分的連接基進(jìn)行反應(yīng)所制得的水溶性線性環(huán)糊精聚合物，所說的聚合反應(yīng)條件可以促進(jìn)反應(yīng)位點(diǎn)與反應(yīng)部位進(jìn)行反應(yīng)形成所說連接基和環(huán)糊精衍生物之間的共價鍵，從而制得一種包含交替的環(huán)糊精衍生物和連接基單位的線性聚合物?；蛘撸摼酆衔锟梢允且环N具有線性聚合物主鏈的水溶性線性環(huán)糊精聚合物，該聚合物在所說的線性聚合物主鏈中具有多個取代或未取代的環(huán)糊精部分和連接基部分，其中除位于聚合物鏈終點(diǎn)上的環(huán)糊精部位外的各環(huán)糊精部分被連接到兩個所說連接基部分上，各連接基部分共價連接兩個環(huán)糊精部分。在又一個實(shí)施方案中，該聚合物是包含多個由多個連接基部分共價連接到一起的環(huán)糊精部分的水溶性線性環(huán)糊精聚合物，其中除位于聚合物鏈終點(diǎn)上的環(huán)糊精部分外，各環(huán)糊精部分被連接到兩個連接基部分上從而形成一種線性環(huán)糊精聚合物。
連接基基團(tuán)可以是亞烷基鏈、聚乙二醇(PEG)鏈、聚琥珀酸酐、聚-L-谷氨酸、聚(乙烯亞胺)、低聚糖、氨基酸鏈或任何其它適宜的鍵合。在某些實(shí)施方案中，該連接基基團(tuán)本身在生理學(xué)條件下是穩(wěn)定的，如亞烷基鏈，或者其可以在生理學(xué)條件下裂解，如被酶裂解(例如，該鍵合包含是肽酶底物的肽序列)，或者被水解(例如，該鍵合包含可水解的基團(tuán)，如酯或硫代酸酯)。當(dāng)從所說的部分裂解下來時，該連接基基團(tuán)可能是生物學(xué)上無活性的，如PEG、聚乙醇酸或聚乳酸鏈，或者可能是有生物活性的，如可以結(jié)合受體、使酶滅活等等的寡肽或多肽。各種生物可相容和/或生物可侵蝕的低聚的連接基基團(tuán)在本領(lǐng)域是已知的，并且該鍵的選擇可能會影響該材料的最終性質(zhì)，如當(dāng)被植入時其是否持久、在植入后其是否會逐漸變形或萎縮，或其是否會逐漸被機(jī)體降解和吸收?？梢杂萌魏芜m宜的鍵或官能團(tuán)(包括碳碳鍵、酯、醚、酰胺、胺、碳酸酯、氨基甲酸酯、磺酰胺等等)將該連接基基團(tuán)連接到該部分上。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的連接基基團(tuán)表示其中一個或多個亞甲基任選地被基團(tuán)Y取代(條件是Y基團(tuán)互不相鄰)的亞烴基，其中各Y每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地選自取代或未取代的芳基、雜芳基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基或-O-、C(＝X)(其中X是NR1、O或S)、-OC(O)-、-C(＝O)O、-NR1-、-NR1CO-、-C(O)NR1-、-S(O)n-(其中n是0、1或2)、-OC(O)-NR1、-NR1-C(O)-NR1-、-NR1-C(NR1)-NR1-和-B(OR1)-；R1每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示H或低級烷基。
在某些實(shí)施方案中，該連接基基團(tuán)表示被衍生化或未被衍生化的氨基酸。在某些實(shí)施方案中，具有一個或多個末端羧基的連接基基團(tuán)可以軛合到該聚合物上。在某些實(shí)施方案中，可以通過將其與治療劑、靶向部分或環(huán)糊精部分通過(硫)酯或酰胺鍵共價連接而將這些末端羧基中的一個或多個封端。還是在另外的實(shí)施方案中，可以向該聚合物中混入具有一個或多個末端羥基、巰基或氨基的連接基基團(tuán)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以通過將其經(jīng)由(硫)酯、酰胺、碳酸酯、氨基甲酸酯、硫代碳酸酯或硫代氨基甲酸酯鍵共價連接到治療劑、靶部分或環(huán)糊精部分上而將這些末端羥基中的一個或多個封端。在某些實(shí)施方案中，這些(硫)酯、酰胺、(硫代)碳酸酯或(硫代)氨基甲酸酯鍵可以是可生物水解的，即，可在生理學(xué)條件下被水解。
在某些實(shí)施方案中，上述的聚合物具有小于約3，或甚至小于約2的多分散性。
在某些實(shí)施方案中，該治療劑是小分子、肽、蛋白或具有治療功效的聚合物。在某些實(shí)施方案中，所說的治療劑是抗癌藥(如喜樹堿或相關(guān)衍生物)、抗真菌劑、抗細(xì)菌劑、抗霉菌劑或抗病毒治療劑。在某些實(shí)施方案中，該物質(zhì)是受體激動劑。在某些實(shí)施方案中，該物質(zhì)是受體拮抗劑。在某些實(shí)施方案中，該治療劑是蛋白酶抑制劑。
此外，本發(fā)明的聚合物可包含一種治療劑，或者可以包含一種以上的治療劑。例如，可以通過任選的連接基將兩種或多種不同的癌癥藥物、或癌癥藥物和免疫抑制劑、或抗生素和抗炎劑接枝到該聚合物上。對于不同的藥物而言，通過選擇不同的連接基可以減緩各藥物的釋放以獲得最大的劑量和功效。
本發(fā)明的一個實(shí)施方案通過將所說的治療劑與包含環(huán)糊精的聚合物共價軛合而改善了某些疏水性小分子治療劑的傳遞。該類軛合改善了水溶性，并因此改善了治療劑的生物利用度。因此，在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，該治療劑是log P＞0.4、＞0.6、＞0.8、＞1、＞2、＞3、＞4，或甚至＞5的疏水性化合物。在其它實(shí)施方案中，在將所說的軛合物連接到所說的聚合物上之前，可以將疏水性治療劑如喜樹堿與另一種化合物如氨基酸軛合。在流程圖V中說明了氨基酸衍生化的喜樹堿分子的實(shí)例。
本發(fā)明的聚合物軛合物具有10,000至500,000；30,000至200,000；或甚至70,000至150,000amu的分子量。
在某些實(shí)施方案中，所說的環(huán)糊精部分占該環(huán)糊精修飾的聚合物的至少約2％、5％或10％重量，高至20％、30％、50％或甚至80％重量。在某些實(shí)施方案中，所說的治療劑或靶向配體占該環(huán)糊精修飾的聚合物重量的至少約1％、5％、10％或15％、20％、25％、30％或甚至35％。數(shù)均分子量(Mn)也可以在很寬的范圍內(nèi)變化，但是通常為約1,000至約500,000道爾頓，優(yōu)選約5000至約200,000道爾頓并且更優(yōu)選約10,000至約100,000。Mn最優(yōu)選地在約12,000至65,000道爾頓之間變化。在某些其它實(shí)施方案中，Mn在約3000至150,000道爾頓之間變化。在給定的主題聚合物樣品中，可能存在很寬范圍的分子量。例如，所說樣品中的分子可能具有相差因子為2、5、10、20、50、100或更高的分子量，或者具有相差因子為2、5、10、20、50、100或更高的平均分子量的分子量。環(huán)糊精部分的實(shí)例包括基本由7至9個糖部分組成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，如環(huán)糊精和氧化的環(huán)糊精。環(huán)糊精部分任選地包含一種在所說的環(huán)狀結(jié)構(gòu)和聚合物主鏈之間形成一種共價鍵的連接基部分，其在鏈如烷基鏈中優(yōu)選具有1至20個原子，包括二元羧酸衍生物(如戊二酸衍生物、琥珀酸衍生物等等)，和雜烷基鏈，如低聚乙二醇鏈。
環(huán)糊精是一種含有以α-(1，4)鍵連接的天然D-(+)-吡喃葡萄糖單元的環(huán)狀多糖。最常見的環(huán)糊精是分別包含6、7或8個吡喃葡萄糖單元的α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精和γ-環(huán)糊精。環(huán)糊精的環(huán)狀性質(zhì)在結(jié)構(gòu)上形成了一種具有內(nèi)部的非極性或疏水性腔的環(huán)形曲面或環(huán)形室樣形狀，仲羥基位于所說環(huán)糊精環(huán)形曲面的一側(cè)并且伯羥基位于另一側(cè)。因此，用(β)-環(huán)糊精作為實(shí)例，環(huán)糊精常常如下圖式所示。

包含仲羥基的一側(cè)比包含伯羥基的一側(cè)的直徑更寬。本發(fā)明考慮在該伯和/或仲羥基上與環(huán)糊精部分共價鍵合。環(huán)糊精內(nèi)部空穴的疏水性使得可以形成各種化合物、如金剛烷的主體-客體包合復(fù)合體。(ComprehensiveSupramolecular Chemistry，第3卷，J.L.Atwood等人編，Pergamon Press(1996)；T.Cserhati，Analytical Biochemistry，225328-332(1995)；Husain等人，Applied Spectroscopy，46652-658(1992)；FR 2 665 169)。在Suh，J.和Noh，Y.，Bioorg.Med.Chem.Lett.1998，8，1327-1330中描述了對聚合物進(jìn)行修飾的另外的方法。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明考慮包含環(huán)糊精的線性水溶性聚合物，其中多種生物活性部分通過可以在生物學(xué)條件下裂解從而釋放所說生物活性部分的連接共價連接到所說的聚合物上，其中將該聚合物給藥于患者使得可以在至少2、3、5、6、8、10、15、20、24、36、48或甚至72小時的時間內(nèi)釋放所說的生物活性劑。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明考慮通過在治療劑和/或靶向配體與聚合物之間引入各種連接基團(tuán)來減緩所說治療劑的釋放速率。因此，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的聚合治療劑是用于控制治療劑的傳遞的組合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員還將意識到通過用放射性核對所說的治療劑和/或靶向配體進(jìn)行標(biāo)記，或者通過形成NMR活性核，例如，锝、釓或鏑復(fù)合體，本發(fā)明的聚合物可以獲得雙重的診斷/治療功用。
在其它實(shí)施方案中，該高分子化合物穩(wěn)定了在活性和無活性形式之間存在平衡的治療劑的生物活性形式。例如，將治療劑與本發(fā)明的聚合物軛合可以將所說物質(zhì)兩種互變異構(gòu)形式間的平衡移向生物活性的互變異構(gòu)體。在其它實(shí)施方案中，該高分子化合物可能會減弱治療劑內(nèi)酯形式和酸性形式之間的平衡。
一種測定分子量的方法是凝膠滲透色譜法(“GPC”)，例如，混合充填柱、CH2Cl2溶劑、光散射檢測器和離線dn/dc。其它方法也是本領(lǐng)域已知的。
在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的聚合物軛合物可以是一種柔順的或可流動的物質(zhì)。當(dāng)所用聚合物本身可流動時，本發(fā)明的聚合物組合物既使在粘稠狀態(tài)時也不需要包含可生物降解的溶劑以使其可流動，盡管仍然可能存在痕量或殘余數(shù)量可生物降解的溶劑。
雖然可將可生物降解的聚合物或生物學(xué)活性劑溶解于少量無毒溶劑中以更有效地產(chǎn)生生物學(xué)活性劑在柔順或可流動組合物中的無定形單片分布狀態(tài)或細(xì)分散體，但在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是不需要用溶劑來形成可流動的組合物。此外，優(yōu)選避免使用溶劑，這是因?yàn)橐坏軇┑木酆衔锝M合物完全或部分放到體內(nèi)時，該溶劑就會從聚合物中分散或擴(kuò)散出來并且必需由機(jī)體對其進(jìn)行處理和消除，在當(dāng)疾病(和/或?qū)υ摷膊∵M(jìn)行的其它治療)可能已經(jīng)對機(jī)體清除能力產(chǎn)生有害影響時，這又額外增加了機(jī)體清除能力的負(fù)擔(dān)。
但是，當(dāng)用溶劑來促進(jìn)混合或維持本發(fā)明聚合物軛合物的流動性時，所說的溶劑應(yīng)當(dāng)是無毒的，或者應(yīng)當(dāng)是可生物降解的，并且應(yīng)當(dāng)以相對小的量使用。在任何既使僅被部分放置到活體內(nèi)的材料中都不應(yīng)當(dāng)使用有毒的溶劑。所述溶劑還必需在給藥部位不能造成明顯的組織刺激或壞死。
當(dāng)使用時，適宜的可生物降解的溶劑的實(shí)例包括N-甲基-2-吡咯烷酮、2-吡咯烷酮、乙醇、丙二醇、丙酮、乙酸甲酯、乙酸乙酯、甲乙酮、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、四氫呋喃、己內(nèi)酰胺、油酸或1-十二烷基氮雜環(huán)庚酮。鑒于其溶劑化能力以及其生物相容性，優(yōu)選的溶劑包括N-甲基吡咯烷酮、2-吡咯烷酮、二甲基亞砜和丙酮。
在某些實(shí)施方案中，該主題聚合物軛合物可溶解于一種或多種常用的有機(jī)溶劑中以易于進(jìn)行制造和加工。常用的有機(jī)溶劑包括諸如氯仿、二氯甲烷、二氯乙烷、2-丁酮、乙酸丁酯、丁酸乙酯、丙酮、乙酸乙酯、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二甲基甲酰胺和二甲基亞砜。
本發(fā)明一方面考慮將一種疏水性治療劑如(S)-20-喜樹堿連接到直鏈或支鏈的包含環(huán)糊精的聚合物上以更好地進(jìn)行藥物的傳遞。已發(fā)現(xiàn)(S)-20-喜樹堿(CPT)(一種在20世紀(jì)50年代后期從Camptitheca accuminata分離出來的生物堿)通過在細(xì)胞周期的S-相中抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶I的作用而表現(xiàn)出抗癌活性。但是，其在人癌癥治療中的應(yīng)用由于一些因素，尤其是其與人血清白蛋白之間不希望發(fā)生的相互作用、生物活性內(nèi)酯形式的不穩(wěn)定性和水溶性差而受到了限制。為了克服這一問題，已經(jīng)研制了許多CPT類似物來改善內(nèi)酯穩(wěn)定性和水溶性。托泊替康和伊立替康是已經(jīng)被FDA批準(zhǔn)用于人類癌癥治療的CPT類似物。本發(fā)明公開了各種類型的其中(S)-20-喜樹堿被共價連接到所說聚合物上的線性、支鏈或接枝的包含環(huán)糊精的聚合物。在某些實(shí)施方案中，該藥物通過選自酯、酰胺、氨基甲酸酯或碳酸酯的可生物水解的鍵被共價連接。
用于將衍生化CD共價結(jié)合到20(S)-喜樹堿上的合成流程圖的實(shí)例如流程圖I所示。流程圖I 不想對本發(fā)明的范圍進(jìn)行任何限制，合成用于負(fù)載治療劑如喜樹堿和任選的靶向配體的線性、支鏈或接枝的包含環(huán)糊精的聚合物(CD聚合物)的一般策略如流程圖II所示。
流程圖II 為了進(jìn)一步進(jìn)行說明(不想對本發(fā)明的范圍進(jìn)行任何限制)，共聚單體A前體、環(huán)糊精部分、治療劑和/或靶向配體可以如流程圖IIa-IIb所示被裝配到一起。注意，在流程圖IIa-b中，在任何給定的反應(yīng)中可以有一種以上相同類型或不同類型的共聚單體A前體、環(huán)糊精部分、治療劑或靶向配體。此外，在聚合反應(yīng)前，可以在一步或多步獨(dú)立步驟中將一種或多種共聚單體A前體、環(huán)糊精部分、治療劑或靶向配體彼此共價連接。
流程圖IIa用于接枝聚合物的基本方案。所說的共聚單體A前體、環(huán)糊精部分、治療劑和靶向配體的定義如上所述。此外，為了完成聚合反應(yīng)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以從各種反應(yīng)性基團(tuán)，例如羧基、羥基、鹵化物、胺和活化乙烯、乙炔或芳族基團(tuán)中進(jìn)行選擇。在“高等有機(jī)化學(xué)反應(yīng)，機(jī)理和結(jié)構(gòu)”，第5版，2000中公開了反應(yīng)性基團(tuán)的另外的實(shí)例。
流程圖IIb制備線性的包含環(huán)糊精的聚合物的基本方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到通過對具有多個反應(yīng)性基團(tuán)的共聚單體A前體進(jìn)行選擇可以得到聚合物分支。
用于合成線性環(huán)糊精-CPT聚合物的不同方法的實(shí)例如流程圖III-VIII所示。
流程圖III 其中W表示任選的連接基團(tuán)；R表示W(wǎng)-CPT或O。
流程圖IV 其中W表示任選的連接基團(tuán)。
流程圖V 其中W表示任選的連接基團(tuán)，例如甘氨?；鶜埢鞒虉DVI 流程圖VII
流程圖VIII 將環(huán)糊精接枝到包含CPT的聚合物亞基側(cè)鏈上的實(shí)例如流程圖IX-XII所示。各亞基可以重復(fù)任意次，并且一種亞基可以以與另一種亞基的出現(xiàn)頻率基本相同的頻率、更高或更低的頻率出現(xiàn)，從而使得兩種亞基可以以大約相同的量或不同的量存在，其可以略有差異或相差很大，例如一種亞基以幾乎排除另一種亞基的量存在。
在某些情況中，該聚合物是無規(guī)共聚物，其中不同的亞基和/或其它單體單元隨機(jī)分布在整個聚合物鏈中。因此，在出現(xiàn)式Xm-Yn-Zo的情況中(其中X、Y和Z是聚合物亞基)，這些亞基可以隨機(jī)散布在該聚合物主鏈中。術(shù)語“隨機(jī)”部分地指的是其中在具有一種以上單體類型的聚合物中，單體單元的分布或引入不被合成方案指揮或直接控制，而是由該聚合物系統(tǒng)的固有性質(zhì)，如亞基的反應(yīng)性、數(shù)量以及該合成反應(yīng)的其它特性或其它制造、加工或處理方法所引起的。
流程圖IX 流程圖X 流程圖XI
流程圖XII 本發(fā)明還考慮如流程圖XIII-XIV所示的用CD-二半胱氨酸單體和二-NHS酯如PEG-DiSPA或PEG-BTC合成的CD-聚合物。
流程圖XIII 流程圖XIV
在某些實(shí)施方案中，如圖1所示，本發(fā)明公開了多種增加藥物負(fù)載量的策略。
(b)靶向配體如上所述，本發(fā)明一方面考慮將治療劑連接到本文所述的聚合物軛合物上。
在某些實(shí)施方案中，聚合物軛合物還包含一種靶向配體。因此，在某些實(shí)施方案中，將受體、細(xì)胞和/或組織-靶向配體或其前體連接到聚合物軛合物上。這里所用的術(shù)語“靶向配體”指的是可以促進(jìn)本發(fā)明組合物在體內(nèi)或體外靶向于受體、細(xì)胞和/或組織的任何材料或物質(zhì)。該靶向配體可以是合成、半合成或天然的?？梢宰鳛榘邢蚺潴w的材料或物質(zhì)包括，例如，蛋白，包括抗體、抗體片斷、激素、激素類似物、糖蛋白和凝集素、肽、多肽、氨基酸、糖(sugars)、糖類(saccharides)(包括單糖和多糖)、碳水化合物、小分子、維生素、甾族化合物、甾族化合物類似物、激素、輔因子、生物活性劑和遺傳物質(zhì)(包括核苷、核苷酸、核苷酸構(gòu)建體和多核苷酸)。涉及靶向配體時，這里所用的術(shù)語“前體”指的是可以轉(zhuǎn)化成靶向配體的任何材料或物質(zhì)。該類轉(zhuǎn)化可包括，例如，將前體固定在靶向配體上。靶向前體部分的實(shí)例包括馬來酰亞胺基、二硫化物基，如鄰-吡啶基二硫化物、乙烯基砜基、疊氮基和α-碘乙?；？梢杂酶鞣N方法來完成所說靶向配體或其前體與聚合物的連接，所說方法非限制性地包括共價連接，或形成主體-客體復(fù)合體。在某些實(shí)施方案中，在所說配體或其前體和聚合物之間可以存在任選的連接基基團(tuán)，其中所說的連接基基團(tuán)通過螯合作用、共價連接或形成主體客體復(fù)合體被連接到所說的共聚物上。例如，連接基基團(tuán)的一個末端可以被連接到靶向配體上，而另一端可以被連接到金剛烷基團(tuán)或與環(huán)糊精部分形成主體客體復(fù)合體的其它該類疏水性部分上。因此，所說的靶向配體可以被連接到接枝的環(huán)糊精部分上、被連接到聚合物鏈內(nèi)的環(huán)糊精部分上或該聚合物鏈本身上。每個聚合物鏈的靶向配體數(shù)可以根據(jù)多種因素變化，所說因素非限制性地包括治療劑的特性、疾病的性質(zhì)、聚合物鏈的類型?？赡艿倪B接基基團(tuán)的結(jié)構(gòu)與本申請中其它地方所定義的連接基基團(tuán)相同。
(c)藥物組合物、制劑和劑量本發(fā)明的生物相容性聚合物組合物包含生物相容性和任選的可生物降解的聚合物，例如具有上述結(jié)構(gòu)式之一所示的重復(fù)單體單元的聚合物，任選地包含上述或本領(lǐng)域已知的任何其它生物相容性和任選的可生物降解的聚合物。在某些實(shí)施方案中，該組合物是不致熱的，例如不會觸發(fā)患者體溫升高到高于臨床上可接受的值。
該主題組合物可包含“藥(drug)”、“治療劑”或“藥物(medicament)”或“生物活性劑”，其是可在人或動物體起局部或全身作用的生物學(xué)、生理學(xué)或藥理學(xué)活性物質(zhì)。例如，主題組合物可包含上面所討論的任何其它化合物。
可以使用能從聚合物基質(zhì)釋放到毗鄰組織或液體中的各種形式的藥物或生物學(xué)活性物質(zhì)。其可以是疏水性分子、中性分子、極性分子或能形成氫鍵的分子復(fù)合體。其可以是醚、酯、酰胺等形式，包括當(dāng)注射到人或動物體時可以被生物學(xué)活化，例如通過酯或酰胺的裂解被活化的前體藥物。主題組合物中的治療劑可以隨著所說組合物目的的不同而進(jìn)行廣泛變化。
可以向本發(fā)明的聚合物中混入本領(lǐng)域公知的增塑劑和穩(wěn)定劑。在某些實(shí)施方案中，為了其生物相容性而對添加劑如增塑劑和穩(wěn)定劑進(jìn)行選擇。在某些實(shí)施方案中，所說的添加劑是肺表面活性物質(zhì)，如1，2-二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)和L-α-磷脂酰膽堿(PC)。
本發(fā)明的組合物還可包含一種或多種輔助物質(zhì)，如填充劑、增稠劑等。在其它實(shí)施方案中，聚合物基質(zhì)可具有作為助劑的材料。該類另外的材料可能影響所得聚合物基質(zhì)的特性。
例如，該聚合物基質(zhì)可具有填充劑，如牛血清白蛋白(BSA)或鼠血清白蛋白(MSA)。在某些實(shí)施方案中，填充劑的量可以為聚合物基質(zhì)的約0.1至約50％重量或更高，或約2.5％、5％、10％、25％或40％?；烊朐擃愄畛鋭┛赡軙绊懢酆衔锊牧系纳锝到夂?或任何被包封物質(zhì)的緩釋速率。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其它填充劑，如碳水化合物、糖(sugars)、淀粉、糖類物質(zhì)(saccharides)、纖維素和多糖(包括甘露糖和蔗糖)。
在其它實(shí)施方案中，滾圓增強(qiáng)劑有助于通常為球形的主題聚合物基質(zhì)的制備。一些物質(zhì)如玉米蛋白、微晶纖維素或與羧甲基纖維素鈉共同處理的微晶纖維素可賦予所說的主題組合物可塑性以及植入強(qiáng)度和完整性。在特定的實(shí)施方案中，在滾圓期間，是剛性而不是塑性的擠出物會導(dǎo)致形成啞鈴型植入物和/或高比例的細(xì)粉，并為塑性而不是剛性的擠出物則傾向于聚結(jié)并形成很大的植入物。在該類實(shí)施方案中，需要在剛性和塑性之間尋求一種平衡。制劑中滾圓增強(qiáng)劑的百分比一般為10至90％(w/w)。
在某些實(shí)施方案中，主題組合物包含賦形劑?？梢愿鶕?jù)其熔點(diǎn)、在所選溶劑(例如可溶解聚合物和/或治療劑的溶劑)中的溶解度以及所得微粒的特性來選擇特定的賦形劑。
賦形劑在主題組合物中可以占一定的百分比，約5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％或更高。
可以向主題組合物中混入緩沖劑，酸性物質(zhì)和堿性物質(zhì)以調(diào)節(jié)其pH。還可以包含用來增加由聚合物基質(zhì)釋放的物質(zhì)的擴(kuò)散距離的物質(zhì)。
崩解劑是在存在液體時可以促進(jìn)主題組合物崩解的物質(zhì)。崩解劑在植入物中最常用，其中崩解劑的功能是抵銷或中和主題制劑中所用的任何粘合材料的作用。崩解機(jī)理通常涉及不溶性材料的吸水和膨脹。
崩解劑的實(shí)例包括交聯(lián)羧甲基纖維素鈉和交聯(lián)聚維酮，在某些實(shí)施方案中，其可以以總基質(zhì)重量約1-20％的量被混入到聚合物基質(zhì)中。在其它情況中，還可以加入可溶性填充劑如糖(甘露醇和乳糖)來促進(jìn)植入物的崩解。
對于特定的處理方案而言，可以使用其它材料來促進(jìn)或控制所需治療劑的釋放速率。例如，如果對于特定的應(yīng)用而言緩釋太慢，則可以加入成孔劑來在基質(zhì)中產(chǎn)生另外的孔。可以用任何生物相容性水溶性材料作為成孔劑。在聚合物系統(tǒng)產(chǎn)生一些孔和微孔管道時，其能從所形成的聚合物系統(tǒng)中溶解、擴(kuò)散或分散出來。組合物中成孔劑的量(以及如果適宜的話該類成孔劑分散微粒的大小)將影響聚合物系統(tǒng)中孔的大小和數(shù)目。
成孔劑包括在水和體液中基本可混溶并且可以從正在形成和已經(jīng)形成的基質(zhì)中散逸到水性介質(zhì)或體液中的任何可藥用的有機(jī)或無機(jī)物質(zhì)或可迅速降解成水溶性物質(zhì)的水不混溶性物質(zhì)。
適宜的成孔劑包括，例如，糖如蔗糖和葡萄糖，鹽如氯化鈉和碳酸鈉，以及聚合物如羥基丙基纖維素、羧甲基纖維素、聚乙二醇和PVP。通過改變混入到聚合物系統(tǒng)中的成孔劑的分子量和百分比，孔的大小和程度可以在很寬的范圍內(nèi)變化。
可以通過以一些方式將適宜化合物連接到所說基質(zhì)的表面來改變?nèi)魏沃黝}聚合基質(zhì)的電荷、親油性或親水性。例如，可以用表面活性劑來增強(qiáng)溶解性差或疏水性組合物的潤濕性。適宜表面活性劑的實(shí)例包括葡聚糖、聚山梨醇酯類物質(zhì)和月桂基硫酸鈉。一般以低濃度來使用表面活性劑，其用量一般小于約5％。
粘合劑是可以混入到聚合制劑中以約束并維持基質(zhì)完整性的粘合材料。粘合劑可以以干粉或溶液形式加入。可以用糖和天然以及合成聚合物作為粘合劑。
特定作為粘合劑加入的物質(zhì)的含量一般為該基質(zhì)制劑的約0.5％-15％w/w。也可用作滾圓增強(qiáng)劑的某些材料，如微晶纖維素也具有另外的粘合特性。
可以使用各種包衣來改變該基質(zhì)的性質(zhì)。
三種示例性包衣為密封衣、有光包衣和腸衣?？梢杂镁哂懈鞣N溶解或侵蝕性的其它類型的包衣來進(jìn)一步改變主題基質(zhì)的行為，并且該類包衣對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言是易于獲知的。
在涂覆含水腸衣過程中，密封衣可以防止該基質(zhì)過分吸水。有光包衣通常改善了最終基質(zhì)的操作性?？梢杂盟苄圆牧先缌u丙基纖維素來對植入物進(jìn)行密封包衣和有光包衣。通常將密封包衣和有光包衣噴灑到該基質(zhì)上直至對密封包衣而言得到約0.5％至約5％，常常為約1％的增重，對有光包衣而言得到約3％的增重。
腸衣由在胃的低pH(小于3.0)中不溶而在小腸的高pH(高于4.0)中可溶的聚合物組成?？梢允褂镁酆衔锶鏓UDRAGITM，RohmTech，Inc.，Malden，Mass.，和AQUATERICTM，F(xiàn)MC Corp.，Philadelphia，Penn.，并使其以薄膜的形式從水溶液或混懸液中或通過噴霧干燥法成層到植入物上。該腸衣一般噴霧至約1％至約30％，優(yōu)選約10至約15％的增重并且可包含包衣助劑如增塑劑、表面活性劑、降低包衣過程中植入物的粘性的分隔劑和包衣滲透性調(diào)節(jié)劑。
本發(fā)明的組合物還可以包含一種或多種任選的添加劑如纖維增強(qiáng)劑、著色劑、香料、橡膠改性劑、變調(diào)劑等等。實(shí)際上，這些任選的添加劑均應(yīng)能與所得的聚合物及其所需應(yīng)用相容。適宜的纖維增強(qiáng)劑的實(shí)例包括PGA微原纖維、膠原微原纖維、纖維素類微原纖維和烯屬微原纖維。在組合物中所用的這些任選添加劑的量是獲得所需效果所必需的量。
正如在本領(lǐng)域中眾所周知的那樣，根據(jù)被治療的病癥以及患者的年齡、情況和體重，本文所述的治療性聚合物軛合物可以以各種藥物制劑的形式進(jìn)行給藥。例如，在化合物被口服給藥的情況中，其可以被制備成片劑、膠囊、顆粒、粉末或糖漿的形式；或者對于胃腸外給藥而言，其可以被制備成注射劑(靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下注射)、滴注制劑或栓劑形式。對于通過眼睛粘膜途徑進(jìn)行的應(yīng)用而言，其可以被制備成滴眼劑或眼用軟膏。這些制劑可以用常規(guī)方法來進(jìn)行制備，并且，如果需要的話，可以將活性成分與任何常規(guī)添加劑，如賦形劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑、矯味劑、增溶劑、助懸劑、乳化劑或包衣劑混合。雖然劑量將根據(jù)患者的癥狀、年齡和體重、被治療或預(yù)防病癥的性質(zhì)和嚴(yán)重程度、藥物的給藥途徑和形式而變化，但是對于成人患者而言，推薦日劑量一般為0.01至2000mg治療劑，并且其可以以單劑量或分割劑量的形式被給藥。
對給定患者而言，產(chǎn)生最有效的治療功效的治療性聚合物軛合物的精確給藥時間和/或數(shù)量將取決于特定化合物的活性、藥物動力學(xué)和生物利用度、患者的生理學(xué)情況(包括年齡、性別、疾病類型和階段、一般身體情況、對給定藥物劑量和類型的響應(yīng)能力)、給藥途徑等等。總之，可以用上面的方針作為對治療進(jìn)行微調(diào)的基礎(chǔ)，例如可用于確定最佳給藥時間和/或數(shù)量，其頂多只需要由對患者進(jìn)行監(jiān)測和對劑量和/或時間進(jìn)行調(diào)整所組成的常規(guī)實(shí)驗(yàn)。
這里所用的短語“可藥用的”指的是在合理的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)適于與人類和動物的組織進(jìn)行接觸而沒有過分的毒性、刺激性、變應(yīng)性響應(yīng)或其它問題或并發(fā)癥并同時具有合理的益處/風(fēng)險比的治療性聚合物軛合物、材料、組合物和/或劑型。
這里所用的短語“可藥用的載體”指的是在將主題化學(xué)品從一個器官或機(jī)體的一部分運(yùn)載或轉(zhuǎn)運(yùn)到另一個器官或機(jī)體的另一部分時所涉及的可藥用的材料、組合物或載體，如液態(tài)或固態(tài)填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或包封材料。各載體在與制劑的其它組分相容的方面必需是“可接受的”并且對患者無害?？勺鳛榭伤幱幂d體的材料的一些實(shí)例包括(1)糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；(3)纖維素及其衍生物，如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和醋酸纖維素；(4)粉狀黃蓍膠；(5)麥芽；(6)明膠；(7)滑石粉；(8)賦形劑，如可可豆脂和栓劑蠟類物質(zhì)；(9)油類物質(zhì)，如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和豆油；(10)二醇類物質(zhì)，如丙二醇；(11)多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)瓊脂；(14)緩沖劑，如氫氧化鎂和氫氧化鋁；(15)藻酸；(16)無熱源的水；(17)等滲鹽水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)磷酸鹽緩沖溶液；和(21)藥物制劑中使用的其它可相容的無毒物質(zhì)。
術(shù)語“可藥用的鹽”指的是該治療性聚合物軛合物相對無毒的無機(jī)和有機(jī)酸加成鹽。這些鹽可以在該治療性聚合物軛合物的最后分離和純化過程中就地制備，或者可以通過單獨(dú)將游離堿形式的純化了的聚合物與適宜的有機(jī)或無機(jī)酸進(jìn)行反應(yīng)并將由此形成的鹽分離出來來進(jìn)行制備。代表性的鹽包括氫溴化物、鹽酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、硝酸鹽、醋酸鹽、戊酸鹽、油酸鹽、棕櫚酸鹽、硬脂酸鹽、月桂酸鹽、苯甲酸鹽、乳酸鹽、磷酸鹽、甲苯磺酸鹽、枸櫞酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、酒石酸鹽、萘甲酸鹽、甲磺酸鹽、葡庚酸鹽、乳二糖酸鹽和月桂基磺酸鹽等等。(參見例如，Berge等人(1977)“藥用鹽”，J.Pharm.Sci.661-19)在其它情況中，本發(fā)明方法中所用的治療性聚合物軛合物可能包含一種或多種酸性官能團(tuán)，因此，能與可藥用的堿形成可藥用的鹽。這些情況中的術(shù)語“可藥用的鹽”指的是聚合物的相對無毒的無機(jī)和有機(jī)堿加成鹽。這些鹽同樣可以在該聚合物的最后分離和純化過程中制備，或者可以通過單獨(dú)將游離酸形式的純化了的聚合物與適宜的堿如可藥用的金屬陽離子的氫氧化物、碳酸鹽或碳酸氫鹽、與氨水或可藥用的有機(jī)伯、仲或叔胺進(jìn)行反應(yīng)來進(jìn)行制備。代表性的堿金屬或堿土金屬鹽包括鋰、鈉、鉀、鈣、鎂和鋁鹽等。用于形成堿加成鹽的代表性的有機(jī)胺包括乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪等(參見，例如，Berge等人，同上)。
在該組合物中還可以存在潤濕劑、乳化劑和潤滑劑，如十二烷基硫酸鈉和硬脂酸鎂，以及著色劑、脫膜劑、包衣劑、甜味劑、矯味劑和香料、防腐劑和抗氧劑。
可藥用抗氧劑的實(shí)例包括(1)水溶性抗氧劑，如抗壞血酸、鹽酸半胱氨酸、硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉等等；(2)油溶性抗氧劑，如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁羥基茴香醚(BHA)、丁羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚等等；和(3)金屬螯合劑，如枸櫞酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等等。
可用于本發(fā)明方法的制劑包括適于口服給藥、鼻給藥、局部給藥(包括眼睛、耳、頰和舌下給藥)、直腸給藥、陰道給藥、氣霧劑和/或胃腸外給藥的制劑。該制劑可以方便地以單位劑型的形式存在并且可以用藥學(xué)領(lǐng)域任何眾所周知的方法來進(jìn)行制備。可以與載體材料聯(lián)合從而制備單劑量形式的活性成分的量將根據(jù)被治療的主體、特定的給藥方式而變化?？梢耘c載體材料相結(jié)合從而制備單劑量形式的活性成分的量一般是可以產(chǎn)生治療效果的化合物的量。一般而言，在一百份中，活性成分的量可以為約百分之一至約百分之九十九，優(yōu)選約5％至約70％，最優(yōu)選約10％至約30％。
制備這些制劑或組合物的方法包括將治療性聚合物軛合物與載體和任選的一種或多種輔助成分混合到一起的步驟。一般而言，該制劑是通過使治療性聚合物軛合物與液體載體或細(xì)分散的固體載體或二者均勻、緊密地混合，然后，如果需要的話，將該產(chǎn)品成形來制備的。
適于口服給藥的制劑可以是膠囊、扁囊劑、丸劑、片劑、膠狀物、錠劑(使用有滋味的基質(zhì)，通常為蔗糖和阿拉伯膠或黃蓍膠)、粉劑、顆粒或者可以是在水性或非水性液體中的溶液或混懸液形式，或者可以是水包油或油包水液體乳劑，或者為酏劑或糖漿形式，或者為軟錠劑(使用惰性基質(zhì)，如明膠和甘油或蔗糖和阿拉伯膠)和/或漱口劑等形式，其各自包含預(yù)定量的作為活性成分的治療性聚合物軛合物?；衔镞€可以以大丸劑、干藥糖劑或糊劑的形式被給藥。
可以通過壓縮或模塑來制備片劑，其可任選地含有一種或多種輔助成分。壓縮片可以用粘合劑(例如明膠或羥丙基甲基纖維素)、潤滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、崩解劑(例如羥乙酸淀粉鈉或交聯(lián)羧甲基纖維素鈉)、表面活性物質(zhì)或分散劑來進(jìn)行制備。模塑片可以通過在適宜的機(jī)器中將用惰性液體稀釋劑潤濕的粉狀肽或擬肽的混合物模塑來進(jìn)行制備。
可以任選地對片劑或其它固體劑型，如糖錠劑、膠囊、丸劑和顆粒刻痕或者用包衣和殼體如腸衣和藥物制劑領(lǐng)域眾所周知的其它包衣來進(jìn)行制備。還可以將其制備成可以提供活性成分的緩釋或控釋的形式，其可以使用例如用于提供所需釋放特性的各種比例的羥丙基甲基纖維素、其它聚合物基質(zhì)、脂質(zhì)體和/或微球?？梢酝ㄟ^例如用截留細(xì)菌的濾器進(jìn)行過濾或通過在使用前能即時溶解于無菌水或其它無菌可注射介質(zhì)中的無菌固體組合物中混入滅菌劑來對其滅菌。這些組合物還可以任選地包含不透明劑并且可以是僅在或優(yōu)選在胃腸道的某些部分釋放活性成分的組合物，并且所說的組合物可以任選地以延遲的方式釋放活性成分。可以使用的植入組合物的實(shí)例包括聚合性物質(zhì)和蠟類物質(zhì)。該活性成分還可以是微囊化形式，如果適宜的話，其可具有一種或多種上述賦形劑。
用于口服給藥的液體劑型包括可藥用的乳劑、微乳、溶液、混懸液、糖漿和酏劑。除活性成分外，該液體劑型還可以包含本領(lǐng)域常用的惰性稀釋劑，如，例如，水或其它溶劑、增溶劑和乳化劑，如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、芐醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、1，3-丁二醇、油類(特別是棉籽油、花生油、玉米油、胚油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇和脫水山梨醇脂肪酸酯、以及其混合物。
除惰性稀釋劑外，該口服組合物還可以包含助劑如潤濕劑、乳化劑和助懸劑、甜味劑、矯味劑、著色劑、香料和防腐劑。
除活性治療性聚合物軛合物外，混懸液還可以包含助懸劑，例如乙氧基化異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和脫水山梨醇酯、微晶纖維素、aluminummetahydroxide、膨潤土、瓊脂和黃蓍膠、以及其混合物。
用于直腸或陰道給藥的制劑可以以栓劑的形式存在，其可以通過將一種或多種治療性聚合物軛合物與一種或多種適宜的非刺激性賦形劑或載體(包括例如可可脂、聚乙二醇、栓劑蠟或水楊酸酯)混合來進(jìn)行制備，并且其在室溫下是固體，但是在體溫下是液體，因此，其將在直腸或陰道腔中熔化并釋放活性物質(zhì)。
適于陰道給藥的制劑還包括包含本領(lǐng)域已知的適宜載體的陰道栓、塞子、霜、凝膠、糊劑、泡沫或噴霧制劑。
用于治療性聚合物軛合物的局部或經(jīng)皮給藥的劑型包括粉劑、噴霧劑、軟膏、糊劑、霜、洗劑、凝膠、溶液、貼劑和吸入劑?？梢詫⒒钚越M分在無菌條件下與可藥用載體和可能需要的任何防腐劑、緩沖液或推進(jìn)劑混合。
除配體外，軟膏、糊劑、霜和凝膠還包含賦形劑，如動物和植物脂肪、油類、蠟類、石蠟、淀粉、黃蓍膠、纖維素衍生物、聚乙二醇、硅氧烷類物質(zhì)、皂土、硅酸、滑石粉和氧化鋅或其混合物。
除治療性聚合物軛合物外，粉劑和噴霧劑還可以包含賦形劑如乳糖、滑石粉、硅酸、氫氧化鋁、硅酸鈣和聚酰胺粉末或這些物質(zhì)的混合物。噴霧劑還可以包含常規(guī)的推進(jìn)劑，如氯氟烴類物質(zhì)和易揮發(fā)的未取代的烴，如丁烷和丙烷。
或者，該治療性聚合物軛合物可以通過氣霧劑來給藥。其可以通過制備一種包含所說化合物的含水氣溶膠、脂質(zhì)體制劑或固體微粒來完成?？梢允褂梅撬?例如，碳氟化合物推進(jìn)劑)混懸液。優(yōu)選聲波霧化器，因?yàn)槠淇梢允够钚詣┡c剪切(其可能導(dǎo)致化合物的降解)的接觸最小化。
含水氣霧劑一般是通過配制活性劑與常規(guī)可藥用載體和穩(wěn)定劑的水性溶液或混懸液來進(jìn)行制備的。所說的載體和穩(wěn)定劑可以隨著特定化合物的需要而變化，但是一般包括非離子表面活性劑(吐溫、普朗尼克或聚乙二醇)、無害的蛋白如血清白蛋白、脫水山梨醇酯、油酸、卵磷脂、氨基酸如甘氨酸、緩沖劑、鹽類、糖或糖醇。氣霧劑一般是由等滲溶液制備的。
經(jīng)皮貼劑具有可以為機(jī)體提供治療性聚合物軛合物的受控傳遞的附加優(yōu)點(diǎn)。該類劑型可以通過將活性劑溶解或分散于適當(dāng)介質(zhì)中來進(jìn)行制備。還可以用吸收促進(jìn)劑來增加配體通過皮膚的流量?？梢酝ㄟ^提供一種控速膜或?qū)M肽分散于聚合物基質(zhì)或凝膠中來控制該流動的速率。
眼用制劑、眼膏、粉劑、溶液等也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
適于胃腸外給藥的本發(fā)明的藥物組合物包含一種或多種治療性聚合物軛合物和一種或多種可藥用的等滲無菌水性或非水性溶液、分散體、混懸液或乳劑，或可以是在臨用前可以被重組成可注射的無菌溶液或分散體的無菌粉末，其可以包含抗氧劑、緩沖劑、制菌劑、可以使該制劑與使用者的血液等滲的溶質(zhì)或助懸劑或增稠劑。
可用于本發(fā)明藥物組合物的適宜水性和非水性載體的實(shí)例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)以及其適宜的混合物、植物油，如橄欖油，和可注射的有機(jī)酯，如油酸乙酯。例如，可以通過使用包衣材料，如卵磷脂、通過在分散體的情況中維持所需的粒度和通過使用表面活性劑來維持適當(dāng)?shù)牧鲃有浴?br> 這些組合物還可以包含助劑如防腐劑、潤濕劑、潤滑劑和分散劑?？梢酝ㄟ^包含各種抗細(xì)菌和抗真菌劑例如尼泊金酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等來確保防止微生物的作用。其還希望在該組合物中包含等滲劑，如糖、氯化鈉等等。此外，可以通過包含可延遲吸收的物質(zhì)如單硬脂酸鋁和明膠來使得可注射的藥物形式被延續(xù)吸收。
在一些情況中，為了延長藥物的作用，希望由皮下或肌內(nèi)注射來減緩藥物的吸收?？梢酝ㄟ^使用水溶性差的晶體或無定形材料的液體混懸液來實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。然后，藥物的吸收速率取決于其溶解速率，其溶解速率又取決于晶體大小和晶型?；蛘撸梢酝ㄟ^將藥物溶解或混懸于油性基質(zhì)中來延遲胃腸外給藥的藥物形式的吸收。
可以通過形成在可生物降解的聚合物如聚丙交酯-聚乙交酯中的微囊化的治療性聚合物軛合物基質(zhì)來制備可注射的儲庫形式?？梢愿鶕?jù)藥物與聚合物的比例、以及所用特定聚合物的性質(zhì)來控制藥物的釋放速率。其它可生物降解的聚合物的實(shí)例包括聚(原酸酯類)和聚(酐類)。還可以通過將藥物捕獲到可以與機(jī)體組織相容的脂質(zhì)體或微乳中來制備可注射的儲庫制。
當(dāng)本發(fā)明的治療性聚合物軛合物以藥物的形式被給藥于人和動物時，其可以以本身的形式或包含例如0.1至99.5％(更優(yōu)選0.5至90％)活性成分和可藥用載體的藥物組合物形式被給藥。
活性劑的制劑可以被口服、胃腸外、局部或直腸給藥。其當(dāng)然是以適于各給藥途徑的形式被給藥的。例如，其可以以片劑或膠囊的形式被給藥、通過注射劑、吸入劑、眼睛洗劑、軟膏、栓劑、輸液被給藥；通過洗劑或軟膏被局部給藥；以及通過栓劑被直腸給藥。優(yōu)選口服給藥。
這里所用的短語“胃腸外給藥”指的是除腸內(nèi)和局部給藥之外的給藥方式，其通常是通過注射來進(jìn)行的，并且非限制性地包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眶內(nèi)、心內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管的、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、囊下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)和胸骨內(nèi)注射和輸注。
這里所用的短語“全身給藥”、“外周給藥”指的是治療性聚合物軛合物、藥物或其它物質(zhì)除直接給藥到中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)以外的給藥，從而使得其進(jìn)入到患者的系統(tǒng)中并進(jìn)行代謝和其它過程，例如皮下給藥。
可以用任何適宜的給藥途徑將這些治療性聚合物軛合物給藥于人和其它動物以進(jìn)行治療，所說的適宜的給藥途徑包括口服給藥、鼻給藥(例如通過噴霧劑來進(jìn)行鼻給藥)、直腸給藥、陰道內(nèi)給藥、胃腸外給藥、腦池內(nèi)給藥和局部給藥(例如通過粉劑、軟膏或滴劑來給藥)，包括頰給藥和舌下給藥。
不管所選擇的給藥途徑是什么，均可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)方法將可以以適宜的水化形式使用的本發(fā)明的治療性聚合物軛合物和/或藥物組合物制備成可藥用的劑型。
本發(fā)明藥物組合物中活性成分的實(shí)際劑量水平可以不同，以獲得在對于特定患者、組合物、以及給藥途徑而言可以有效獲得所需治療響應(yīng)的同時對患者無毒的活性成分量。
(c)主題組合物的物理結(jié)構(gòu)該主題聚合物可以被成形為各種形狀。例如，在某些實(shí)施方案中，主題聚合物基質(zhì)可以以微?；蚣{米微粒的形式存在。微球一般包含混有藥物的可生物降解的聚合物基質(zhì)?？梢杂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員公知的許多技術(shù)來形成微球。形成微球的技術(shù)非限制性地包括，(a)通過乳化和隨后的有機(jī)溶劑蒸發(fā)進(jìn)行的相分離(包括復(fù)雜的乳化方法如水包油乳劑、油包水乳劑和水-油-水乳劑)；(b)凝聚-相分離；(c)熔化分散；(d)界面沉積；(e)原位聚合；(f)噴霧干燥和噴霧凍凝；(g)空氣懸浮包衣；和(h)鍋包衣以及噴霧包衣。在例如，US 4,652,441；US 5,100,669；US 4,526,938；WO 93/24150；EPA 0258780 A2；US 4,438,253；和US 5,330,768中公開了這些方法以及微球的特性，這些文件的全部公開內(nèi)容在這里都被引入作為參考。
為了制備本發(fā)明的微球，可以根據(jù)傳遞基質(zhì)的所需應(yīng)用來使用一些方法。適宜的方法非限制性地包括噴霧干燥、冷凍干燥、風(fēng)干、真空干燥、流化床干燥、研磨、共沉淀和臨界流體萃取。在噴霧干燥、冷凍干燥、風(fēng)干、真空干燥、流化床干燥和臨界流體萃取的情況中，首先在水性條件下將一些組分(穩(wěn)定的多元醇、生物活性劑、緩沖劑等)溶解或混懸。在研磨的情況中，用本領(lǐng)域中任何公知的方法將組分以干燥形式混合并研磨。在共沉淀的情況中，將組分在有機(jī)條件下混合并如下所述那樣進(jìn)行處理?？梢杂脟婌F干燥來使穩(wěn)定的多元醇負(fù)載生物活性劑。將組分在水性條件下混合并用精密噴嘴對其干燥從而在干燥室中產(chǎn)生出十分均勻的小滴。適宜的噴霧干燥機(jī)非限制性地包括Buchi、NIRO、APV和Lab-plant噴霧干燥器，其根據(jù)制造商的說明使用。
可以用掃描電子顯微鏡來測定微粒和納米微粒的形狀。在某些實(shí)施方案中，采用球形的納米微粒以在血流中進(jìn)行循環(huán)。如果需要的話，可以用已知的技術(shù)將該微粒制造成更適于特定應(yīng)用的其它形狀。
除治療劑的細(xì)胞內(nèi)傳遞外，該主題組合物的顆粒如微?；蚣{米微粒還可以被胞吞，從而使得其可以接近所說的細(xì)胞。該類胞吞過程的頻率同樣取決于顆粒的大小。
在某些實(shí)施方案中，可以使用可確定所說聚合物基質(zhì)形狀并為該聚合物基質(zhì)提供剛性和結(jié)構(gòu)強(qiáng)度的固體物質(zhì)。例如，可以將聚合物成形在用于植入的網(wǎng)狀物或其它織物上。還可以將聚合物構(gòu)造成適于在機(jī)體組織內(nèi)支持一些開放區(qū)域或用于將流體從一種體腔引入到另一種體腔中的支架或分流器的形式。此外，還可以將聚合物構(gòu)造成適于從手術(shù)后部位除去流體的導(dǎo)液裝置或管子，并且在一些實(shí)施方案中，被構(gòu)造為本領(lǐng)域常見的具有閉合部分的引流系統(tǒng)如Jackson-Pratt導(dǎo)液裝置等等。
對于制備用于植入的模塑或壓制物品的可能性而言該聚合物的機(jī)械性質(zhì)可能很重要。例如，玻璃轉(zhuǎn)化溫度可以在很寬的范圍內(nèi)變化，但是其必需大大低于分解溫度以適于用常規(guī)的制造技術(shù)，如壓縮模塑、擠出或注射成型來進(jìn)行制造。
(d)生物降解性和釋放特性在某些實(shí)施方案中，在與體液接觸時，本發(fā)明的聚合物和摻合物會逐漸水解。其中，可生物降解聚合物的體內(nèi)壽命取決于其分子量、結(jié)晶性、生物穩(wěn)定性和交聯(lián)度。一般而言，分子量越高、結(jié)晶度越高、并且生物穩(wěn)定性越高，生物降解就越慢。
如果用治療劑或其它材料來配制主題組合物，與從等滲鹽水溶液的釋放相比，一般可以產(chǎn)生該類物質(zhì)或其它材料的緩釋或長期釋放。該類釋放特性可以導(dǎo)致與聚合物結(jié)合的所說物質(zhì)或任何其它材料的有效量(例如約0.0001mg/kg/小時至約10mg/kg/小時)的長期傳遞(在1至約2,000小時，或者約2至約800小時的時期內(nèi))。
許多因素都可能會影響本發(fā)明聚合物的所需的水解速率、所得固體基質(zhì)的所需的柔軟性和靈活性、生物活性劑的釋放速率和程度。該類因素中的一些包括各種亞基的選擇/特性、單體亞基的對映異構(gòu)體或非對映異構(gòu)體純度、在聚合物中所發(fā)現(xiàn)的亞基的均勻性、以及該聚合物的長度。例如，本發(fā)明考慮具有各種鍵合的雜聚物和/或在該聚合物中包含其它單體元素以控制例如該基質(zhì)的生物降解速率。
為了進(jìn)一步進(jìn)行說明，通過調(diào)節(jié)所說聚合物的主鏈或側(cè)鏈的疏水性同時維持任何該類聚合物對所需應(yīng)用的足夠的生物降解能力，可以獲得很寬的降解速率范圍?？梢酝ㄟ^改變該聚合物的各種官能團(tuán)來獲得該結(jié)果。例如，因?yàn)榇龠M(jìn)了裂解而阻止了水滲透，所以疏水性主鏈和親水性鍵合的組合產(chǎn)生了不均勻的降解。
在可用于測定本發(fā)明聚合物基質(zhì)中負(fù)載的治療劑或其它材料的釋放速率的領(lǐng)域中通?？山邮艿囊环N方案包括本領(lǐng)域公知的測定法——在37℃下使任何該類基質(zhì)在0.1M PBS溶液(pH 7.4)中降解。對于本發(fā)明的目的而言，這里所用的術(shù)語“PBS方案”指的是該類方案。
在某些情況中，可以通過使其進(jìn)行該類方案來對本發(fā)明不同聚合物系統(tǒng)的釋放速率進(jìn)行比較。在某些情況中，可能必需用相同的方式對聚合物系統(tǒng)進(jìn)行加工以使得可以對不同系統(tǒng)進(jìn)行直接和相對準(zhǔn)確的比較。例如，本發(fā)明講述了一些形成本發(fā)明聚合物基質(zhì)的不同方法。該類比較可以顯示一種聚合物系統(tǒng)以比另一種聚合物系統(tǒng)的釋放快約2或更低至約1000或更高倍的速率釋放所混有的物質(zhì)。
或者，一種比較可能表明速率差異為約3、5、7、10、25、50、100、250、500或750倍。本發(fā)明和釋放速率方案可能考慮更高的速率差異。
在某些實(shí)施方案中，當(dāng)以某種方式進(jìn)行制備時，本發(fā)明聚合物系統(tǒng)的釋放速率可能顯示為單-或雙-相的。
混入到通常以微球形式被提供的聚合物基質(zhì)中的任何物質(zhì)的釋放特征在某些情況中為最初的釋放速率增加，其可以釋放所混入的任何物質(zhì)的約5至約50％或更多，或者約10、15、20、25、30或40％，然后為較低的釋放速率。
還可以用每天每mg聚合物基質(zhì)所釋放的該類材料的量來對任何被混入材料的釋放速率進(jìn)行描述。例如，在某些實(shí)施方案中，該釋放速率可以為每天每mg聚合物系統(tǒng)約1ng或更低的被混入的任何材料至約500或更多ng/天/mg?；蛘撸撫尫潘俾士梢詾榧s0.05、0.5、5、10、25、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450或500ng/天/mg。還是在其它實(shí)施方案中，任何被混入材料的釋放速率可以為10,000ng/天/mg，或更高。在某些情況中，被混入并且具有該類釋放速率特征的材料可包括治療劑、填充劑以及其它物質(zhì)。
另一方面，得自本發(fā)明任何聚合物基質(zhì)的任何材料的釋放速率可被表示為該類物質(zhì)在該類基質(zhì)中的半衰期。
除涉及用于體外測定釋放速率的實(shí)施方案外，在可體內(nèi)測定聚合物系統(tǒng)釋放速率的情況中，本發(fā)明也考慮體內(nèi)方案。用于測定任何材料從本發(fā)明系統(tǒng)的聚合物中釋放的其它測定在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的。
(e)植入物和傳遞系統(tǒng)就其最簡單的形式而言，治療劑的可生物降解的傳遞系統(tǒng)由該類治療劑在聚合物基質(zhì)中的分散體所組成。在其它實(shí)施方案中，將包含主題組合物的制品用于植入、注射或者完全或部分放置到體內(nèi)。特別重要的是當(dāng)被植入或注射到脈管組織中時，該制品產(chǎn)生最小程度的組織刺激。
可以用本領(lǐng)域公知的各種方法來制備可生物降解的傳遞系統(tǒng)及其制品?？梢杂贸Ｒ?guī)的擠壓成型或注射成型技術(shù)來熔化加工該主題聚合物，或者可以通過溶解于適宜的溶劑中，然后形成裝置，隨后通過蒸發(fā)或提取除去所說的溶劑來制備這些產(chǎn)品。
在系統(tǒng)或植入物品被放置時，應(yīng)保持至少部分與生物流體如血液、內(nèi)部器官分泌物、粘膜、腦脊髓液等等進(jìn)行接觸以使得任何被包封的治療劑可以被緩釋。
(f)制造方法本發(fā)明的化合物一般可以用下面兩種方法之一來進(jìn)行制備可以將帶有治療劑、靶向配體和/或環(huán)糊精部分的單體聚合，或者可以用治療劑、靶向配體和/或環(huán)糊精部分對聚合物主鏈進(jìn)行衍生化處理。
因此，在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明考慮通過將單體M-L-CD和M-L-D(和，任選的，M-L-T)反應(yīng)來合成本發(fā)明的化合物，其中CD表示環(huán)狀部分，如環(huán)糊精分子或其衍生物；L每次出現(xiàn)時可以各自獨(dú)立地不存在或表示連接基基團(tuán)；D每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示相同或不同的治療劑或其前體藥物；T每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示相同或不同的靶向配體或其前體；和M表示帶有一個或多個反應(yīng)性部分的單體亞基，所述反應(yīng)性部分能夠在可使單體聚合的條件下與該反應(yīng)混合物中的單體中的一種或多種其它M進(jìn)行聚合反應(yīng)。
在某些實(shí)施方案中，該反應(yīng)混合物進(jìn)一步包含不帶有CD、T或D部分的單體，例如，以將該聚合物中被衍生化的單體單元間隔開。
在另一種供選擇的實(shí)施方案中，本發(fā)明考慮通過將聚合物P(帶有多個反應(yīng)性基團(tuán)，如羧酸、醇、硫醇、胺、環(huán)氧化物等等)與接枝劑X-L-CD和Y-L-D(和，任選的，Z-L-T)進(jìn)行反應(yīng)來合成本發(fā)明的化合物，其中CD表示環(huán)狀部分，如環(huán)糊精分子或其衍生物；L每次出現(xiàn)時可以各自獨(dú)立地不存在或表示連接基基團(tuán)；D每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示相同或不同的治療劑或其前體藥物；T每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示相同或不同的靶向配體或其前體；X每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示能與該聚合物的反應(yīng)性基團(tuán)形成共價鍵的反應(yīng)性基團(tuán)，如羧酸、醇、硫醇、胺、環(huán)氧化物等等；和
Y和Z每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示在可以使接枝劑與所說的聚合物或接枝到所說聚合物上的部分形成共價鍵和/或包合復(fù)合體的條件下(視情況而定)能與該聚合物的反應(yīng)性基團(tuán)形成共價鍵或與接枝到該聚合物上的CD部分形成包合復(fù)合體的包合主體或反應(yīng)性基團(tuán)，如羧酸、醇、硫醇、胺、環(huán)氧化物等。
例如，如果該聚合物包含醇、硫醇或胺作為反應(yīng)性基團(tuán)的話，則所說的接枝劑可能包含可以與之反應(yīng)的反應(yīng)性基團(tuán)，如異氰酸酯、異硫氰酸酯、酰氯、酸酐、環(huán)氧化物、烯酮類、磺酰氯、活化的羧酸(例如，用活化劑如PyBrOP、羰基二咪唑或與羧酸反應(yīng)形成一種對于親核攻擊敏感的部分的其它試劑進(jìn)行處理的羧酸)或本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其它親電性部分。在某些實(shí)施方案中，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的那樣，需要用催化劑(例如，路易斯酸、過渡金屬催化劑、胺堿等等)來使反應(yīng)發(fā)生。
在某些實(shí)施方案中，將不同的接枝劑同時或基本同時與該聚合物進(jìn)行反應(yīng)(例如，在一罐式反應(yīng)中進(jìn)行反應(yīng))，或者相繼與所說的聚合物進(jìn)行反應(yīng)(任選地在這些反應(yīng)之間進(jìn)行純化和/或洗滌步驟)。
本發(fā)明另一方面是一種制備式I-III所示的直鏈或支鏈的包含環(huán)糊精的聚合物的方法。
雖然下面的討論集中于線性環(huán)糊精分子的制備，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將易于意識到，通過選擇適宜的共聚單體A前體，所述的方法可適于制備分支的聚合物。
因此，本發(fā)明的一個實(shí)施方案是一種制備線性環(huán)糊精共聚物的方法。根據(jù)本發(fā)明，可以通過將被適宜的離去基團(tuán)二取代的環(huán)糊精單體前體與能置換該離去基團(tuán)的共聚單體A前體共聚來制備本發(fā)明的線性環(huán)糊精共聚物。該離去基團(tuán)可以相同或不同，可以是本領(lǐng)域公知的在共聚反應(yīng)時可以被共聚單體A前體置換的任何離去基團(tuán)。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以通過將環(huán)糊精單體前體碘化從而形成一種雙碘化的環(huán)糊精單體前體并將該雙碘化的環(huán)糊精單體前體與一種共聚單體A前體共聚從而形成一種具有上述式II或III的重復(fù)單元或其組合的線性環(huán)糊精共聚物來進(jìn)行制備。雖然下面所列的實(shí)施例討論了被碘化的環(huán)糊精部分，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將易于意識到本發(fā)明考慮并包括其中不是存在碘而是存在其它離去基團(tuán)如烷基和芳基磺酸酯的環(huán)糊精部分。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，制備本發(fā)明線性環(huán)糊精共聚物的方法是將上述環(huán)糊精單體前體碘化從而形成一種式IVa、IVb、IVc的雙碘化的環(huán)糊精單體前體或其混合物 該雙碘化的環(huán)糊精可以用本領(lǐng)域公知的任何方法來進(jìn)行制備。(Tabushi等人J.Am.Chem.106，5267-5270(1984)；Tabushi等人J.Am.Chem.106，4580-4584(1984))。例如，可以將β-環(huán)糊精與聯(lián)苯-4，4′-二磺酰氯在存在無水吡啶的情況下進(jìn)行反應(yīng)，從而形成聯(lián)苯-4，4′-二磺酰氯封端的β-環(huán)糊精，然后可以將其與碘化鉀反應(yīng)，從而制得二碘-β-環(huán)糊精。該環(huán)糊精單體前體僅在兩個位置被碘化。如上所述，通過將該雙碘化的環(huán)糊精單體前體與共聚單體A前體共聚，可以制備具有上述式Ia、Ib的重復(fù)單元或其組合的線性環(huán)糊精聚合物。如果適宜的話，可以用其它公知的離去基團(tuán)代替碘或碘基。
根據(jù)本發(fā)明，如上所述的那樣，所說的碘基或其它適宜的離去基團(tuán)也可以被允許與共聚單體A前體進(jìn)行反應(yīng)的基團(tuán)所代替。例如，式IVa、IVb、IVc的雙碘化的環(huán)糊精單體前體或其混合物可以被胺化從而形成一種式Va、Vb、Vc的二胺化環(huán)糊精單體前體或其混合物
該二胺化的環(huán)糊精單體前體可以用現(xiàn)有技術(shù)中已知的任何方法來進(jìn)行制備。(Tabushi等人Tetrahedron Lett.1811527-1530(1977)；Mungall等人，J.Org.Chem.1659-1662(1975))。例如，可將二碘-β-環(huán)糊精與疊氮化鈉反應(yīng)，然后將其還原形成二氨基-β-環(huán)糊精)。該環(huán)糊精單體前體可以僅在兩個位置被胺化。然后，可以如上所述那樣將該二胺化的環(huán)糊精單體前體與共聚單體A前體共聚，從而制得一種具有如上所述的式II-III的重復(fù)單元或其組合的線性環(huán)糊精共聚物。但是，二胺化的環(huán)糊精單體前體的該氨基官能團(tuán)不必直接連接到所說的環(huán)糊精部分上?；蛘?，可以通過用適宜的堿如金屬氫化物、堿金屬碳酸鹽或堿土金屬碳酸鹽或叔胺，用包含氨基的部分如例如HSCH2CH2NH2(或更一般地是用HW-(CR1R2)n-WH表示的雙-親核性分子(其中W每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示O、S或NR1；R1和R2每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示H、(未)取代的烷基、(未)取代的芳基、(未)取代的雜烷基、(未)取代的雜芳基))置換環(huán)糊精單體前體的碘或其它適宜離去基團(tuán)來引入氨基官能團(tuán)或其它親核性官能團(tuán)，從而形成式Vd、Ve、Vf的二胺化的環(huán)糊精單體前體或其混合物
本發(fā)明的被氧化的包含環(huán)糊精的線性共聚物還可以通過如下所述那樣對一種被還原的本發(fā)明的包含環(huán)糊精的線性共聚物進(jìn)行氧化來制備。只要共聚單體A不包含氧化敏感部分或基團(tuán)，如例如硫醇，就可以進(jìn)行該方法。
根據(jù)本發(fā)明，可以對本發(fā)明的線性環(huán)糊精共聚物進(jìn)行氧化以向該共聚物中引入至少一種氧化的環(huán)糊精單體，從而使得被氧化的環(huán)糊精單體是該聚合物主鏈的一種固有部分。包含至少一種被氧化的環(huán)糊精單體的線性環(huán)糊精共聚物被定義為線性氧化環(huán)糊精共聚物或包含被氧化的環(huán)糊精的線性聚合物。該環(huán)糊精單體可以在環(huán)糊精部分的仲羥基或伯羥基上被氧化。如果在本發(fā)明的線性氧化環(huán)糊精共聚物中存在一種以上的氧化環(huán)糊精單體，則可以在伯羥基側(cè)、仲羥基側(cè)或伯醇和仲羥基側(cè)存在相同或不同的被氧化的環(huán)糊精單體。為了進(jìn)行說明，具有被氧化的仲羥基的線性氧化環(huán)糊精共聚物例如具有式VIa或VIb的至少一種單元
在式VIa和VIb中，C是取代或未取代的被氧化的環(huán)糊精單體并且A是一種被連接，例如共價連接到被氧化的環(huán)糊精C上的共聚單體。在式VIa和VIb中，仲羥基的氧化還導(dǎo)致了環(huán)糊精部分的開環(huán)和醛基的形成。
可以通過上述的線性環(huán)糊精共聚物的氧化來制備線性氧化環(huán)糊精共聚物。本發(fā)明的線性環(huán)糊精共聚物的氧化可以用本領(lǐng)域公知的氧化技術(shù)來完成。(Hisamatsu等人，Starch 44188-191(1992))。優(yōu)選使用抗氧劑如，例如，高碘酸鈉。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)清楚的是，在標(biāo)準(zhǔn)的氧化條件下，氧化度可以變化或者每一種共聚物都可以不同。因此，在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的線性氧化共聚物可以包含一種氧化的環(huán)糊精單體。在另一個實(shí)施方案中，該共聚物的基本上所有的環(huán)糊精單體都被氧化。
如上所述的那樣，制備本發(fā)明線性氧化環(huán)糊精共聚物的另一種方法包括將二碘化或二胺化的環(huán)糊精單體前體進(jìn)行氧化從而形成一種氧化的二碘化或二胺化的環(huán)糊精單體前體并將該氧化的二碘化或二胺化的環(huán)糊精單體前體與共聚單體A前體進(jìn)行共聚反應(yīng)。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，式VIIa、VIIb、VIIc的氧化的二碘化環(huán)糊精單體前體或其混合物
可以通過上述式Iva、IVb、IVc的二碘化的環(huán)糊精單體前體或其混合物的氧化來進(jìn)行制備。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，式VIIIa、VIIIb、VIIIc的氧化的二胺化環(huán)糊精單體前體或其混合物 可以通過上述式VIIa、VIIb、VIIc的被氧化的二碘化環(huán)糊精單體前體或其混合物的胺化來進(jìn)行制備。還是在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，式IXa、IXb、IXc的被氧化的二胺化環(huán)糊精單體前體或其混合物
可以通過用適宜的堿如金屬氫化物、堿金屬碳酸鹽或堿土金屬碳酸鹽或叔胺，用包含氨基或其它親核基團(tuán)的部分如例如HSCH2CH2NH2(或更一般地用HW-(CR1R2)n-WH表示的雙-親核性分子(其中W每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示O、S或NR1；R1和R2每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示H、(未)取代的烷基、(未)取代的芳基、(未)取代的雜烷基、(未)取代的雜芳基))置換被氧化的環(huán)糊精單體前體的碘或其它適宜的離去基團(tuán)來進(jìn)行制備。
或者，如上所述的被氧化的二碘化或二胺化的環(huán)糊精單體前體可以通過將環(huán)糊精單體前體氧化從而形成一種被氧化的環(huán)糊精單體前體，然后如上所述的那樣將該被氧化的環(huán)糊精單體二碘化和/或二胺化來進(jìn)行制備。如上面所討論的那樣，可以用除碘基之外的其它離去基團(tuán)和其它包含氨基的官能團(tuán)對該環(huán)糊精部分進(jìn)行修飾。然后，如上所述的那樣，可將該被氧化的二碘化或二胺化的環(huán)糊精單體前體與共聚單體A前體共聚從而形成本發(fā)明線性的氧化環(huán)糊精共聚物。
還可以通過給該共聚物連接至少一種配體來對該線性氧化環(huán)糊精共聚物進(jìn)一步進(jìn)行修飾。該配體如上所述。
根據(jù)本發(fā)明，可以將線性環(huán)糊精共聚物或線性氧化環(huán)糊精共聚物連接或接枝到一種底物上。該底物可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員公認(rèn)的任何底物。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，可以將線性環(huán)糊精共聚物或線性氧化環(huán)糊精共聚物分別與一種聚合物交聯(lián)從而形成一種交聯(lián)的環(huán)糊精共聚物或交聯(lián)的氧化環(huán)糊精共聚物。該聚合物可以是能與本發(fā)明的線性或線性氧化環(huán)糊精共聚物交聯(lián)的任何聚合物(例如，聚乙二醇(PEG)聚合物、聚乙烯聚合物)。該聚合物也可以是相同或不同的線性環(huán)糊精共聚物或線性氧化環(huán)糊精共聚物。因此，例如，可以將一種線性環(huán)糊精共聚物與任何聚合物交聯(lián)，所說的聚合物非限制性地包括其本身、另一種線性環(huán)糊精共聚物、以及線性氧化環(huán)糊精共聚物。本發(fā)明的一種交聯(lián)的線性環(huán)糊精共聚物可以通過將一種線性環(huán)糊精共聚物與聚合物在存在交聯(lián)劑的情況下進(jìn)行反應(yīng)來進(jìn)行制備。本發(fā)明交聯(lián)的線性氧化環(huán)糊精共聚物可以通過將一種線性氧化環(huán)糊精共聚物與聚合物在存在適宜交聯(lián)劑的情況下進(jìn)行反應(yīng)來進(jìn)行制備。所說的交聯(lián)劑可以是本領(lǐng)域已知的任何交聯(lián)劑。交聯(lián)劑的實(shí)例包括二酰肼和二硫化物。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，該交聯(lián)劑是不穩(wěn)定的基團(tuán)，從而使得如果需要的話可以將交聯(lián)共聚物解交聯(lián)。
可以用現(xiàn)有技術(shù)中已知的任何方法來對本發(fā)明的線性環(huán)糊精共聚物和線性氧化環(huán)糊精共聚物的特性進(jìn)行描述。該類定性方法或技術(shù)非限制性地包括凝膠滲透色譜法(GPC)、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF Mass spec)、1H和13C NMR、光散射和滴定法。
本發(fā)明還提供了一種包含至少一種上述的本發(fā)明的線性環(huán)糊精共聚物和至少一種線性氧化環(huán)糊精共聚物的環(huán)糊精組合物。因此，可以如上所述那樣將線性環(huán)糊精共聚物和線性氧化環(huán)糊精共聚物之一或二者與另一種聚合物交聯(lián)和/或結(jié)合到一種配體上。本發(fā)明的治療組合物包含治療劑和本發(fā)明的線性環(huán)糊精共聚物或線性氧化環(huán)糊精共聚物，包括交聯(lián)共聚物。線性環(huán)糊精共聚物、線性氧化環(huán)糊精共聚物以及其交聯(lián)的衍生物如上所述。所說的治療劑可以是包括本領(lǐng)域已知的治療劑在內(nèi)的任何合成或天然存在的生物學(xué)活性治療劑。適宜治療劑的實(shí)例非限制性地包括抗生素、甾族化合物、多核苷酸(例如，基因組DNA、cDNA、mRNA、雙鏈RNA和反義寡核苷酸)、質(zhì)粒、肽、肽片斷、小分子(例如，阿霉素)和其它生物活性大分子如，例如，蛋白和酶類物質(zhì)。
(g)商業(yè)方法本發(fā)明另一方面提供了某些商業(yè)方法。具體地講，實(shí)施本發(fā)明的方法使得可以得到新型的治療組合物以及其改良的制劑。當(dāng)與一種或多種另外的步驟相結(jié)合時，該技術(shù)步驟提供了進(jìn)行藥學(xué)或優(yōu)選生命科學(xué)商業(yè)的新方法。例如，可以對用本發(fā)明的方法制備的該類治療劑在各種疾病模型中作為治療劑的功效進(jìn)行試驗(yàn)，然后，在制備、包裝和隨后將所得的制劑上市以用于治療疾病前對該治療組合物的可能毒性和其它安全性進(jìn)行試驗(yàn)?；蛘撸S可第三方開發(fā)和銷售所述制劑或進(jìn)行所述步驟的權(quán)力。
因此，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了進(jìn)行藥學(xué)商務(wù)的方法，其包括a.制造一種包含權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的化合物的藥物組合物的制劑或試劑盒；和b.向健康護(hù)理人員推廣介紹在疾病或病癥的治療中用所說的制劑或試劑盒獲益。
在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明公開了一種進(jìn)行藥學(xué)商務(wù)的方法，其包括a.提供一種銷售權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的化合物的藥物組合物的分銷網(wǎng)絡(luò)；和b.為患者或醫(yī)生提供用所說的制劑來治療疾病或病癥的說明材料。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種進(jìn)行藥學(xué)商務(wù)的方法，其包括a.確定如權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述化合物的藥物組合物的適宜制劑和劑量；b.就在動物中的功效和毒性而言，確定步驟(a)中所確定的制劑的治療特性；和c.提供用于銷售在步驟(b)中確定的具有可接受的治療特性的制劑的分銷網(wǎng)絡(luò)。
該實(shí)施方案的另一個步驟包括提供用于向健康護(hù)理人員推廣介紹所說制劑的銷售團(tuán)隊。
還是在一個其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種進(jìn)行藥學(xué)商務(wù)的方法，其包括a.確定如權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述化合物的藥物組合物的適宜制劑和劑量；和b.許可第三方對該制劑進(jìn)一步進(jìn)行開發(fā)和銷售的權(quán)力。
例證材料。在使用前，將β-環(huán)糊精，“β-CD”，(Cerestar USA，Inc.of Hammond，IN)在120℃下真空(＜0.1mTorr)干燥12小時。
所有無水溶劑、HPLC級溶劑和其它常用有機(jī)溶劑都購自供應(yīng)商并且不需要進(jìn)行進(jìn)一步純化就使用。將聯(lián)苯-4，4′-二磺酰氯(Aldrich ChemicalCompany，Inc.of Milwaukee，WI)用氯仿/己烷重結(jié)晶。用研缽和研棒將碘化鉀粉化并將其在烘箱中在200℃下進(jìn)行干燥。聚乙二醇二丙酸琥珀酰亞胺(dipropanoicsuccinimide)(PEG-DiSPA，MW 3400)、聚乙二醇二丁酸琥珀酰亞胺(dibutanoicsuccinimide)(PEG-DiSBA，MW 3400)和聚乙二醇二苯并三唑碳酸酯(PEG-DiBTC，MW 3400)購自Nektar(Huntsville，AL)。聚乙二醇二-對-硝基苯酚碳酸酯(PEG-DiNPC，MW 3400)得自Sigma(St.Louis，MO)。CPT購自Boehringer Ingelheim(Ingelheim，德國)。人血漿購自Sigma并用DI水重構(gòu)。小鼠血漿是通過離心除去采自BALB/C雌性小鼠(Charles River)的新鮮血樣的血細(xì)胞來進(jìn)行制備的。6A，6D-二碘-6A，6D-二脫氧-β-環(huán)糊精(CDDI，流程圖2)是根據(jù)Hwang等人之前所報道的方法來合成的(Bioconjugate Chem.12，280-290)。去離子水(18-MΩ-cm)是通過使自制去離子水通過Barnstead E-pure純化系統(tǒng)來獲得的。NMR譜是在Bruker AMX 500MHz或Varian 300MHz光譜儀上進(jìn)行記錄的。質(zhì)譜(MS)分析是用配有LCQ離子阱(Thermo Finnigan)并配有電噴霧離子源的電噴霧質(zhì)譜儀或MALDI-TOF質(zhì)譜儀(Voyager DE-PRO，Applied Biosystems)來進(jìn)行的。在配有Hitachi L-6200 Intelligent泵、Anspec RI檢測器(ERC-7512，Erma，Inc.)、Precision Detectors DLS檢測器(PD 2020)和雙凝膠滲透柱(PL-aquagel-OH-408μm 300mm×7.5mm，Polymer Laboratory)(用聚乙二醇標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)并用濃度為20-50m/mL的PBS(1x)在環(huán)境溫度下以0.7mL/分鐘的流速進(jìn)行洗脫)的GPC系統(tǒng)上對該聚合物的MW進(jìn)行分析。在配有UV檢測器(System Gold 168 Detector，Beckman Coulter)和蒸發(fā)性光散射(ELS)檢測器(Sedex 75，Sedere，法國)的HPLC系統(tǒng)上用C-18反相柱來對CD衍生物進(jìn)行分析。在配有熒光檢測器(FD-500，GTI/Spectro Vision，Groton Technology，Inc.)的使用C-18反相柱(HIRPB-4438，4.6×150 mm，Richard Scientific)的HPLC系統(tǒng)上對CPT、CPT衍生物和聚合物-CPT軛合物進(jìn)行分析(用磷酸鉀緩沖液(pH 4.1)和乙腈進(jìn)行梯度洗脫)。熒光檢測器的激發(fā)和發(fā)射波長分別設(shè)定在370nm和440nm上。
實(shí)施例1聯(lián)苯-4，4′-二磺?；?A，D-封端的β-環(huán)糊精，1(Tabushi等人，J.Am.Chem.Soc.106，5267-5270(1984))流程圖XV
向配有磁力攪拌棒、Schlenk適配器和隔膜的500mL圓底燒瓶中加入7.92g(6.98mmol)干燥β-環(huán)糊精和250mL無水吡啶(Aldrich ChemicalCompany，Inc.)。將所得的溶液在氮?dú)庀略?0℃進(jìn)行攪拌，同時以15分鐘的時間間隔將2.204g(6.28mmol)聯(lián)苯-4，4′-二磺酰氯分成四等份加入到其中。將其在50℃下再攪拌3小時后，真空除去溶劑并將殘余物用反相柱色譜進(jìn)行處理，用0-40％的乙腈水溶液進(jìn)行梯度洗脫。用高效液相色譜(HPLC)對這些級分進(jìn)行分析并將適宜的級分合并。在用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去大量乙腈后，將所得的水性混懸液冷凍干燥至干燥。得到3.39g(38％)無色固體形式的1。
實(shí)施例26A，6D-二碘-6A，6D-二脫氧-β-環(huán)糊精，2(Tabushi等人J.Am.Chem.106，4580-4584(1984))流程圖XVI 向配有磁力攪拌棒、Schlenk適配器和隔膜的40mL離心管中加入1.02g(7.2mmol)1、3.54g(21.3mmol)粉狀的干燥碘化鉀(Aldrich)和15mL無水的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)(Aldrich)。將所得的混懸液在80℃下在氮?dú)庀聰嚢?小時。在冷卻至室溫后，通過過濾將固體分離出來并收集上清液。用第二份無水DMF對該固體沉淀進(jìn)行洗滌并將上清液合并，然后將其真空干燥。然后，將殘余物溶解于14mL水中并將其在冰浴上冷卻，然后在迅速攪拌下向其中加入0.75mL(7.3mmol)四氯乙烯(Aldrich)。將沉淀出來的產(chǎn)物用中號玻璃漏斗過濾并用小份丙酮對其進(jìn)行洗滌，然后將其在真空下用P2O5干燥14小時。得到0.90g(92％)白色固體形式的2。
實(shí)施例36A，6D-二-(2-氨基乙硫基)-6A，6D-二脫氧-β-環(huán)糊精，3(Tabushi，IShimokawa，K；Fugita，K.Tetrahedron Lett.1977，1527-1530)流程圖XVII 向配有磁力攪拌棒和隔膜的25mL Schlenk燒瓶中加入0.91mL(7.37mmol)0.81M 2-氨基乙基硫醇鈉的乙醇溶液。(Fieser，L.F.；Fieser，M.有機(jī)合成的試劑；Wiley紐約，1967；第3卷，265-266頁)。將溶液蒸發(fā)至干并將固體重新溶解于5mL無水DMF(Aldrich)中。向其中加入6A，6D-二碘-6A，6D-二脫氧-β-環(huán)糊精(2)(100mg，7.38×10-5mol)并將所得的混懸液在60℃下在氮?dú)庀聰嚢?小時。在冷卻至室溫后，將該溶液真空濃縮并將殘余物重新溶解于水中。在用0.1N HCl酸化后，將該溶液施加到ToyopearlSP-650M離子交換柱(NH4+型)上并將產(chǎn)物用0至0.4M碳酸氫銨梯度洗脫。將適宜的級分合并并將其冷凍干燥至干燥。得到80mg(79％)白色粉末形式的3。
合成二巰乙胺β-CD3的另一種方法向在100mL脫氣了的水中的4.69g(3.17mmol)2的溶液中加入0.489g(6.34mmol)新升華的巰乙胺。將該溶液在回流下攪拌2小時。在冷卻至室溫并用1N HCl酸化后，將該溶液施加到Toyopearl SP-650M離子交換柱(NH4+型)上并用0至0.2M碳酸氫銨對產(chǎn)物梯度洗脫。將適宜的級分合并并將其冷凍干燥至干燥。該方法得到1.87g(收率為39％)白色固體。用TLC(硅膠，n-PrOH-AcOEt-H2O-NH3aq 5/3/3/1，用茚三酮檢測)對該固體定性，該固體表現(xiàn)出與3相一致的主要斑點(diǎn)。用PerSeptive Biosystems，Inc提供的2 meter ELITE儀器記錄基質(zhì)輔助激光解吸/電離(MALDI)飛行時間(TOF)質(zhì)譜。3的MALDI-TOF m/z計算值1252，實(shí)測值1253.5 [M+H]+，1275.5[M+Na]+，1291.4[M+K]+。13C NMR(Bruker 500 MHz，D2O)δppm32.1(S-CH2)和38.8(CH2-NH2)，32.9(與S毗鄰的C6)，60.2(與OH毗鄰的C6)，70.8，71.4，72.5(C2，C3，C5)，81.8(C4)，101.7(C1)。
實(shí)施例46A，6D-二-(2-氨基-2-羧基乙硫基)-6A，6D-二脫氧-β-環(huán)糊精，4(CD-BisCys)流程圖XXIII 將167mL 0.1M碳酸鈉緩沖液在配有磁力攪拌棒、冷凝器和隔膜的500mL雙頸圓底燒瓶中脫氣45分鐘。向該溶液中加入1.96g(16.2mmol)L-半胱氨酸和10.0g(73.8mmol)二碘，脫氧-β-環(huán)糊精2。將所得的混懸液在回流溫度下加熱4.5小時直至該溶液變澄清(無色)。然后，將該溶液冷卻至室溫并用1N HCl將其酸化至pH3。通過緩慢加入丙酮(該溶液的3倍重量比)使產(chǎn)物沉淀。得到9.0g包含CD-二半胱氨酸(90.0％)、未反應(yīng)的環(huán)糊精、CD-單-半胱氨酸和胱氨酸的粗品。將所得的固體用陰離子交換柱色譜(SuperQ650M，Tosoh Bioscience)進(jìn)行純化，用0-0.4M碳酸氫銨梯度洗脫。用HPLC對所有的級分進(jìn)行分析。將所需的級分合并，然后在真空下將溶劑減少至100mL通過加入丙酮或甲醇(溶液的3倍重量比)使終產(chǎn)物沉淀。以60-90％的收率得到4。1HNMR(D2O)δ5.08(m，7H，CD-2-CH)，3.79-3.94(m，30H，CD-3，4-CH，CD-CH2，Cys-CH)，3.49-3.62(m，14H，CD-5，6-CH)，2.2-3.30(m，4H，CyS-CH2)。13C NMR(D2O)δ172.3，101.9，83.9，81.6，81.5，73.3，72.2，72.0，60.7，54.0，34.0，30.6。ESI/MS(m/z)1342[M]+，1364[M+Na]+。用HPLC來確定4的純度。
實(shí)施例56A，6D-二-(羧基甲硫基)-6A，6D-二脫氧-β-環(huán)糊精，5(CDDM)流程圖IXI 將50mL 0.1M碳酸鈉溶液在配有磁力攪拌棒、冷凝器和隔膜的100mL3頸圓底燒瓶中脫氣2小時。向該燒瓶中注射巰基乙酸(0.46mL，6.64mmol)并用1N氫氧化鈉將該溶液的pH調(diào)至9.3。向所得的溶液中加入3.00g(2.21mmol)二-碘-β-環(huán)糊精2并將其在80℃下加熱1小時。每隔一小時將該溶液的溫度增加10℃直至其達(dá)到100℃。將其回流3小時后，將澄清無色的溶液冷卻至室溫并用1N HCl將其酸化至pH 3.5。通過緩慢加入丙酮(該溶液的3倍重量比)得到粗品。將所得的固體用陰離子交換柱色譜進(jìn)行處理，用0-0.4M碳酸氫銨溶液梯度洗脫。得到1.8g(63.4％)無色固體形式的5。ESI/MS(m/z)1281 [M]-。用HPLC來確定該化合物的純度。
實(shí)施例6CD-二(谷氨酸-γ芐酯)6流程圖XX 向配有磁力攪拌棒和冷凝器以及隔膜的50mL圓底燒瓶中加入在5mL脫氣了的0.1M碳酸氫鈉溶液中的0.101g(0.425mmol)H-Glu(Obzl)-OH和0.15g(0.106mmol)二-碘-β環(huán)糊精2。將該溶液混合物在100℃下加熱2小時。然后，將該溶液冷卻至室溫并酸化至pH 4，然后將其在MWCO 500膜中透析24小時。6的收率為0.142g(83.6％)。
實(shí)施例7CD-BiLys(Z)7流程圖XXI 向配有磁力攪拌棒和冷凝器以及隔膜的50mL圓底燒瓶中加入在5mL脫氣了的0.1M碳酸鈉溶液中的0.124g(0.443mmol)H-賴氨酸(Z)-OH和0.15g(0.111mmol)二-碘-β-環(huán)糊精2。將該溶液混合物在100℃下加熱4小時。然后將該溶液過濾并將濾液的pH調(diào)至8.5，然后將其在MWCO 500膜中透析24小時。7的收率為0.124g(68.9％)。
實(shí)施例8β-環(huán)糊精-甲苯磺酸酯，8的合成(Melton，L.D.，和Slessor，K.N.，Carbohydrate Research，18，29頁(1971))流程圖XXII 向配有磁力攪拌棒、真空適配器和隔膜的500mL圓底燒瓶中加入干燥β-環(huán)糊精(8.530g，7.51mmol)和200mL干燥吡啶的溶液。將該溶液冷卻至0℃，然后向其中加入1.29g(6.76mmol)甲苯磺酰氯。使所得的溶液加溫至室溫過夜。在真空下盡可能地除去吡啶。然后，將所得的殘余物用40mL熱水重結(jié)晶兩次，得到7.54(88％)白色結(jié)晶固體8。
實(shí)施例9碘-β-環(huán)糊精，9的合成流程圖XXIII
向配有磁力攪拌棒和Schlenk適配器的圓底燒瓶中加入8、15當(dāng)量碘化鉀和DMF。將所得的混合物在80℃下加熱3小時，其后使該反應(yīng)冷卻至室溫。然后，將該混合物過濾以除去沉淀并將濾液蒸發(fā)至干燥，然后在0℃下將其重新溶解于水中。向其中加入四氯乙烯并將所得的漿液在0℃下劇烈攪拌20分鐘。在中號玻璃漏斗上收集固體9，用丙酮研磨并將其與P2O5一起存放。
實(shí)施例10巰乙胺-β-環(huán)糊精，10的制備流程圖XXIV 向9在100mL進(jìn)行了脫氣的水中的溶液中加入1當(dāng)量新升華的巰乙胺。將該溶液在回流下攪拌2小時。在冷卻至室溫并用1N HCl酸化后，將該溶液施加到Toyopearl SP-650M離子交換柱(NH4+型)上并將產(chǎn)物用碳酸氫銨梯度洗脫。將適宜的級分合并并冷凍干燥至干燥，得到10。
實(shí)施例11Gly-CPT 11的合成(Greenwald等人，Bioorg.Med.Chem.，1998，6，551-562)流程圖XXV
在室溫下將t-Boc-甘氨酸(0.9g，4.7mmol)溶解于350mL無水二氯甲烷中，并在0℃下向該溶液中加入DIPC(0.75mL，4.7mmol)、DMAP(382mg，3.13mmol)和喜樹堿(0.55g，1.57mmol)。使該反應(yīng)混合物加溫至室溫并將其在室溫下放置16小時。將該溶液用0.1N HCl洗滌，干燥并減壓蒸發(fā)，得到一種白色固體，將其用甲醇重結(jié)晶，得到t-Boc-甘氨酸的喜樹堿-20-酯1HNMR(DMSO-d6)7.5-8.8(m)，7.3(s)，5.5(s)，5.3(s)，4(m)，2.1(m)，1.6(s)，1.3(d)，0.9(t)。將t-Boc-甘氨酸的喜樹堿-20-酯(0.595g，1.06mmol)溶解于二氯甲烷(7.5mL)和TFA(7.5mL)的混合物中并將其在室溫下攪拌1小時。除去溶劑并將殘余物用二氯甲烷和乙醚重結(jié)晶，得到0.45g 11。1HNMR(DMSO-d6)δ7.7-8.5(m)，7.2(s)，5.6(s)，5.4(s)，4.4(m)，2.2(m)，1.6(d)，1.0(t)，13CNMR(DMSO-d6)δ168.6，166.6，156.5，152.2，147.9，146.2，144.3，131.9，130.6，129.7，128.8，128.6，128.0，127.8，119.0，95.0，77.6，66.6，50.5，47.9，30.2，15.9，7.9。ESI/MS(m/z)預(yù)期值405；實(shí)測值406(M+H)。
實(shí)施例12GlyGlyGly-CPT 12的合成流程圖XXVI 在室溫下將t-Boc-GlyGlyGly(1.359g，4.7mmol)溶解于350mL無水二氯甲烷中并在0℃下向該溶液中加入DIPC(0.75mL，4.7mmol)、DMAP(382mg，3.13mmol)和喜樹堿(0.55g，1.57mmol)。使該反應(yīng)混合物加溫至室溫并將其在室溫下放置16小時。將該溶液用0.1N HCl洗滌，干燥并將其減壓蒸發(fā)，得到一種白色固體，將其用甲醇重結(jié)晶，得到t-Boc-GlyGIyGly的喜樹堿-20酯1HNMR(DMSO-)δ8.40(s)，8.25(d)，7.91(d)，7.78(m)，7.65(t)，7.26(s)，7.05(br，s)，5.65(d)，5.40(d)，5.25(s)，5.10(br，s)，3.75-4.42(m)，2.1 5-2.3 5(m)，1.45(s)，0.95(t)。將t-Boc-GlyGlyGly的喜樹堿-20-酯(1.5g，1.06mmol)溶解于二氯甲烷(10mL)和TFA(10mL)的混合物中，并將其在室溫下攪拌1小時。在真空下除去溶劑并將殘余物重新溶解于二氯甲烷中。將該溶液傾倒到乙醚中，立即產(chǎn)生沉淀(黃色)。將沉淀濾出并用冷乙醚對其進(jìn)行洗滌，得到1.31g 12。1HNMR(DMSO-d6)δ8.79(s)，7.75-8.61(m)，7.10(s)，5.55(s)，3.90-4.37(m)，3.86(s)，3.54(s)，2.11-2.23(m)，0.95(t)。ESI/MS(m/z)預(yù)期值519；實(shí)測值520(M+H)。
CPT-肽酯鍵的穩(wěn)定性在室溫下將11和12溶解于PBS緩沖液(pH 7.4)中從而制得一種約500μg/mL的溶液。將該溶液進(jìn)一步用8.5％H3PO4稀釋至10μg/mL。用配有C18RP(反相)柱和熒光檢測器的HPLC對水解速率進(jìn)行分析，用50/50(v/v)乙腈/磷酸鉀緩沖液(pH 4.1)進(jìn)行洗脫。將11(或12)和所釋放的CPT(內(nèi)酯形式)的峰積分。酯鍵在水溶液中的穩(wěn)定性是肽-長度依賴性的。因此，可以通過調(diào)節(jié)肽長度來調(diào)節(jié)藥物釋放速率(水解速率)。見圖2。
CPT、11和12在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中的內(nèi)酯穩(wěn)定性將CPT、11或12以1mg/ml的濃度溶解于DMSO中，然后用PBS(1x，pH 7.4)將其稀釋至1μg/mL。在室溫下，以所選擇的時間間隔將30μL該溶液注射到所說的HPLC中。對得自CPT的CPT內(nèi)酯形式、11或12的峰面積積分。
在PBS緩沖液(pH 7.4)中對11、12和CPT的內(nèi)酯開環(huán)速率進(jìn)行研究。對開環(huán)而言，11和12都十分穩(wěn)定，在整個研究過程中(7小時)沒有探測到11和12的羧酸鹽形式。另一方面，在相同的時間內(nèi)，60％以上的CPT內(nèi)酯形式轉(zhuǎn)化成其羧酸鹽形式。(見圖3)實(shí)施例13Lys(BisCBZ)-CPT 13的合成流程圖XXVII
在室溫下將N，N-BisCBZ-賴氨酸(311mg，0.75mmol)溶解于56mL無水二氯甲烷中。在0℃下，向該溶液中加入DIPC(0.12mL，0.75mmol)、DMAP(0.61mg，0.5mmol)和喜樹堿(0.087g，0.25mmol)。使該反應(yīng)混合物加溫至室溫并將其在室溫下放置16小時。將該溶液用0.1N HCl洗滌，干燥，減壓蒸發(fā)，得到一種淺黃色固體，將其用甲醇重結(jié)晶，得到N，N-BisCBZ-Lys13的喜樹堿-20-酯。根據(jù)TLC和HPLC分析，13的純度是令人滿意的。
13在水溶液中水解很慢，用配有UV檢測器的HPLC檢測不到其水解。不僅可以如實(shí)施例12所示那樣通過調(diào)節(jié)肽的長度來調(diào)節(jié)CPT-肽連接基酯鍵的水解速率，而且還可以用直接與CPT的20-OH相連的不同的氨基酸來進(jìn)行調(diào)節(jié)。
也在PBS緩沖液中對CPT和13的內(nèi)酯形式向羧酸鹽形式的轉(zhuǎn)化進(jìn)行了研究。發(fā)現(xiàn)化合物13的內(nèi)酯形式向羧酸鹽形式的轉(zhuǎn)化比游離CPT的轉(zhuǎn)化慢得多，表明可以通過在其20位上與CPT的-OH形成酯來穩(wěn)定內(nèi)酯形式(藥物活性形式)。(見圖4)實(shí)施例14Lys-Gly-CPT 14的合成將11溶解于氯仿中。向其中加入N，N-BiBoc-Lys-NHS(1.0當(dāng)量)，然后加入三乙胺(1.0當(dāng)量)。將該混合物在室溫下攪拌16小時并用水提取兩次，然后用MgSO4干燥。在高真空下除去溶劑，得到N，N-BiBoc-Lys-Gly-CPT。向該化合物中加入等體積CH2Cl2和TFA的混合物并將其在室溫下攪拌1小時。然后，在真空下除去溶劑。將殘余物重新溶解于CHCl3中。向該溶液中加入乙醚以產(chǎn)生產(chǎn)物14。將沉淀用乙醚洗滌數(shù)次，然后將其真空干燥。將其用硅膠柱色譜純化，得到純的TFA鹽形式的14。
實(shí)施例15Suc-Gly-CPT 15的合成將琥珀酸酐的溶液與在無水CHCl3中的11(1當(dāng)量)在存在催化量DMAP和DIEA(1當(dāng)量)的情況下進(jìn)行混合。將該混合物在室溫下攪拌24小時，得到15。通過結(jié)晶將15純化。
實(shí)施例16Glu-Suc-Gly-CPT 16的合成用傳統(tǒng)的DCC/NHS方法將15轉(zhuǎn)化成其NHS酯。然后，將該15的NHS酯與谷氨酸(1.0當(dāng)量)在DMSO中在存在三乙胺的情況下進(jìn)行反應(yīng)。將該溶液加入到乙醚中以使16沉淀。通過結(jié)晶將16純化。
實(shí)施例17Glu-Bis(GlyCPT)17的合成將11和Boc-Glu(NHS)-NHS(0.4當(dāng)量)在CHCl3中在氬氣下混合，然后向該混合物中加入三乙胺(1當(dāng)量)。將該溶液在室溫下攪拌16小時，然后用酸性水對其進(jìn)行洗滌。將有機(jī)層干燥，然后在真空下除去溶劑。將所得的化合物用硅膠柱色譜進(jìn)行純化。然后，將該進(jìn)行了純化的化合物溶解于TFA和CH2Cl2的等體積混合物中。將該混合物在室溫下攪拌1小時，然后將其傾倒到乙醚中。將沉淀17用乙醚洗滌并將其在真空下干燥。
實(shí)施例18環(huán)糊精-喜樹堿18的合成流程圖XXVIII 將CPT(197mg，0.566mmol)抽真空30分鐘。在氬氣下加入無水氯仿(100mL)。在0℃下向其中加入光氣(1.34mL，20％的甲苯溶液)。除去冰浴，然后將該溶液加溫至室溫。兩小時后，在高真空下除去溶劑。向該殘余物中加入無水DMSO(50mL)，然后加入200mg CD-NH2(CyclodextrinTechnology，Inc.)和三乙胺(4mL，過量)。16小時后，將該溶液傾倒到200mL乙醚中。將該沉淀用乙醚充分洗滌，然后干燥。得到167mg黃色粉末(18)(收率為62％)。18的TLC分析(硅膠)Rf＝0(用CHCl3/MeOH v/v＝5/1展開)。CPT的TLC分析Rf＝0.65(用CHCl3/MeOH v/v＝5/1展開)。在水中的溶解度＞10mg/mL。這表明當(dāng)與環(huán)糊精分子共價連接時，CPT在水中的溶解度大大增加(游離CPT在水中的溶解度＜0.004mg/mL)。
實(shí)施例19CDDC-二酐共聚物19、21以及其CPT軛合物20、22的合成流程圖XXIX A將乙二胺四乙酸二酐(25.6mg，0.1mmol)和CDDC(3，125.3mg，0.1mmol)溶解于2mL無水DMSO中。將該溶液在50℃下加熱72小時。向該混合物中加入水，然后加入1N NaOH使pH為大約12。將該聚合物在10,000MWCO膜中透析24小時。在透析膜中觀察到沉淀。除去固體并將剩余的溶液在10,000 MWCO膜中再透析24小時。在冷凍干燥后，得到一種白色粉末19(75mg)。
向該聚合物(19)/DMSO溶液中在存在EDC(2當(dāng)量)、NHS(1當(dāng)量)和DIEA(1.0當(dāng)量)的情況下加入11。將該溶液攪拌16小時，然后將其傾倒到乙醚中。將該沉淀用CH2Cl2充分洗滌直至在洗滌溶液中觀察不到游離藥物。在將其在高真空下干燥后得到化合物20。
B將二亞乙基三胺五乙酸二酐(8.5mg，0.024mmol)和CDDC，3(30mg，0.024mmol)溶解于1-甲基-2-吡啶酮(2mL)中。將該混合物在64℃下攪拌4天，然后將其在10,000 MWCO膜中透析2天。在冷凍干燥后，得到一種白色粉末21(3mg)。
向該聚合物(21)/DMSO溶液中在存在EDC(2當(dāng)量)、NHS(1當(dāng)量)和DIEA(1.0當(dāng)量)的情況下加入11。將該溶液攪拌16小時，然后使其在乙醚中沉淀。將該沉淀用CH2Cl2充分洗滌直至在洗滌液中觀察不到游離藥物。在將其在高真空下干燥后，得到化合物22。
實(shí)施例20CCD-Cys共聚物23以及其CPT軛合物24的合成流程圖XXX 將CCD 1(141.3mg，0.1mmol)和胱氨酸(24mg，0.1mmol)溶解于無水DMSO(0.3mL)和吡啶(0.1mL)中。將該混合物在氬氣下在72℃下攪拌過夜。向其中加入水(10mL)。將沉淀濾出并將濾液在10,000 MWCO膜(Spectra/Por7)中透析48小時。得到一種白色粉末23(8mg)。
將11與23在DMSO中混合。向該溶液中加入EDC(2當(dāng)量)、NHS(1當(dāng)量)和DIEA(1.0當(dāng)量)。將該溶液攪拌16小時，然后用乙醚使其沉淀。將該沉淀用CH2Cl2充分洗滌直至在洗滌溶液中觀察不到游離藥物。在將其在高真空下干燥后得到化合物24。
實(shí)施例21CD-BisGlu-二胺共聚物25以及其CPT軛合物26的合成流程圖XXXI 將CD-二(谷氨酸-γ-芐酯)6和乙二醇二乙胺溶解于無水DMSO中。向該混合物中加入EDC(3當(dāng)量)和磺基-NHS(2當(dāng)量)。將該溶液在室溫下在氬氣下攪拌2天。然后，將該溶液轉(zhuǎn)移到10,000 MWCO透析膜中并將其透析48小時。在冷凍干燥后，得到一種白色粉末。然后，將該固體溶解于DMSO和甲醇溶劑混合物中并將其用H2在存在10％Pd/C催化劑的情況下處理24小時。將該溶液傾倒到乙醚中以析出產(chǎn)物。在將其在高真空下干燥后，得到25。
將11與25在DMSO溶液中混合。向該溶液中加入EDC(2當(dāng)量)、NHS(1當(dāng)量)和DIEA(1.0當(dāng)量)。將該溶液攪拌16小時，然后用乙醚使其沉淀。將該沉淀用CH2Cl2充分洗滌，直至在洗滌溶液中觀察不到游離藥物。在將其在高真空下干燥后，得到化合物26。
實(shí)施例22CDDM-Lys(GlyCPT)聚合物27的合成流程圖XXXH
將CDDM，5和Lys-Gly-CPT，14溶解于無水DMSO中。向該混合物中加入EDC(3當(dāng)量)和磺基-NHS(2當(dāng)量)。將該溶液在氬氣下在室溫下攪拌2天。然后，將該溶液傾倒到乙醚中。將沉淀27在高真空下干燥。實(shí)施例23CDDC-Cys(Boc)共聚物28、CDDC-Cys共聚物29以及其CPT軛合物30的合成流程圖XXXIII 將CDDC(3)和N，N-BiBoc-胱氨酸溶解于無水DMSO中。將EDC(3當(dāng)量)和磺基-NHS(2當(dāng)量)加入到該混合物中。將該溶液室溫下在氬氣下攪拌2天。然后，將該溶液轉(zhuǎn)移到10,000 MWCO透析膜中并將其透析48小時。在冷凍干燥后，得到一種白色粉末CDDC-Cys(Boc)聚合物28。向該白色粉末28中加入HCl和DMSO溶液的混合物。將該溶液在室溫下攪拌1小時，然后再用水用10,000 MWCO膜透析24小時。得到白色固體形式的29。
將Suc-Gly-CPT 15與29在DMSO溶液中混合。向該溶液中加入EDC(2當(dāng)量)、NHS(1當(dāng)量)和DIEA(1.0當(dāng)量)。將該溶液在氬氣下攪拌16小時，然后用乙醚使之沉淀。將該沉淀用乙醚洗滌，直至在洗滌溶液中觀察不到游離藥物。在將其在高真空下干燥后，得到化合物30。
實(shí)施例24可生物降解的CD-聚磷酸酯聚合物31以及其CPT軛合物32的合成流程圖XXXIV 該可生物降解的聚磷酸酯的合成可以參見Wang J等人，JACS，2001，123，9480-9481。
將聚磷酸酯與10(0.5當(dāng)量重復(fù)單元)在DMSO中混合。向該溶液中加入EDC(2當(dāng)量)、NHS(1當(dāng)量)和DIEA(1.0當(dāng)量)。將該溶液攪拌16小時，然后用乙醚使之沉淀。將所得的CD-聚磷酸酯31溶解于DMSO中。向該溶液中加入11(0.5當(dāng)量重復(fù)單元)、EDC(2當(dāng)量)、NHS(1當(dāng)量)和DIEA(1.0當(dāng)量)。將該溶液攪拌16小時，然后用乙醚使之沉淀。將該沉淀用乙醚充分洗滌，直至在洗滌溶液中觀察不到游離藥物。在將其在高真空下干燥后，得到化合物32。
實(shí)施例25通過自由基反應(yīng)進(jìn)行的具有聚乙烯主鏈的CD共聚物-CPT軛合物33的合成流程圖XXXV CPT的丙烯酸酯單體、三甘醇單甲醚和CD-單胱胺可以由N-丙烯氧基琥珀酰亞胺(Polysciences，Inc.)來合成。將這些單體以1∶1∶1的比例在無水DMSO中進(jìn)行混合。在氬氣下向該混合物中加入AIBN。將該溶液在室溫下攪拌24-48小時直至該溶液變粘。用乙醚使聚合物-CPT軛合物33沉淀并將其在真空下干燥。
實(shí)施例26CD-接枝-聚(乙烯-交替-馬來酸酐)-GlyGlyGlyCPT 34的合成流程圖XXXVI 將聚(乙烯-交替-馬來酸酐)(Aldrich)溶解于DMSO中。向其中加入10(0.4當(dāng)量重復(fù)單元)和12(0.4當(dāng)量重復(fù)單元)。將該溶液在70℃下加熱16小時，然后用乙醚使之沉淀。將得到的CD-接枝-聚(乙烯-交替-馬來酸酐)-GlyGlyGlyCPT 34在高真空下干燥。
實(shí)施例27聚谷氨酸酯-CD-CPT軛合物35的合成流程圖XXXVII 將聚谷氨酸酯(得自Sigma-Aldrich)與10(0.5當(dāng)量重復(fù)單元)和11(0.5當(dāng)量重復(fù)單元)在DMSO中混合。向該溶液中加入EDC(3當(dāng)量)、NHS(2當(dāng)量)和DIEA(1.0當(dāng)量)。將該溶液攪拌16小時，然后用乙醚使之沉淀。在將其在高真空下干燥后，得到聚谷氨酸酯-CD-CPT軛合物35。
實(shí)施例28CD-BisCys-Peg3400共聚物36以及其CPT軛合物37的合成和特性描述A.CD-BisCys-Peg3400共聚物36的合成和特性描述流程圖XXXVIIIa
流程圖XXXVIIIb 聚(CDDCys-PA-PEG)，36a的合成將4(在用丙酮沉淀后，63mg，0.047mmol)和PEG-DiSPA(MW 3400，160mg，0.047mmol)在真空下干燥8小時。在氬氣下向該混合物中加入無水DMSO(1.26mL)。在攪拌10分鐘后，在氬氣下向其中加入無水二異丙基乙胺(DIEA，19μL，2.3當(dāng)量)。將該反應(yīng)混合物在氬氣下攪拌120小時。將包含聚合物的溶液用10,000 MWCO膜(Spectra/Por 7)用水透析48小時，將其冷凍干燥，得到196mg 36a(90％，表1)。Mw＝57.4 kDa，Mn＝41.7kDa，Mw/Mn＝1.38。1HNMR(D2O)δ5.08(m，CD-2-H)，4.27(m，Cys-CH)，2.72-3.76(m，CD-3，4，5，6-CH，CD-CH2，PEG-CH2)，2.44(m，Cys-CH2)。
其它聚(CDDCys-PA-PEG)(36b-f)、聚(CDDCys-BA-PEG)(36g)、聚(CDDCys-CB-PEG)(36h-i)的合成在與36a相似的聚合反應(yīng)條件下完成。聚合條件、單體選擇、聚合物分子量、多分散性和收率的詳細(xì)說明如表1所列。36g1HNMR(D2O)δ5.10(m，CD-2-H)，4.25-4.37(m，Cys-CH)，2.72-3.86(m，CD-3，4，5，6-CH，CD-CH2，PEG-CH2)，2.21(m，Cys-CH2)。36h-i1H NMR(D2O)δ5.05(m，CD-2-H)，4.56(m，Cys-CH)，2.70-3.93(m，CD-3，4，5，6-CH，CD-CH2，PEG-CH2)，2.38(m，-OCH2CH2CH2C(O)-NH-)，2.34(m，Cys-CH2)，1.90(m，-OCH2CH2CH2C(O)-NH-)。
對于該聚合反應(yīng)而言，必需加入一種非親核性的有機(jī)堿(如DIEA)，這是因?yàn)槿绻患尤朐搲A的話，在48小時后觀察不到該聚合反應(yīng)溶液的粘度變化。當(dāng)加入2.3當(dāng)量DIEA時，在反應(yīng)4-6小時后，該聚合反應(yīng)溶液的粘度顯著增加。DIEA將4的氨基去質(zhì)子化，從而使其對與PEG-DiSPA的偶聯(lián)而言親核性更強(qiáng)。如果使用其它堿，如TEA或DMAP，在該聚合反應(yīng)中基本沒有差異(36b-c，表1)。使用通過兩種不同的沉淀方法(丙酮和甲醇)回收的4的聚合反應(yīng)產(chǎn)生了具有不同MW的聚合物。與由丙酮沉淀法(36a)獲得的純度較低的4相比，用甲醇沉淀法進(jìn)行純化的4(不包含游離胱氨酸)給出了更高M(jìn)W的聚合物(36d-e)。4與PEG-DiSPA的聚合反應(yīng)一般制備的聚合物收率高于90％。
將4與其它活性單體如PEG-DiSBA、PEG-DiBTC和PEG-DiNPC聚合。4與PEG-DiSBA的反應(yīng)給出了與36a-f具有相似鍵合(酰胺鍵，但是在該連接基上比36a-f多一個-CH2)的Mw高于100kDa的聚合物36g，而4與PEG-DiBTC和PEG-DiNPC的反應(yīng)分別產(chǎn)生了具有連接的氨基甲酸酯部分并且Mw’高于50 kDa的聚合物36h和36i(表1)。
表1.4與雙官能化的PEG的聚合反應(yīng)

a在聚合反應(yīng)前，將4用丙酮洗滌。
b在聚合反應(yīng)前，將4用甲醇洗滌。
聚合物36a-i在水溶液中高度溶解。其可容易地以至少200mg/mL的濃度溶解于水或磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)溶液中。由于其粘度高，所以不嘗試這些聚合物在水溶液中濃度高于200mg/mL的溶解度。這些聚合物還可溶解于DMF、DMSO和甲醇中，微溶于CH3CN和CHCl3，但是不溶于THF和乙醚。
CD聚合物的分子量控制將4(在用甲醇沉淀后)(56.2mg，0.0419mmol)和PEG-SPA(147mg，0.0419mmol)在真空下干燥4-8小時。在氬氣下向該混合物中加入無水DMSO(1.1mL)。在攪拌10分鐘后，在氬氣下向其中加入DIEA(16mL，2.2當(dāng)量)。在所選擇的時間(2小時、18小時、43小時、70小時、168小時和288小時)取出一部分聚合反應(yīng)溶液(150μL)并用乙醚使其沉淀。如上所述那樣測定沉淀出來的聚合物的MW。
如圖5a和5b所示，可以通過調(diào)節(jié)聚合反應(yīng)時間來對分子量進(jìn)行控制。B.聚(CDDCys-PA-PEG)-CPT軛合物(HGGG6、LGGG10、HG6、HGGG10)的合成。
流程圖XXXIX
聚(CDDCys-PA-PEG)-GlyGlyGly-CPT(HGGG6)的合成將36e(1.37g，0.30mmol的重復(fù)單元)溶解于無水DMSO(136mL)中。將該混合物攪拌10分鐘。向該聚合物溶液中加入12(419mg，0.712mmol，2.36當(dāng)量)、DIEA(0.092mL，0.712mmol，2.36當(dāng)量)、EDC(172mg，0.903mmol，3當(dāng)量)和NHS(76mg，0.662mmol，2.2當(dāng)量)并將其攪拌約15小時。將該聚合物用乙醚(1L)沉淀。將乙醚傾倒出來并將沉淀用CH3CN(3×100mL)洗滌。將該沉淀溶解于600mL水中。用0.2μm濾器將一些不溶性固體濾出。將該溶液用25,000 MWCO膜(Spectra/Por 7)在10-15℃下在DI水中透析10小時。每60分換一次透析水。通過使其通過0.2μM濾器將該聚合物-藥物軛合物溶液滅菌。將該溶液冷凍干燥，得到一種黃色固體HGGG6(1.42g，收率為85％)。
聚(CDDCys-PA-PEG)-GlyGlyGly-CPT(LGGG10)的合成12與36f的軛合是以與用于制備HGGG6的方式相似的方式進(jìn)行的，只是該軛合物的透析是用10,000 MWCO膜(Spectra/Por 7)而不是25,000MWCO膜進(jìn)行的。LGGG10的收率為83％。
聚(CDDCys-PA-PEG)-Gly-CPT(HG6)的合成11與36e的軛合是用與制備HGGG6的方式相似的方式進(jìn)行的。HG6的收率為83％。
聚(CDDCys-PA-PEG)-GlyGlyGly-CPT(HGGG10)的合成將36e(1.5g，0.33mmol的重復(fù)單元)溶解于無水DMSO(150mL)中。將該混合物攪拌10分鐘。向該聚合物溶液中加入12(941mg，1.49mmol，4.5當(dāng)量)、DIEA(0.258mL，1.49mmol，4.5當(dāng)量)、EDC(283mg，1.49mmol，4.5當(dāng)量)和NHS(113mg，0.99mmol，3當(dāng)量)并將其攪拌約24小時。向該軛合物溶液中加入另一份EDC(142mg，0.75mmol，2.3當(dāng)量)和NHS(56mg，0.5mmol，1.5當(dāng)量)。將該聚合物再攪拌22小時。該后處理過程是用與HGGG6的合成方法相同的方法進(jìn)行的。HGGG10的收率為77％。
該軛合物上CPT重量％的測定以10mg/mL的濃度制備HGGG6、LGGG10、HG6和HGGG10在DMSO中的儲備液。用1N NaOH將相應(yīng)儲備液的等分試樣稀釋至100μg/mL。CPT在該堿性溶液中在室溫下在2小時內(nèi)完全水解并轉(zhuǎn)化成其羧酸鹽形式。用8.5％H3PO4將該溶液的等分試樣稀釋至10μg/mL，并將CPT羧酸鹽形式轉(zhuǎn)化成其內(nèi)酯形式。將30μL該溶液注射到HPLC中。將CPT內(nèi)酯形式的峰面積積分并將其與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較。
用常規(guī)的偶聯(lián)方法將11和12軛合到36e或36f上(表2)。由于11和12的酯連接基在水溶液中不穩(wěn)定，所以該軛合是在氬氣下在無水DMSO中進(jìn)行的。需要有機(jī)堿來將11和12的TFA鹽去質(zhì)子化以促進(jìn)偶聯(lián)。對于與12的聚合物軛合物而言，藥物負(fù)載量的重量百分比(重量％)為約6-10％。使用MW為3400 Da的PEG時理論上的最大藥物負(fù)載量為約13％；通過降低PEG部分的MW可以增加這些最大值。所有軛合物在水或PBS中的溶解度都高于200mg/mL(對于6-10％的藥物負(fù)載量而言，分別等于12-20mgCPT/mL)。對于HGGG6、LGGG10、HG6和HGGG10的詳細(xì)情況被概括地列于表2中。
表2.聚合物-CPT軛合物的性質(zhì)

a縮寫H＝高M(jìn)w聚合物(97 kDa)，L＝低Mw聚合物(35kDa)，GGG＝三甘氨酸連接基，G＝甘氨酸連接基，6＝約6重量％的藥物負(fù)載量，10＝約10％重量的藥物負(fù)載量。
b用光散射技術(shù)(26)測得的聚合物多分散性
C.CPT從HGGG6和HG6的釋放CPT在PBS中的釋放以1mg/mL的濃度制備在PBS(1x，pH 7.4)中的HGGG6和HG6。將該溶液100μL的等分試樣轉(zhuǎn)移到1.5mL Eppendorf管中并將其在37℃下培養(yǎng)。以所選擇的時間間隔將所培養(yǎng)的樣品停止培養(yǎng)并將其儲存在-80℃下直至進(jìn)行分析。用8.5％H3PO4在容量瓶中將各溶液稀釋至5mL的總體積。將30μL該溶液注射到HPLC中。將CPT內(nèi)酯形式的峰面積積分并將其與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較。
在包含乙酰膽堿酯酶(一種酯酶，100個單位/mL)的PBS中、在KH2PO4緩沖液(pH 6.1，0.1 M)中和在包含組織蛋白酶B(一種半胱氨酸蛋白酶，200μM，在冰浴上在包含2mM DTT和1mM EDTA的該緩沖液中預(yù)活化30分鐘)的KH2PO4緩沖液(pH 6.1，0.1M)中對CPT從HGGG6和HG6的釋放進(jìn)行分析，該分析是用與上面所描述的僅使用PBS時的方式相似的方式進(jìn)行的。
CPT在人血漿中的釋放用PBS(1x，pH 7.4)將HGGG6和HG6儲備液的等分試樣稀釋至0.5mg/mL的終濃度。用推薦量將該溶液加入到人血漿的冷凍干燥粉末以重構(gòu)100％人血漿。將該溶液分成等體積(250μL)放到1.5mL的Eppendorf管中，在37℃下進(jìn)行培養(yǎng)，并在所選擇的時間點(diǎn)停止培養(yǎng)。將樣品儲存在-80℃下直至進(jìn)行分析。用固相萃取柱將這些樣品從血漿中分離出來。在加樣前，將該固相萃取柱(Oasis HLB 1cc柱，得自Waters)先用1mL乙腈，然后用1mL 8.5％H3PO4預(yù)處理。在加樣前，將這些樣品用等體積的8.5％的H3PO4酸化。在將被酸化的溶液裝載到所說的柱上后，用3×1mL水對柱床進(jìn)行洗滌。用3×1mL乙腈和磷酸鉀緩沖液(pH 4.1)的溶液混合物(60/40v/v)對被釋放的CPT和聚合物軛合物進(jìn)行洗脫。在5mL容量瓶中將該洗脫液稀釋至5mL的總體積。將30μL該溶液注射到HPLC中。將CPT內(nèi)酯形式的峰面積積分并將其與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較。
在包含4％人血漿的PBS(PBS/重構(gòu)的人血漿溶液＝96/4(v/v))中、在小鼠血漿中和在重構(gòu)的人白蛋白(PBS溶液)中用與使用純?nèi)搜獫{時的上述方式相似的方式來進(jìn)行CPT從HGGG6和HG6的釋放。
在PBS(1x，pH 7.4)中，CPT從HG6和HGGG6釋放的半衰期(t1/2)分別為59小時和32小時。在存在4％人血漿的情況下，該半衰期分別降至25小時和22小時，在100％人血漿(“HP”)中分別降至1.7小時和1.6小時，并且在100％小鼠血漿(“MP”)中分別降至2.6小時和2.2小時。在存在白蛋白(“Alb”)或乙酰膽堿酯酶(“Ac Cho”)的情況下CPT從HG6和HGGG6的釋放速率都與在PBS中的數(shù)量級相同。在含或不含有酶——組織蛋白酶B(在6.1的pH下有活性)的pH低于PBS的緩沖溶液(pH 6.1)中，在長達(dá)144小時的時間內(nèi)從HG6和HGGG6釋放了小于總軛合的CPT的50％的CPT(表3)。
表3.CPT從HG6和HGGG6a釋放的半衰期(t1/2，小時)

at1/2被定義為軛合的總CPT釋放一半時的時間(小時)。
縮寫HP指的是人血漿，MP指的是小鼠血漿。
bpH 7.4 PBS 1x緩沖液。
c與PBS混合的重構(gòu)的人血漿(v/v＝4/96)。
d重構(gòu)的人血漿。
e新鮮的小鼠血漿f在重構(gòu)的人白蛋白PBS緩沖液中g(shù)在存在乙酰膽堿酯酶的PBS溶液(100個單位/mL)中。
bpH 6.1的磷酸鹽緩沖液(0.1M)i存在組織蛋白酶B的pH 6.1的磷酸鹽緩沖液
CPT在不同pH溶液中的釋放。
將HGGG6和HG6在pH范圍為酸性(pH＝1.2)至堿性(pH＝13.1)的緩沖液中制備為1mg/mL的濃度并將其在37℃下培養(yǎng)24小時。用8.5％H3PO4將各溶液的等分試樣稀釋至約100μg/mL。將30μL該溶液注射到HPLC中。將CPT內(nèi)酯形式的峰面積積分并將其與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較。
水溶液的pH對CPT從HG6和HGGG6的釋放速率有顯著影響。圖6說明了在pH范圍為1.1至13.1的緩沖液中24小時后，在37℃下從HG6和HGGG6釋放的CPT的量。因?yàn)樵?4小時內(nèi)釋放的CPT少于7％，所以HG6和HGGG6的甘氨?；?CPT酯鍵在酸性pH(1.1至6.4)下十分穩(wěn)定。
通過MTT測定獲得的IC50人卵巢癌A2780細(xì)胞系得自European Collection of Cell Cultures(Salisbury，Wiltshire，UK)。人結(jié)腸直腸腺癌HT29、人前列腺癌PC-3和人結(jié)腸腺癌LS174T細(xì)胞系得自American Type Culture Collection(Rockville，MD)。將這些細(xì)胞以5000個細(xì)胞/孔的濃度接種到96-孔板中并使之在5％CO2的潮濕氣氛下，在包含10％胎牛血清的培養(yǎng)基中在37℃下生長24小時。將該培養(yǎng)基用以1nm至10μM CPT和36e(對于HGGG6和HG6而言為CPT當(dāng)量)的濃度包含CPT、36e、HGGG6或HG6的新鮮培養(yǎng)基替代。在各濃度下，對每個板的三個孔進(jìn)行處理。在72小時后，通過MTT測定來測量這些化合物對細(xì)胞生長的作用。除去培養(yǎng)基，將這些細(xì)胞用PBS清洗，以0.5mg/mL的濃度加入MTT溶液，并且將這些板在37℃下培養(yǎng)4小時。除去培養(yǎng)基并且將甲結(jié)晶溶解于DMSO中。用SPECTARFluor Plus板式讀數(shù)器(Tecan，Durham，NC)在560nm下來測量吸收度。相對于未進(jìn)行處理的細(xì)胞來計算細(xì)胞存活百分比，并且IC50是由用劑量對細(xì)胞存活作的圖來測得的。CPT、36e、HGGG6或HG6的IC50數(shù)據(jù)如表4所列。
表4.CPT、未軛合的聚合物36e和CPT軛合物HG6和HGGG6在各種細(xì)胞系中的IC50

實(shí)施例29聚-CD-BisCys-Peg3400-Ala-CPT 37將36e(54mg，0.012mmol重復(fù)單元)溶解于無水DMSO(226mL)中并將其攪拌10分鐘。向該聚合物溶液中加入與11相似地制備的TFA-Ala-CPT(15mg，0.028mmol，2.36當(dāng)量)、DIEA(4.88mL，0.028mmol，2.36當(dāng)量)、DCC(24.52mg，0.12mmol，10當(dāng)量)和NHS(13.6mg，0.12mmol，10當(dāng)量)。將該混合物攪拌約16小時。用乙醚(40mL)使該聚合物沉淀并用乙醚(2×30mL)和CH3CN(2×10mL)對其進(jìn)行洗滌。然后，將其重新溶解于pH4的水溶液(10mL)中并在室溫下將其用25,000 MWCO膜透析48小時。然后，使該溶液通過無菌的0.2μm濾器，然后將其冷凍干燥，得到37(46mg，85％)。在用堿使CPT從37釋放后，用配有熒光檢測器的HPLC計算得到的藥物負(fù)載重量百分比為5.5％。37中的游離CPT＜1％。
實(shí)施例30聚-CD-BisCys-Peg3400-Leu-CPT 38將36e(54mg，0.012mmol重復(fù)單元)溶解于無水DMSO(226mL)中并將其攪拌10分鐘。向該聚合物溶液中加入與11相似地制備的TFA-Leu-CPT(16mg，0.028mmol，2.36當(dāng)量)、DIEA(4.88mL，0.028mmol，2.36當(dāng)量)、DCC(24.52mg，0.12mmol，10當(dāng)量)和NHS(13.6mg，0.12mmol，10當(dāng)量)。將該混合物攪拌約16小時。用乙醚(40mL)使該聚合物沉淀并用乙醚(2×30mL)和CH3CN(2×10mL)對其進(jìn)行洗滌。然后，將其重新溶解于pH 4的水溶液(10mL)中并將其用25,000 MWCO膜在室溫下透析48小時。然后，使該溶液通過一種無菌的0.2μm濾器，然后將其冷凍干燥，得到38(42mg，78％)。在用堿使CPT從38釋放后，用配有熒光檢測器的HPLC計算得到的藥物負(fù)載重量百分比為5.0％。38中的游離CPT＜1％。
實(shí)施例31CD-BisCys-BisPeg-FITC 39的合成流程圖XXXX 將4(25mg，0.0186mmol)和FITC-Peg5000-NHS(Shearwater，186mg，0.0373mmol)溶解于無水DMSO(2mL)中。向該混合物中加入DIEA(0.0094mL，0.056mmol，3當(dāng)量)。將該混合物放置在黑暗中并攪拌24小時。然后向其中加入水(10mL)并將該溶液在黑暗中用10,000 MWCO透析約48小時。在冷凍干燥后，得到一種黃色聚合物39。用MS和1HNMR對該聚合物定性。
實(shí)施例32二-琥珀酰亞胺基琥珀酸酯Peg3400(二-SS-PEG)(40a)和可生物降解的CD-BisCys-SS-Peg3400(40b)以及其CPT軛合物41的合成流程圖XXXXI
向配有磁力攪拌棒和隔膜的100mL圓底燒瓶中加入10g(2.99mmol)聚乙二醇(Mw 3350)、2.0g(20mmol)琥珀酸酐和50mL無水吡啶。將該溶液在50℃下攪拌16小時，然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去溶劑。將殘余物重新溶解于30mL水中并用10mL氯仿萃取三次。將有機(jī)層用MgSO4干燥并過濾。然后，將溶劑濃縮并使其在乙醚中沉淀。以90.6％的收率得到9.6g二-琥珀酰亞胺基Peg3400。用反相高效液相色譜對產(chǎn)物進(jìn)行分析。
向配有磁力攪拌棒和隔膜的100mL圓底燒瓶中加入2g(0.56mmol)二-琥珀酰亞胺基Peg3400和10mL無水二氯甲烷。向該溶液中加入0.324g(2.82mmol)N-羥基琥珀酰亞胺。然后，將該溶液混合物在冰浴上冷卻并向其中加入0.58g(2.82mmol)1，3-二環(huán)己基碳二亞胺。將其在室溫下放置24小時后，將該溶液過濾并使之在150mL乙醚中沉淀。將用10mL二氯甲烷溶解和用乙醚沉淀的過程重復(fù)進(jìn)行兩次。得到1.74g(82.9％)Bis-SS-PEG 40a。用反相高效液相色譜對其進(jìn)行分析。
CD-BisCys-SS-Peg3400聚合物40b向50-mL珍珠形燒瓶中加入100mg(0.0746mmol)4和254mg(0.0746mmol)40a。將合并的固體在真空下干燥24小時，然后加入1mL無水DMSO和2.2當(dāng)量(0.164mmol)DIEA。將該溶液混合物在室溫下攪拌3天，然后使之在乙醚中沉淀。得到100％40b。用配有AnspecRI檢測器、Precision Detectors DLS檢測器和Progel-TSK G3000PWXL柱的HitachiHPLC系統(tǒng)對分子量進(jìn)行分析，用0.1M PBS作為洗脫劑以0.7mL·min-1的流速洗脫。Mw＝93,000，Mn＝61,000，Mw/Mn＝1.5。
CD-BisCys-SS-Peg3400-GlyGlyGly-CPT軛合物41將40b(201.8mg，0.044mmol重復(fù)單元)、TFA-GlyGlyGly-CPT 12(66mg，0.105mmol，2.36當(dāng)量)、EDC(25.5mg，0.133mmol，3當(dāng)量)和NHS(11mg，0.0977mmol，2.2當(dāng)量)溶解于無水DMSO(6mL)中并攪拌30分鐘。向該聚合物溶液中加入DIEA(19μL，0.105mmol，2.36當(dāng)量)。將該混合物攪拌約41小時。用乙醚(250mL)使該聚合物沉淀并用乙腈(3×25mL)對其進(jìn)行洗滌。然后，將其重新溶解于pH 4的水(10mg/mL)中并用10,000 MWCO膜在室溫下透析24小時。然后，使該溶液通過無菌的0.2μm濾器，然后冷凍干燥，得到41(128mg，52％)。在用堿使CPT從41釋放后，用配有熒光檢測器的HPLC計算得到的藥物負(fù)載量百分比為6.95％。
在1mg/mL下在人血漿(100％溶液)中進(jìn)行41的水解。將這些溶液的等分試樣(100μL)放置在1.5mL的eppendorf管中并將其在37℃的水浴中進(jìn)行培養(yǎng)。然后，將這些樣品用100μL 8.5％H3PO4酸化并將其施加到進(jìn)行了預(yù)處理的固相萃取柱上。用60∶40(v/v)的乙腈KH2PO4緩沖液進(jìn)行洗脫。用乙腈/KH2PO4緩沖液在HPLC/熒光檢測器上對游離CPT(內(nèi)酯型)進(jìn)行分析。測得半衰期為3小時。
CD-BisCys-SS-Peg3400聚合物40b的降解用在PBS(pH 7.4)溶液中重構(gòu)的人血漿制備50mg/mL的40b溶液。將100μL等分試樣在37℃下進(jìn)行培養(yǎng)。在特定的時間點(diǎn)將各樣品取出并使之在900μL冷甲醇中沉淀。將該溶液離心并用HPLC/ELS檢測器對上清液進(jìn)行分析。所得圖譜如圖7所示。
用于增加藥物負(fù)載量重量百分比的方法方法I.具有短Peg鍵的CD-BisCys-Peg共聚物以及其GlyCPT軛合物的合成實(shí)施例33CD-BisCys-Peg(短PEG，例如，Peg200-Peg2000)以及其CPT軛合物42的合成流程圖XXXXII 聚合物和藥物軛合物42的合成與實(shí)施例28中的36、37和38相同。
方法II.在各負(fù)載部位上有多個藥物分子的CD-BisCys-Peg共聚物的合成。
實(shí)施例34CD-BisCys-Peg以及其Glu二(GlyCPT)軛合物43的合成。
流程圖XXXXIII
將36和Glu-Bis(Gly-CPT)17溶解于DMSO中。向該溶液中加入EDC(3當(dāng)量)、NHS(2.2當(dāng)量)和DIEA(2.2當(dāng)量)。用CH3CN使CD-BisCys-Peg-Glu二(GlyCPT)43沉淀并用相同的溶劑對其進(jìn)行洗滌直至用UV或TLC檢測不到游離藥物。將43在高真空下干燥。
實(shí)施例35PEI-CD-CPT軛合物44(具有CPT軛合物的分支CD-聚合物)的合成A分支PEI-環(huán)糊精聚合物的合成流程圖XXXXIV 將PEI(29mg，Aldrich Mw 25,000)溶解于無水DMSO(2mL)中。在N2下向該溶液中加入環(huán)糊精單甲苯磺酸酯(448mg，Cyclodextrin TechnologiesDevelopment，Inc.)。將其在70℃下攪拌約1小時后，該渾濁的溶液變澄清。在N2下，在該溫度下48小時后，該溶液略微變黃。
將該溶液轉(zhuǎn)移到Spectra/Por MWCO 10,000膜上并將其用水透析4天。然后，通過冷凍干燥除去水。將該溶液冷凍干燥后，得到一種白色粉末(120-140mg)。根據(jù)1HNMR的質(zhì)子積分來計算環(huán)糊精/PEI比例。
B分支PEI-CD-CPT軛合物的合成流程圖XXXXV
將PEI-CD和Suc-Gly-CPT 15(1.0當(dāng)量)溶解于DMSO中。向該溶液中加入EDC(3當(dāng)量)、NHS(2.2當(dāng)量)和DIEA(1當(dāng)量)。用乙醚使PEI-CD-Gly-CPT 44沉淀，用該溶劑充分進(jìn)行洗滌，并將其在高真空下干燥。
實(shí)施例36Ad-PEG3400-Ad 45的合成流程圖XXXXVI 將240mg 1-氨基金剛烷(1.60mmol，Aldrich)和272mg PEG3400(SPA)2(0.080mmol，Shearwater Polymers)加入到配有攪拌棒的玻璃小瓶中。向其中加入5mL二氯甲烷，將該溶液攪拌一整夜。第二天，將該溶液過濾以除去該N-羥基琥珀酰亞胺副產(chǎn)物并在真空下除去二氯甲烷。將該殘余物溶解于水中并離心以除去過量的1-氨基金剛烷。然后，在Pierce′s Slide-A-Lyzer中用MWCO＝3500將該上清液透析一整夜。然后，將該溶液冷凍干燥，得到248mg白色絨毛狀固體形式的Ad-PEG3400-Ad 45。
實(shí)施例37二環(huán)糊精PEG 46的合成將362mg CD-NH2(0.32mmol，Cyclodextrin Technology，Inc.)和436mg PEG3400(SPA)2(0.128mmol，Shearwater Polymers)加入到配有攪拌棒的玻璃小瓶中。向該小瓶中加入4.36mL DMSO，并將該溶液攪拌72小時。將該溶液用2000 MWCO膜在水中透析4天。在冷凍干燥后，得到白色粉末形式的46(603mg，86％)。
實(shí)施例38使用DiAD-Peg 45和DiCD-PEG 46進(jìn)行的包合聚合物47的合成將46(54.6mg，0.01mmol)和45(34mg，0.01mmol)在水(0.27mL)中混合并將其攪拌一整夜。該溶液十分粘。用醚使聚合物47沉淀出來并將其真空干燥。
實(shí)施例39DiCD-PEG 46和CPT-Di-AD化合物之間包合聚合物CPT-軛合物48的合成二金剛烷交聯(lián)劑二-(2-(1-金剛烷基)乙基)磷酸酯的合成(Zhang等人，J.Am.Chem.Soc 1997，119，1676-1681)流程圖XXXXVII 將無水吡啶(10mL，Aldrich，Milwaukee，WI)在冰浴上冷卻并向其中滴加二氯磷酸甲酯(1.488g，10mmol，Aldrich，Milwaukee，WI)。將該混合物保持冷卻15分鐘。在此期間，形成N-甲基吡啶鎓二氯磷酸鹽沉淀。向其中加入1-金剛烷乙醇(4.758g，26.4mmol，Aldrich，Milwaukee，WI)，將密封的混合物在室溫下攪拌一整夜。然后，將其傾倒到10％NaHCO3溶液(50mL)中并在真空下蒸發(fā)掉吡啶。將該略微發(fā)黃的固體溶解于1L水中并用乙醚對其進(jìn)行萃取(3×150mL)。將水相用2N HCl酸化至pH 1，然后用三份CHCl3n-BuOH(7∶3)(每份150mL)萃取。將所合并的有機(jī)層(乙醚和CHCl3n-BuOH)用水進(jìn)行洗滌，在該混合溶劑中形成一種略帶黃色的沉淀，此時在真空下蒸發(fā)掉溶劑。形成一種略帶黃色的固體，用丙酮/己烷將其重結(jié)晶。將該固體真空干燥，收率為60％。
流程圖XXXXVIII 將二-(2-(1-金剛烷基)乙基)磷酸酯和11在DMSO中混合。向該溶液中加入EDC(3當(dāng)量)、NHS(2.2當(dāng)量)和DIEA(1當(dāng)量)。將該溶液在氬氣下攪拌16小時。用乙醚使二-(2-(1-金剛烷基)乙基)磷酸酯-Gly-CPT沉淀，將其用該溶劑充分洗滌，將其在高真空下干燥。將該化合物和Di-CD-PEG 46在DMSO中混合從而形成包合聚合物-CPT軛合物48。
實(shí)施例40AD-Peg-葉酸酯49的合成下面是合成AD-Peg5000-葉酸酯的步驟。該方法適于合成任何客體分子-連接基-配體三組分分子。
1.AD-Peg-NH2的合成將266mg FMOC-PEG5000-NHS(78.2μmol，Shearwater Polymers，Huntsville AL)加入到配有磁力攪拌棒的玻璃小瓶中。然后，向其中加入10當(dāng)量溶解于3mL二氯甲烷中的1-金剛烷-甲胺(1.5mmol，Aldrich)并將該溶液在室溫下攪拌一整夜。在真空下除去溶劑并向剩余的溶液中加入水以使該P(yáng)EG產(chǎn)物溶解。將該溶液在20 K ref下離心10分鐘，從而以更濃稠的液體形式將金剛烷-甲胺相分離出來。收集水性部分并在真空下除去水。將剩余的粘性液體重新溶解于20％哌啶的DMF溶液以將FMOC去保護(hù)并將其在室溫下攪拌30分鐘。在真空下除去溶劑，用DMF洗滌幾次，將其重新溶解于水中，在陰離子交換柱上展開以除去未反應(yīng)的PEG。收集第一級分并將其冷凍干燥，得到222mg白色絨毛狀粉末形式的所需產(chǎn)物(收率為76％)，通過MALDI-TOF分析確定了其是所需的產(chǎn)物。
2.N-羥基琥珀酰亞胺-葉酸酯(NHS-葉酸酯)的合成流程圖XXXXIX NHS-葉酸酯是根據(jù)Lee和Low(Lee，R.J；Low，P.S.J.Biol.Chem.1994，269，3198-3204)的方法來合成的。將葉酸(5g，11.3mmol；Sigma)溶解于DMSO(100mL)和三乙胺(2.5ml)中并使其與N-羥基琥珀酰亞胺(2.6g，22.6mmol)和二環(huán)己基碳二亞胺(4.7g，22.7mmol)在室溫下反應(yīng)一整夜。將該溶液過濾并使其在減壓下濃縮。用乙醚使NHS-葉酸酯沉淀(黃色-橙色沉淀)，并用無水乙醚將其洗滌2-3次，真空干燥并儲存在-20℃下。
3.AD-Peg5000-葉酸酯流程圖L
將AD-Peg5000-NH2和NHS-葉酸酯以1∶1當(dāng)量在DMSO溶液中混合。向其中加入DIEA(2當(dāng)量)。將該混合物在室溫下攪拌一整夜。然后，將DMSO溶液用3500 MWCO(Spectra/Por 7)膜透析48小時。在冷凍干燥后，得到AD-Peg5000-葉酸酯49。
實(shí)施例41AD-Peg-葉酸酯和CD-聚合物-CPT軛合物的形成一種典型方法將CD-聚合物CPT軛合物溶解于D5W緩沖液中。向該聚合物溶液中加入包含0.1-1當(dāng)量(重復(fù)單元的摩爾數(shù))AD-Peg-葉酸酯溶液的D5W溶液。在加入AD-Peg-葉酸酯前和加入后用光散射測定聚合物的粒度。將該溶液用于對葉酸酯靶向作用進(jìn)行分析的體外或體內(nèi)試驗(yàn)。
實(shí)施例42靶向配體(例如，葉酸酯)與CD-CPT聚合物軛合物(例如PEI-CD-GlyCPT)的共價連接50流程圖LI 將PEI-CD-GlyCPT 44和葉酸酯-NHS(0.1-0.5當(dāng)量)在DMSO中混合并將其攪拌24小時。用乙醚使該聚合物沉淀并用該溶劑將其充分洗滌直至檢測不到游離葉酸酯分子。將所得的CD-聚合物-CPT-葉酸酯軛合物50真空干燥。
實(shí)施例43用Ad-Peg-Ad進(jìn)行的CD-CPT聚合物的交聯(lián)51一種典型方法將AD-Peg-AD 45(0.01-0.1當(dāng)量的CD-聚合物重復(fù)單元)和CD-聚合物CPT軛合物在最少量的DMSO中混合。用乙醚使所得的粘性溶液沉淀并將其在真空下干燥，得到輕微交聯(lián)的聚合物51。51在溶液中仍然維持小粒度、具有良好的水溶性、并且具有高于母體CD-聚合物CPT軛合物的分子量。
實(shí)施例44喜樹堿聚合物軛合物HGGG6、LGGG10、HG6和HGGG10(根據(jù)實(shí)施例28進(jìn)行合成)的體內(nèi)試驗(yàn)。
A.用母體聚合物36e給藥進(jìn)行的體內(nèi)毒性和血液化學(xué)分析用雌性Charles River裸鼠(13-14周大)對36e的毒性以及其對血液化學(xué)的影響進(jìn)行評估。將每組6只小鼠的4個治療組在第1、5和9天分別通過尾靜脈注射劑量為240mg/kg、160mg/kg、80mg/kg 36e的D5W溶液或僅注射D5W來進(jìn)行處理。根據(jù)20g小鼠注射200μl的比例來確定給藥體積，并且根據(jù)小鼠的實(shí)際體重適當(dāng)?shù)卦黾踊驕p少。在前五天每天都記錄小鼠的體重，然后每周測定兩次。在第12天，在異氟烷麻醉下通過眼眶后取血由各小鼠采集血樣(150-200μl)。在各組中用得自三只小鼠的血樣來進(jìn)行全血液計數(shù)(CBC)分析，同時對各組中得自剩余三只小鼠的血樣進(jìn)行處理以進(jìn)行血液化學(xué)分析。在第23天終止該研究。通過在CO2下心臟穿刺使所有的小鼠安樂死，收集得自各小鼠的血，按照與第12天相同的方式進(jìn)行CBC和血液化學(xué)分析。
在研究期間，在36e處理組和D5W對照組之間，在體重降低、CBC或血液化學(xué)數(shù)據(jù)方面都沒有顯著差異，并且對于所有治療組而言，在23天內(nèi)都沒有觀察到時間依賴性的作用。在最大處理劑量(240mg/kg)下，36e可以被小鼠良好耐受。
B.CDP-CPT軛合物最大耐受劑量(MTD)的測定.
用雌性Charles River裸鼠(15-16周大)來測定HG6、LGGG10、HGGG10的MTD。在每次注射前，新制備該聚合物-CPT軛合物的5％(w/v)葡萄糖溶液(D5W)。治療組的劑量為2.25mg CPT/kg至54mg CPT/kg。給藥是在第1、5和9天通過尾靜脈注射來靜脈內(nèi)(i.v.)給藥的。根據(jù)20g小鼠注射200μl的比例來確定給藥體積，并且根據(jù)小鼠的實(shí)際體重(BW)來適當(dāng)增加或減少。各治療組使用三至五只小鼠。在前五天每天都記錄小鼠的體重，然后每周測定兩次。將MTD定義為使得平均組BW降低小于20％的最高給藥劑量或不會使該組任何動物死亡的最高給藥劑量。在表5中列出了所有治療組的最大平均體重降低和與治療有關(guān)的死亡。
表5.MTD研究的劑量響應(yīng)。通過尾靜脈注射對裸鼠(n＝3-6)進(jìn)行靜脈內(nèi)處理。

a對于CDP聚合物而言為mg CDP/kg，對于三種受試軛合物而言為mg CPT/kg。
b注射后觀察到的最大體重(BW)降低c與治療有關(guān)的死亡數(shù)(NTR)/被治療的小鼠數(shù)(N)測得LGGG10、HG6和HGGG10的MTD分別為36mg CPT/kg、9mgCPT/kg和9mg CPT/kg。由于HGGG6和HGGG10之間的結(jié)構(gòu)相似性，預(yù)期這兩組的MTD相似。因此，推測HGGG6的MTD(沒有進(jìn)行試驗(yàn))為9mg CPT/kg。
C.抗腫瘤功效研究。
用雌性Charles River裸鼠(15-16周大)來進(jìn)行抗腫瘤功效研究。在給藥前約14-18天，將人LS174T結(jié)腸癌組織片斷(1mm3)皮下(s.c.)植入到各試驗(yàn)小鼠的右側(cè)腹。通過用卡鉗在兩維上對腫瘤進(jìn)行測量并用下面的公式進(jìn)行計算來對腫瘤體積進(jìn)行測定腫瘤體積＝(長×寬2)/2。假定1mm3等于1mg重的腫瘤，將腫瘤體積轉(zhuǎn)化成腫瘤重量。當(dāng)平均腫瘤大小達(dá)到約60-100mg時開始進(jìn)行治療(第1天)。將動物分成12組。各組包括腫瘤大小為62.5-144.0mg的7只小鼠，各組的平均腫瘤大小為88.6-90.7mg。根據(jù)表6所列的方案對各組中的小鼠進(jìn)行處理。所有的軛合物治療都是通過尾靜脈注射來靜脈內(nèi)給藥的。在實(shí)驗(yàn)期間，每周測量兩次腫瘤大小。在研究結(jié)束時，從被安樂死的各小鼠采集腫瘤并將其冷凍在-80℃下。
表6.功效研究的給藥方案a


a各組使用7只小鼠b除第3組外，劑量是CPT的當(dāng)量ci.p.＝腹膜內(nèi)，i.v.＝靜脈內(nèi)d給藥時間表被縮寫為Q4D×3＝四天注射三次，Qwk×3＝一周注射三次，對于所有組而言，在第1天開始給予第一個劑量e由于出現(xiàn)毒性，沒有按計劃給予第三個劑量f100mg伊立替康/kg當(dāng)腫瘤重量達(dá)到預(yù)定的終點(diǎn)大小(1,500mg)時將各動物安樂死。由下面的方程計算各小鼠的時間-至-終點(diǎn)(TTE)TTE＝(log(終點(diǎn)-b))/m，其中b和m分別是通過將轉(zhuǎn)化成log形式的腫瘤生長數(shù)據(jù)組(包含超過該研究終點(diǎn)體積的第一次觀察和即將達(dá)到終點(diǎn)體積之前的三次連續(xù)觀察)線性回歸獲得的直線的截距和斜率。沒有達(dá)到終點(diǎn)的動物被指定為TTE值等于該研究的最后一天(114天)。被歸類為與治療有關(guān)的死亡(TR)的動物被指定為TTE值等于死亡的那一天。不計算被歸類為與治療無關(guān)的死亡(NTR)的動物的TTE。被定義為與對照組相比，治療組中至終點(diǎn)的時間中值(TTE)增加的腫瘤生長延遲(TGD)是一種用來評估治療功效的研究參數(shù)。通過治療組TTE中值和對照組TTE中值之間的差異來計算TGD(TGD＝T-C)并用天數(shù)來進(jìn)行表示，并且將其表示為對照組TTE中值的百分比；％TGD＝(T-C)/C，其中T等于治療組的TTE中值，C等于對照組，即第1組的TTE中值。毒性。在第1-5天每天都對動物進(jìn)行稱重，其后每周稱重兩次。經(jīng)常對小鼠任何明顯的與藥物有關(guān)的不良作用進(jìn)行檢查。NCI將癌癥藥物在小鼠中可接受的毒性定義為研究期間一組的平均體重降低小于20％，并且在7只被治療動物中由于毒性而死亡的動物不多于一只。
在表7中概括地列出了包括TTE值中值、在第114天時腫瘤負(fù)荷的中值、治療響應(yīng)和死亡在內(nèi)的該功效研究的結(jié)果。
表7.

aTTE＝至終點(diǎn)(1500mg)的時間(天數(shù))bT-C＝治療組與對照組TTE(天數(shù))之間的差異cTGD％＝[(T-C)/C]d小鼠存活eNTR＝與治療有關(guān)的死亡數(shù)fNNTR＝與治療無關(guān)的死亡數(shù)
gNEU＝在達(dá)到終點(diǎn)后安樂死的小鼠數(shù)h對D5W治療組(組1)的P值i對CPT治療組(組2)的P值在第72天時在用D5W進(jìn)行處理的對照動物中觀察到一個NTR死亡。在其它六個對照小鼠中的腫瘤生長至1500mg的終點(diǎn)大小，產(chǎn)生34.9天的TTE中值(表7)。
對于9mg/kg的CPT而言，在第9天報道了兩例與治療有關(guān)的死亡。因此，必需考慮CPT在該實(shí)驗(yàn)中在這一劑量下是有毒的。相對于未進(jìn)行處理的小鼠而言，這一組的TTE中值為51.4天，相當(dāng)于16.5天的T-C和47％的TGD(不顯著)。在第2組中，沒有動物可以活到114天。
第三組以100mg/kg(Qwk×3)的劑量i.p.使用伊立替康。相對于對照小鼠而言，第3組的TTE中值為68.7天，相當(dāng)于有顯著意義的33.8天的T-C和97％的TGD(P＜0.01)。有三只動物存活到了第114天，腫瘤負(fù)荷中值為1,152mg。沒有記錄到腫瘤消退。
第4組和第5組分別以9和4.5mg CPT/kg的劑量i.v.使用HGGG6(Q4D×3)。在第4組，在第16天觀察到一例與治療有關(guān)的死亡，在第5組中在第37天記錄了一例NTR死亡。第4組的TTE中值為114天，其是該研究中可以獲得的最大可能值。相對于對照而言，該值相當(dāng)于具有顯著意義的79.1天的T-C和227％的TGD(P＜0.01)。第4組中有五只小鼠的腫瘤沒有達(dá)到1,500mg的終點(diǎn)。這五只小鼠在第114天具有256mg的腫瘤負(fù)荷中值。第5組的TTE中值為65.6天，相對于對照而言，相當(dāng)于有顯著意義的30.7天的T-C和88％的TGD相一致(P＜0.01)。
第6-8組分別用LGGG10以36、18和9mg CPT/kg的劑量i.v.處理(Q4D×3)。雖然在MTD研究中用該軛合物在36mg CPT/kg下在不荷瘤小鼠中沒有觀察到死亡(表5)，但是當(dāng)以該劑量給予荷瘤小鼠時在第6組中記錄了四例與治療有關(guān)的死亡，在第16天兩例，在第75和100天各一例。這些結(jié)果表明36mg CPT/kg可能超過了LGGG10的MTD。如表5所示，當(dāng)以18mg CPT/kg的劑量對小鼠進(jìn)行給藥時在MTD研究中沒有記錄到顯著的體重降低，表明該劑量低于該MTD。因此，LGGG10的MTD位于18至36mg CPT/kg之間的某處。第7組(18mg CPT/kg)的TTE中值為75.6天。相對于對照小鼠而言，該TTE值相當(dāng)于具有顯著意義的40.7天的T-C和117％的TGD(P＜0.01)。在第114天，該組中的三只小鼠具有221mg的腫瘤負(fù)荷中值。在第8組(9mg CPT/kg)中在第103天記錄了一例晚期的TR死亡。第8組的TTE中值為63.2天。相對于對照而言，該TTE值相當(dāng)于具有顯著意義的28.3天的T-C和81％的TGD(P＜0.01)。在第114天，該小組剩余的小鼠的腫瘤負(fù)荷為700mg。
第9組和第10組分別以9和4.5mg CPT/kg的劑量i.v.給予HG6(Q4Dx 3)。在第47和84天，在第10組中分別記錄了一例TR和一例NTR死亡。第9組的TTE中值為最大值114天。相對于未進(jìn)行處理的對照小鼠而言，該TTE值相當(dāng)于具有顯著意義的79.1天的T-C和227％的TGD(P＜0.01)。在第114天，在第9組中，四只小鼠具有394mg的腫瘤負(fù)荷中值。第10組的TTE中值為74.2天。相對于對照小鼠而言，該TTE值相當(dāng)于具有顯著意義的39.3天的T-C和113％的TGD(P＜0.01)。在第114天，第10組中剩余的兩只小鼠具有668mg的腫瘤負(fù)荷中值。
第11組和第12組分別以9和4.5mg CPT/kg的劑量i.v.給予HGGG10。在第11組中，在第16天記錄了一例與治療有關(guān)的死亡。第11組和第12組的TTE中值分別為114天和78天。相對于對照小鼠而言，第11組的TTE值相當(dāng)于具有顯著意義的79.1天的T-C和227％的TGD(P＜0.01)。
第11組中有五只小鼠的腫瘤沒有達(dá)到終點(diǎn)；在第114天，這五只小鼠具有500mg的腫瘤負(fù)荷中值。相對于對照小鼠而言，第12組的TTE值相當(dāng)于具有顯著意義的43.1天的T-C和123％的TGD(P＜0.01)。在第114天，該組中剩余的兩只小鼠具有1,010mg的腫瘤負(fù)荷中值。
對于DSW、CPT、伊立替康、其最高無毒試驗(yàn)劑量下(18mg CPT/kg)的LGGG10以及在其MTD下的其它三種與高M(jìn)W聚合物的軛合物(HGGG6、HG6、HGGG10)而言，腫瘤生長與時間的關(guān)系曲線如圖8所示。與D5W、CPT和伊立替康相比，以其MTD給藥的三種高M(jìn)W軛合物表現(xiàn)出更長時間的腫瘤生長抑制。圖9所示的HGGG6、HG6和HGGG10的腫瘤生長中值曲線表明當(dāng)以其MTD和其MTD的一半的劑量進(jìn)行給藥時，這三種聚合物有不同的劑量響應(yīng)。如圖10所述，各自以9mg CPT/kg的劑量給藥的LGGG10和HGGG10的腫瘤生長中值曲線證明，當(dāng)與低MW軛合物相比時，高M(jìn)W聚合物-藥物軛合物具有更高的抗腫瘤作用，推測其可能是由于累積增強(qiáng)(EPR作用)和腎清除率降低導(dǎo)致的。小鼠的平均體重降低。用D5W、CPT、伊立替康和以其MTD給藥的三種包含高M(jìn)W聚合物的軛合物的平均體重(MBW)降低對時間作圖(圖11)。在第2組(CPT)中觀察到的和在其MTD下給藥的含有三甘氨酸連接基的兩種軛合物(第4組和第11組)中觀察到的最大MBW降低分別為13.1％、18.3％和12.6％。HG6(唯一帶有一個甘氨酸連接基的軛合物)的最大MBW降低(3.4％)與所記錄的伊立替康的最大MBW降低(5.0％)相似。所有其它治療組和D5W組中記錄的最大組平均體重降低可忽略不計(＜5％)。在停止治療后，所有治療組的平均體重恢復(fù)到基準(zhǔn)水平。
D.安樂死小鼠的腫瘤大小和相應(yīng)腫瘤中CPT濃度的相關(guān)性將在LS174t異種移植物小鼠研究結(jié)束時由小鼠獲得的各腫瘤解凍并將其放置到2mL溶胞管(Lysing Matrix D，Qbiogen)中。向各管中加入300μL溶胞試劑(Cellytic-MT Mommalian組織溶解/提取試劑)。將該組織在FastPrep FP12勻漿器(Qbiogen)中在5m/s下勻漿40秒。以10分鐘的間隔將該勻漿重復(fù)連續(xù)勻漿六次。將該被勻漿的溶液在10℃下在14000g下離心15分鐘。將90μL該溶液用注射器吸取出來并向其中加入10μL 1NNaOH。使該勻漿的溶液在室溫下放置2小時后，向該溶液中加入400μLMeOH。將該溶液在14000g下離心15分鐘。將上清液(270μL)與30μL 1NHCl混合并將其注射到HPLC中以進(jìn)行分析。CPT濃度(ng/mg組織)與腫瘤大小(mg)的相關(guān)性如圖12所示。CPT濃度與腫瘤大小反相相關(guān)。
實(shí)施例45通過酰胺連接基進(jìn)行的聚(CDDC-PEG)-兩性霉素B 52的合成流程圖LII 將聚(CDDC-PEG)(788mg)和1，1′-羰基二咪唑(CDI，1.45g，50當(dāng)量)在無水DMSO(10mL)中在存在DMAP(429mg，20當(dāng)量)的情況下攪拌16小時。向該混合物中加入乙醚(200mL)從而使得聚(CDDC-PEG)-羰基-咪唑沉淀。將所得的黃色固體用乙醚2×200mL洗滌并將其在真空下干燥。將該固體溶解于無水DMSO(15mL)中，然后加入AmB(332mg，2當(dāng)量)和DMAP(43.0mg，2當(dāng)量)。將該溶液在黑暗中攪拌48小時并用25000MWCO膜在水中透析3天。然后，將該溶液用0.2μm濾器過濾并將其冷凍干燥。得到一種黃色固體(920mg)52。AmB的重量％為大約13％。
實(shí)施例46通過亞胺連接基進(jìn)行的聚(CDDC-PEG)-兩性霉素B 53的合成 將3和PEG-DiSPA(比例為1∶1)在室溫下真空干燥。向該固體中加入DMSO(10mg 3/mL DMSO)，然后向該混合物中加入DIEA(2當(dāng)量)。5天后用過量的乙醚使聚合物沉淀出來并用25000 MWCO膜將其透析48小時。聚(CDDC-PEG)的收率為80-95％。用GPC測得聚合物的Mw為70-100kDa。
將聚(CDDC-PEG)(1.124g，0.25mmol)溶解于水(55mL)中。向其中加入NaIO4(0.264g，5當(dāng)量)。將該溶液在黑暗中在室溫下攪拌20分鐘并將其在4℃下在黑暗中儲存24小時。向該溶液中加入BaCl2溶液(5.05當(dāng)量)，立即產(chǎn)生Ba(IO4)2沉淀。濾掉沉淀。加入飽和Na2CO3溶液以將pH調(diào)至11。向該溶液中加入兩性霉素B(343mg，1.5當(dāng)量)并將其在室溫下在黑暗中攪拌48小時。在反應(yīng)期間，通過加入NaOH(0.1 N)將該溶液的pH維持為11。用25000 MWCO將該溶液在4℃下透析48小時并將其冷凍干燥，得到1.03g黃色粉末形式的聚合物-AmB軛合物53。用UV分光計在405nm下測得AmB的重量％為18。
D.參考資料在US申請09/203,556、09/339,818、09/453,707、10/021,294和10/021,312中公開了可以根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)進(jìn)行改變的另外的包含環(huán)糊精的聚合物以及制備該類聚合物的方法，所有這些申請在這里都被全部引入作為參考。
在這里所列舉的所有參考資料、專利和公開物都在這里被引入作為參考。
等價形式本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到或能在最多使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)的情況下確定大量本文所述化合物以及其使用方法的等價形式。認(rèn)為該類等價形式也在本發(fā)明的范圍內(nèi)并且被下面的權(quán)利要求所覆蓋。
權(quán)利要求
1.式I所示的化合物 其中P表示直鏈或支鏈聚合物鏈；CD表示環(huán)糊精部分；L1、L2和L3每次出現(xiàn)時可以各自獨(dú)立地不存在或表示連接基基團(tuán)；D每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示治療劑或其前體藥物；T每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示靶向配體或其前體；a、m和v每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示1至10的整數(shù)；n和w每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示0至約30,000的整數(shù)；并且b表示1至約30,000的整數(shù)；其中P包含環(huán)糊精部分或者n至少為1。
2.如權(quán)利要求1所述的化合物，其中所說的聚合物鏈包含n′個單位的U，其中n′表示1至約30,000的整數(shù)；并且U如下面的通式所示 其中CD表示環(huán)糊精分子或其衍生物；L4、L5、L6和L7每次出現(xiàn)時可以各自獨(dú)立地不存在或表示連接基基團(tuán)；D和D′每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示相同或不同的治療劑或其前體藥物；T和T′每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示相同或不同的靶向配體或其前體；f和y每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示1至10的整數(shù)；和g和z每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示0至10的整數(shù)。
3.式II所示的化合物 其中P表示聚合物的單體單元；T每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示靶向配體或其前體；L6、L7、L8、L9和L10每次出現(xiàn)時可以各自獨(dú)立地不存在或表示連接基基團(tuán)；CD每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示環(huán)糊精部分或其衍生物；D每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示治療劑或其前體藥物形式；m每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示1至10的整數(shù)；o表示1至約30,000的整數(shù)；和p、n和q每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示0至10的整數(shù)，其中CD和D在該化合物中各自存在至少一次。
4.式III所示的化合物 其中CD表示環(huán)糊精分子或其衍生物；L4、L5、L6和L7每次出現(xiàn)時可以各自獨(dú)立地不存在或表示連接基基團(tuán)；D和D′每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示相同或不同的治療劑或其前體藥物；T和T′每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示相同或不同的靶向配體或其前體；f和y每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示1至10的整數(shù)；h表示1至約30,000的整數(shù)；和g和z每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示0至10的整數(shù)，其中出現(xiàn)至少一次的g表示大于0的整數(shù)。
5.如權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的化合物，其中所說的連接基基團(tuán)表示其中一個或多個亞甲基任選地被基團(tuán)Y替代(條件是Y不彼此相鄰)的亞烴基，其中各Y每次出現(xiàn)時各自選自取代或未取代的芳基、雜芳基、環(huán)烷基、條環(huán)烷基或-O-、C(＝X)(其中X是NR1、O或S)、-OC(O)-、-C(＝O)O、-NR1-、-NR1CO-、-C(O)NR1-、-S(O)n-(其中n是0、1或2)、-OC(O)-NR1、-NR1-C(O)-NR1-、-NR1-C(NR1)-NR1-和-B(OR1)-；并且R1每次出現(xiàn)時各自獨(dú)立地表示H或低級烷基。
6.如權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的化合物，其中所說的連接基基團(tuán)表示氨基酸或肽或其衍生物。
7.如權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的化合物，其中所說的治療劑是小分子、肽、蛋白質(zhì)或具有治療活性的聚合物。
8.如權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的化合物，其中所說的治療劑是疏水性的(log P＞0.4、0.6、0.8、1)。
9.如權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的化合物，其中所說的治療劑具有低的水溶性。
10.如權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的化合物，其中治療劑或靶向配體通過可生物水解的鍵被共價連接到所說的連接基基團(tuán)上。
11.如權(quán)利要求10所述的化合物，其中所說的可生物水解的鍵選自酯、酰胺、碳酸酯或氨基甲酸酯。
12.如權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的化合物，其中所說的治療劑選自抗癌、抗真菌、抗細(xì)菌、抗霉菌或抗病毒的治療劑。
13.如權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的化合物，其中所說的治療劑是受體激動劑。
14.如權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的化合物，其中所說的治療劑是受體拮抗劑。
15.如權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的化合物，其中所說的化合物是可生物降解的或可生物侵蝕的。
16.如權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的化合物，其中所說的化合物具有1,000至500,000amu的數(shù)均(Mn)分子量。
17.如權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的化合物，其中所說的聚合物具有5,000至200,000amu的數(shù)均(Mn)分子量。
18.如權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的化合物，其中所說的聚合物具有10,000至100,000amu的數(shù)均(Mn)分子量。
19.一種包含藥學(xué)賦形劑和如權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的化合物或其可藥用的酯、鹽或水合物的藥物制劑。
20.包含治療有效量的一種或多種如權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的化合物的藥物劑型。
21.一種對動物進(jìn)行治療的方法，其包括施用治療有效量的一種或多種如權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的化合物。
22.一種進(jìn)行藥學(xué)商務(wù)的方法，其包括a.制造一種包含權(quán)利要求1、2、3或4中任意一項(xiàng)所述的化合物的藥物組合物的制劑或試劑盒；和b.向健康護(hù)理人員推廣介紹在疾病或病癥的治療中用所說的制劑或試劑盒獲益。
23.一種進(jìn)行藥學(xué)商務(wù)的方法，其包括a.提供一種銷售權(quán)利要求1、2、3或4中任意一項(xiàng)所述的化合物的藥物組合物的分銷網(wǎng)絡(luò)；和b.為患者或醫(yī)生提供用所說的制劑來治療疾病或病癥的說明材料。
24.一種進(jìn)行藥學(xué)商務(wù)的方法，其包括a.確定如權(quán)利要求1、2、3或4任意一項(xiàng)所述化合物的藥物組合物的適宜制劑和劑量；b.就在動物中的功效和毒性而言，確定步驟(a)中所確定的制劑的治療特性；和c.提供用于銷售在步驟(b)中確定的具有可接受的治療特性的制劑的分銷網(wǎng)絡(luò)。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其包括提供用于向健康護(hù)理人員推廣介紹所說制劑的銷售團(tuán)隊。
26.一種進(jìn)行藥學(xué)商務(wù)的方法，其包括a.確定如權(quán)利要求1、2、3或4中任意一項(xiàng)所述化合物的藥物組合物的適宜制劑和劑量；和b.許可第三方對該制劑進(jìn)一步進(jìn)行開發(fā)和銷售的權(quán)力。
27.一種制備如權(quán)利要求1、2、3或4所述化合物的方法。
28.一種改性的環(huán)糊精環(huán)，其中恰好有兩個羥基部分被氨基酸的氮或硫原子代替。
29.如權(quán)利要求28所述的改性的環(huán)糊精環(huán)，其中所說的氨基酸是α-氨基酸。
30.如權(quán)利要求29所述的改性的環(huán)糊精環(huán)，其中所說的氨基酸是半胱氨酸、色氨酸、谷氨酸、天門冬氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸或精氨酸。
31.如權(quán)利要求28所述的改性的環(huán)糊精環(huán)，其中所說的氨基酸被包含在含有2至50個氨基酸殘基的寡肽內(nèi)。
32.如權(quán)利要求31所述的改性的環(huán)糊精環(huán)，其中所說的寡肽含有2-30個氨基酸殘基。
33.如權(quán)利要求31所述的改性的環(huán)糊精，其中所說的寡肽含有2-15個氨基酸殘基。
34.一種包含環(huán)糊精的線性水溶性聚合物，其中有多個生物活性部分通過在生理學(xué)條件下可以裂解從而釋放出生物活性部分的連接被共價連接到聚合物上，其中將所述聚合物給藥于患者時可以產(chǎn)生生物活性劑的釋放。
35.如權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的化合物，其中的治療劑選自減食欲劑、抗關(guān)節(jié)炎藥、止喘藥、抗驚厥藥、抗抑郁劑；抗組胺藥、抗炎劑、止惡心藥、抗腫瘤藥、止癢劑、抗精神病藥物、退熱劑、鎮(zhèn)痙劑、心血管制劑、抗高血壓藥、利尿劑、血管舒張藥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮劑、咳嗽和感冒制劑、減充血劑、診斷劑、激素、骨生長促進(jìn)劑和骨再吸收抑制劑、免疫抑制劑、肌肉松弛藥、精神興奮劑、鎮(zhèn)靜劑、安定藥、抗炎劑、抗癲癇劑、麻醉劑、安眠劑、鎮(zhèn)靜劑、精神抑制劑、抗抑郁劑、抗焦慮劑、抗驚厥劑、神經(jīng)阻滯劑、抗膽堿能藥和擬膽堿能藥、抗毒蕈堿藥和毒蕈堿藥、抗腎上腺素能藥、抗心律失常藥和抗高血壓藥。
全文摘要
本發(fā)明涉及新型的用作小分子治療劑傳遞載體的包含環(huán)糊精的治療性的高分子化合物組合物以及其藥物組合物。當(dāng)體內(nèi)應(yīng)用時，這些包含環(huán)糊精的聚合物改善了藥物穩(wěn)定性和溶解度，并降低了小分子治療劑的毒性。此外，通過對各種連接基基團(tuán)和靶向配體進(jìn)行選擇，這些聚合物給出了用于控制治療劑的傳遞的方法。本發(fā)明還涉及用本文所述的治療組合物對個體進(jìn)行治療的方法。本發(fā)明還涉及用于進(jìn)行藥學(xué)商務(wù)的方法，其包括制造、許可或分銷包含或涉及本文所述的高分子化合物的試劑盒。
文檔編號A61K47/48GK1694728SQ03824829
公開日2005年11月9日 申請日期2003年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月6日
發(fā)明者程建軍, M·E·戴維斯, K·T·金 申請人:植入療法公司