專利名稱：用于降低眼內(nèi)壓的8－氮雜前列腺素類似物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及作為強(qiáng)效降眼壓藥的8-氮雜前列腺素(8-azaprostaglandin)類似物，它們特別適合用作青光眼的治療。
背景技術(shù)：
降眼壓藥用于治療多種高眼壓病癥，例如手術(shù)后和激光小梁切除術(shù)后高眼壓發(fā)作、青光眼，以及作為手術(shù)前輔助藥物。
青光眼是一種以眼內(nèi)壓升高為特征的眼病。從病原學(xué)上講，青光眼可以分為原發(fā)性和繼發(fā)性。例如，成人原發(fā)性青光眼(先天性青光眼)可以是開角型或者急性或慢性閉角型。繼發(fā)性青光眼由已有的葡萄膜炎、眼內(nèi)腫瘤或白內(nèi)障增大等眼病引起。
原發(fā)性青光眼的病因尚不清楚。眼內(nèi)壓增高是由于房水外流障礙引起的。在慢性開角型青光眼中，前房和其解剖結(jié)構(gòu)看起來正常，但是，房水流出受阻。在急性或慢性閉角型青光眼中，前房較淺，過濾角狹窄，虹膜可能阻礙了Schlemm管入口處的小梁網(wǎng)。擴(kuò)張瞳孔可以將虹膜根部前推至過濾角，可能形成瞳孔阻塞，因此造成急性發(fā)作。前房角狹窄的眼球容易發(fā)生嚴(yán)重程度不一的急性閉角型青光眼。
繼發(fā)性青光眼的形成原因則是房水由后房到前房及Schlemm管的流動(dòng)受阻。前段炎癥性疾病可能造成虹膜膨隆后粘連，從而阻止房水流出，流出物充滿排出管。其他常見的原因是眼內(nèi)腫瘤、白內(nèi)障增大、視網(wǎng)膜中央靜脈栓塞、眼外傷、手術(shù)和眼內(nèi)出血。
在40歲以上人群中，各種類型的青光眼的總發(fā)生率為約2％，在進(jìn)展至迅速喪失視力之前可能有多年的無癥狀期。在不需手術(shù)的情況下，一般用于治療青光眼的藥物是b-腎上腺素受體拮抗劑。
據(jù)報(bào)導(dǎo)某些類花生酸及其衍生物具有降眼壓活性，被推薦用于青光眼的治療。類花生酸及其衍生物包括多種生物學(xué)上重要的化合物，例如前列腺素及其衍生物。前列腺素可以視為具有如下結(jié)構(gòu)式的前列腺烷酸的衍生物
已知有多種前列腺素，它們的結(jié)構(gòu)和在前列腺烷酸骨架脂環(huán)上取代基不同。進(jìn)一步的分類是基于側(cè)鏈上不飽和鍵的數(shù)目和脂環(huán)上取代基的構(gòu)型，前者是在前列腺素大類后加上數(shù)字下標(biāo)表示[如前列腺素E1(PGE1)、前列腺素E2(PGE2)]，后者通過α或β表示[如前列腺素F2α(PGF2β)]。
原來認(rèn)為前列腺素具有很強(qiáng)的升高眼壓的作用，但是，最近十年來，越來越多的證據(jù)表明，某些前列腺素是高效的降眼壓藥，非常適合用于青光眼的長(zhǎng)期治療(參見例如Bito，L.Z.Biological Protection withProstaglandins，Cohen，M.M.，ed.，Boca Raton，F(xiàn)la，CRC Press Inc.，1985，pp231-252；and Bito，L.Z.，Applied Pharmacology in theMedical Treatment of Glaucomas Drance，S.M.and Neufeld，A.H.Eds.，New York，Grune & Stratton，1984，pp.477-505)。這些前列腺素包括PGF2α、PGF1α、PGE2和這些化合物的某些脂溶性酯，如C1到C2烷基酯，包括1-異丙基酯。
盡管確切的機(jī)制尚不清楚，但是試驗(yàn)證據(jù)顯示，前列腺素導(dǎo)致的眼內(nèi)壓降低是由于增加葡萄膜鞏膜外流[Nilsson et al.，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.(suppl)，284(1987)]。
已經(jīng)證實(shí)PGF2α的異丙基酯較母體化合物的降眼壓作用更明顯，推測(cè)是由于其可以更有效地透過角膜。1987年，該化合物被稱為“迄今報(bào)導(dǎo)的最有效的降眼壓藥”[參見例如Bito，L.Z.，Arch.Ophthalmol.105，1036(1987)和Siebold et al.，Prodrug 53(1989)]。
盡管前列腺素似乎沒有明顯的眼內(nèi)副作用，但是人局部使用這些化合物特別是PGF2α和其前藥如1-異丙基酯時(shí)，常常伴有眼表面(結(jié)膜)充血和異物感。這些副作用極大地限制了前列腺素在伴隨眼內(nèi)壓增高的病癥中的臨床應(yīng)用。
在轉(zhuǎn)讓給Allergan公司的一系列共同未決的美國(guó)專利申請(qǐng)中，公開了降眼壓活性更高，同時(shí)沒有副作用或者副作用明顯降低的前列腺素酯。共同未決的USSN596,430(申請(qǐng)日1990年10月10日，現(xiàn)為美國(guó)專利5,446,041)涉及某些11-?；?前列腺素，如11-新戊酰、11-乙酰、11-異丁酰、11-戊酰和11-異戊酰PGF2α。在共同未決的申請(qǐng)USSN175,476(申請(qǐng)日1993年12月29日)公開了降低眼內(nèi)壓的15-?；傲邢偎?。同樣，也已知前列腺素的11，15-9，15和9，11-二酯如11，15-二新戊酰PGF2α具有降眼壓活性。可參見共同未決的專利申請(qǐng)USSN385,645(申請(qǐng)日1989年7月7日，現(xiàn)為美國(guó)專利4,994,274)、584,370(申請(qǐng)日1990年9月18日，現(xiàn)為美國(guó)專利5,028,624)和585,284(申請(qǐng)日1990年9月18日，現(xiàn)為美國(guó)專利5,034,413)。所有上述專利申請(qǐng)的公開內(nèi)容在此引入。
8-氮雜前列腺素類似物在PCT專利申請(qǐng)WO 01/46140 A1中公開。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及治療眼內(nèi)壓升高的方法，包括向眼內(nèi)壓升高的哺乳動(dòng)物給予治療有效量的式I化合物， 其中，陰影線表示α構(gòu)型，三角形表示β構(gòu)型，波浪線表示α或β構(gòu)型，虛線表示存在或者不存在雙鍵；D表示共價(jià)鍵或者CH2、O、S或者NH；X是CO2R，CONR2，CH2OR，P(O)(OR)2，CONRSO2R，SONR2或者 Y是 Z是CH2或者共價(jià)鍵；R是H或者R2；
R1是H、R2、苯基或者COR2；R2是C1-C5低級(jí)烷基或者鏈烯基，R3選自R2、苯基、噻吩基、呋喃基、吡啶基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、萘基或者其取代衍生物，其中取代基可以選自C1-C5烷基、鹵素、CF3、CN、NO2、NR2、CO2R和OR。
另一方面，本發(fā)明涉及一種藥物，含有適合以計(jì)量形式分配其內(nèi)容物的一種容器；和在容器中的如上定義的眼用溶液。
最后，以下公開并在本發(fā)明方法中使用的上式的某些化合物是新的和非顯而易見的。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明涉及8-氮雜前列腺素類似物作為降眼壓藥的用途。用于本發(fā)明的化合物具有以下結(jié)構(gòu)式I 本發(fā)明化合物中優(yōu)選基團(tuán)包括具有以下結(jié)構(gòu)式II的化合物。
在上式中，取代基和符號(hào)同以上定義。
在上式中優(yōu)選D代表共價(jià)鍵或者CH2；更優(yōu)選D是CH2。
優(yōu)選Z代表共價(jià)鍵。
優(yōu)選R是H或者C1-C5低級(jí)烷基。
優(yōu)選R1是H。
優(yōu)選R3選自苯基和其單取代衍生物，例如氯代和三氟甲基苯基。
優(yōu)選X是CO2R，更優(yōu)選R選自H和乙基。
本發(fā)明的上述化合物可以通過本領(lǐng)域的已知方法或者下文工作實(shí)施例制備。以下化合物是本發(fā)明化合物的特別優(yōu)選的代表。
7-[2S-[3R-羥基-4-(苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸；7-[2S-[3R-羥基-4-(苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯；7-[2S-[4-(3-氯-苯基)-3R-羥基-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸；7-[2S-[4-(3-氯-苯基)-3R-羥基-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯；7-[2S-[3R-羥基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸；7-[2S-[3R-羥基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯；7-[2S-[3-氧-4-(苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸；7-[2S-[3-氧-4-(苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯；7-[2S-[4-(3-氯-苯基)-3-氧-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸；7-[2S-[4-(3R-氯-苯基)-3-氧-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯；7-[2S-[3-氧-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸；7-[2S-[3-氧-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯；7-[2S-[3R-羥基-4-(氯-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸；7-[2S-[3R-羥基-4-(氯-苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸；7-[2S-[3R-羥基-4-(氯-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯；7-[2S-[3R-羥基-4-(氯-苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯；7-[2S-[4-(3-氯-苯基)-3-氧-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸；7-[2S-[4-(3-氯-苯基)-3-氧-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸；7-[2S-[4-(3-氯-苯基)-3-氧-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯；7-[2S-[4-(3-氯-苯基)-3-氧-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯；7-[2S-[3R-羥基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸；7-[2S-[3R-羥基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸；7-[2S-[3R-羥基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯；7-[2S-[3R-羥基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯；
7-[2S-[3-氧-4-(三氟甲基苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸；7-[2S-[3-氧-4-(三氟甲基苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸；7-[2S-[3-氧-4-(三氟甲基苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯；7-[2S-[3-氧-4-(三氟甲基苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯；7-[2S-[3R-羥基-(4-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸；7-[2S-[3R-羥基-(4-苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸；7-[2S-[3R-羥基-(4-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯；7-[2S-[3R-羥基-(4-苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯；7-[2S-[3-氧-4-(苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸；7-[2S-[3-氧-4-(苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸；7-[2S-[3-氧-4-(苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯；7-[2S-[3-氧-4-(苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯；藥物組合物可以通過將治療有效量的至少一種本發(fā)明的化合物或其酸加成鹽作為活性成分與常規(guī)的眼科用藥物賦形劑混和制備，并可以制成適于眼局部應(yīng)用的單位劑量形式。治療有效量一般是在液體制劑中約含0.0001到約5％(w/v)，優(yōu)選約0.001到約1.0％(w/v)。
在眼科應(yīng)用時(shí)，優(yōu)選使用生理鹽水作為主要賦形劑制備溶液。這種眼用溶液的pH優(yōu)選用合適的緩沖系統(tǒng)維持在6.5到7.2。制劑也可以含有常規(guī)的可藥用防腐劑、穩(wěn)定劑和表面活性劑。
用于本發(fā)明藥物組合物的優(yōu)選防腐劑包括但不限于苯扎氯銨、三氯叔丁醇、硫柳汞、醋酸苯汞和硝酸苯汞。優(yōu)選的表面活性劑可以是Tween80。同樣，多種優(yōu)選的賦形劑可以用于本發(fā)明的眼科用制品中。這些賦形劑包括但不限于聚乙烯醇、聚維酮、羥丙基甲基纖維素、聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物、羧甲基纖維素、羥乙基纖維素和純凈水。
必要或者方便時(shí)也可以加入張力調(diào)節(jié)劑。它們包括但不限于鹽(特別是氯化鈉、氯化鉀)、甘露醇、甘油或任何其它眼科用張力調(diào)節(jié)劑。
調(diào)節(jié)pH的各種緩沖液和方式均可使用，只要所得制劑是眼科上適用的。因此，緩沖液包括乙酸緩沖液、檸檬酸緩沖液、磷酸緩沖液和硼酸緩沖液。必要時(shí)酸或堿可以用來調(diào)節(jié)這些制劑的pH。
同樣，可用于本發(fā)明的眼科用抗氧化劑包括但不限于焦亞硫酸鈉、硫代硫酸鈉、乙酰半胱氨酸、丁基化羥基茴香醚和丁基化羥基甲苯。
可以包括在眼科制品中的其它賦形劑成分是鰲合劑。優(yōu)選的鰲合劑是乙二胺四乙酸二鈉(edentate disodium)，但也可以用其它鰲合劑替代或者與其共用。
這些成分通常以下述用量使用成分 用量(％w/v)活性成分約0.001-5防腐劑 0-0.10賦形劑 0-40張力調(diào)節(jié)劑 1-10緩沖液 0.01-10pH調(diào)節(jié)劑適量pH4.5-7.5抗氧化劑視需要表面活性劑 視需要純凈水 視需要加至100％活性化合物的實(shí)際用量取決于具體化合物和要治療的病癥；選擇合適的劑量由本領(lǐng)域技術(shù)人員用常規(guī)方法即可確定。
本發(fā)明的眼科用制劑包裝成適于計(jì)量應(yīng)用的形式，如包裝于具有滴管的容器中，以方便眼用。適于點(diǎn)滴使用的合適容器通常由合適的惰性無毒塑料材料制成，通常含有約0.5到約15毫升溶液。
本發(fā)明通過以下非限制性實(shí)施例進(jìn)一步說明。
實(shí)施例17-[2S-[3R-羥基-4-(氯-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸實(shí)施例1a7-[2S-[3R-羥基-4-(氯-苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸實(shí)施例27-[2S-[3R-羥基-4-(氯苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯實(shí)施例2a7-[2S-[3R-羥基-4-(氯苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯實(shí)施例37-[2S-[4-(3-氯-苯基)-3-氧-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸實(shí)施例3a
7-[2S-[4-(3-氯-苯基)-3-氧-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸實(shí)施例47-[2S-[4-(3-氯-苯基)-3-氧-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯實(shí)施例4a7-[2S-[4-(3-氯-苯基)-3-氧-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯實(shí)施例57-[2S-[3R-羥基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸實(shí)施例5a7-[2S-[3R-羥基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸實(shí)施例67-[2S-[3R-羥基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯實(shí)施例6a7-[2S-[3R-羥基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯實(shí)施例77-[2S-[3-氧-4-(三氟甲基苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸實(shí)施例7a7-[2S-[3-氧-4-(三氟甲基苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸實(shí)施例87-[2S-[3-氧-4-(三氟甲基苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯實(shí)施例8a7-[2S-[3-氧-4-(三氟甲基苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯實(shí)施例1到8a的化合物按照已公開的PCT專利申請(qǐng)WO 01/46140的實(shí)施例1和2的方法制備，該文獻(xiàn)在此引入。
實(shí)施例97-[2S-[3R-羥基-(4-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸實(shí)施例9a7-[2S-[3R-羥基-(4-苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸實(shí)施例107-[2S-[3R-羥基-(4-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯實(shí)施例10a7-[2S-[3R-羥基-(4-苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯實(shí)施例117-[2S-[3-氧-4-(苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸實(shí)施例11a7-[2S-[3-氧-4-(苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸實(shí)施例127-[2S-[3-氧-4-(苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯實(shí)施例12a7-[2S-[3-氧-4-(苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯實(shí)施例9到12a的化合物通過制備實(shí)施例1到8的化合物的方法類似的方法制備，但是用[3-(苯基)-2-氧-丙基]-磷酸二甲酯取代[3-(3-氯-苯基)-2-氧-丙基]-磷酸二甲酯。這些化合物的體外活性按照下述方法測(cè)定，結(jié)果見以下表格。
表18-氮雜前列腺素類似物——功能數(shù)據(jù)
表18-氮雜前列腺素類似物——功能數(shù)據(jù)
表18-氮雜前列腺素類似物——功能數(shù)據(jù)
表28-氮雜前列腺素類似物——放射性配體結(jié)合數(shù)據(jù)
表28-氮雜前列腺素類似物——放射性配體結(jié)合數(shù)據(jù)
表28-氮雜前列腺素類似物——放射性配體結(jié)合數(shù)據(jù)
人重組EP1、EP2、EP3、EP4、FP、TP、IP和DP受體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子編碼人EP1、EP2、EP3、EP4、FP、TP、IP和DP受體的質(zhì)粒通過將相應(yīng)的編碼序列克隆進(jìn)真核表達(dá)載體pCEP4(Invitrogen)。pCEP4載體含有Epstein Barr病毒(EBV)復(fù)制起點(diǎn)，它允許在表達(dá)EBV核抗原(EBNA-1)的靈長(zhǎng)類細(xì)胞系中進(jìn)行游離型復(fù)制。該質(zhì)粒也含有用于真核細(xì)胞選擇的潮霉素抗性基因。用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞是人胚胎腎細(xì)胞(HEK-293)，該細(xì)胞以EBNA-1轉(zhuǎn)染并表達(dá)EBVA-1蛋白。這些HEK-293-EBNA細(xì)胞(Invitorgen)在含有遺傳霉素(G418)的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，以維持EBNA-1蛋白的表達(dá)。HEK-293細(xì)胞在含10％胎牛血清(FBS)、250μg/ml G418(Life Technologies)和200μg/ml慶大霉素或者青霉素/鏈霉素的DMEM中生長(zhǎng)。用200μg/ml潮霉素選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子，其最適濃度通過前述的潮霉素殺滅曲線研究確定。
進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)，細(xì)胞在10厘米平板上長(zhǎng)至50-60％匯合。整合有相應(yīng)人前列腺素類受體cDNA插入物的質(zhì)粒pCEP4(20μg)加入到500μl250mM的氯化鈣中。逐滴加入HEPES緩沖的鹽水×2(2×HBS、280mM氯化鈉、20mM HEPES酸、1.5mM Na2HPO4，pH 7.05-7.12)至總體積500μl，在室溫下持續(xù)渦旋混和。30分鐘后，加入9ml DMEM至混合物中。然后將DNA/DMEM/磷酸鈣混合物加入至已經(jīng)用10ml PBS沖洗的細(xì)胞中。細(xì)胞在37℃于潮濕的95％空氣/5％二氧化碳的氣氛中溫育5小時(shí)。然后除去磷酸鈣溶液，用DMEM中的10％甘油溶液處理細(xì)胞2分鐘。然后用DMEM中的10％FBS置換甘油溶液。細(xì)胞溫育過夜，用含有250μg/ml G418和青霉素/鏈霉素的DMEM/10％FBS置換培養(yǎng)液。次日，加入潮霉素B至終濃度200μg/ml。
轉(zhuǎn)染后10天，單個(gè)選擇潮霉素B抗性克隆，轉(zhuǎn)移到24孔板的不同孔中。匯合后，將各克隆轉(zhuǎn)移到6孔板的一個(gè)孔中，然后在10厘米培養(yǎng)皿中擴(kuò)增。細(xì)胞持續(xù)在潮霉素選擇下維持至使用時(shí)。
放射性配體結(jié)合按以下方法對(duì)質(zhì)膜級(jí)分進(jìn)行放射性配體結(jié)合研究，所述質(zhì)膜級(jí)分是由穩(wěn)定轉(zhuǎn)染有貓或者人受體的細(xì)胞制備。細(xì)胞用TME緩沖液洗滌后由瓶底刮起，使用Brinkman PT 10/35手握式均質(zhì)機(jī)勻漿30妙。向離心管中加入TME緩沖液到40ml體積。TME由50mM TRIS堿、10mMMgCl2、1mM EDTA組成，加入1N鹽酸使pH為7.4。細(xì)胞勻漿物4℃下用Beckman Ti-60或Ti-70轉(zhuǎn)頭在19000rpm離心20到25分鐘。沉淀重懸于TME緩沖液中，通過Bio-Rad分析蛋白終濃度為1mg/ml。在100μl或200μl體積中進(jìn)行放射性配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)。
通過至少3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)測(cè)定[3H](N)PGE2(特異活性165Ci/mmol)的結(jié)合，每次均重復(fù)測(cè)定兩遍。25℃溫育60分鐘，加入4毫升冰冷的50mM TRIS-HCl終止，然后通過Whatman GF/B濾紙快速過濾，在細(xì)胞收集器(Brandel)中用4ml TRIS-HCl洗滌3次。使用終濃度2.5或者5nM的[3H](N)PGE2進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)，使用10-5M未標(biāo)記的PGE2確定非特異性結(jié)合。
對(duì)于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染子上的放射性配體結(jié)合，按照以下制備質(zhì)膜級(jí)分。COS-7細(xì)胞用TME緩沖液洗滌，從瓶底刮起，使用Brinkman PT 10/35手握式均質(zhì)機(jī)勻漿30妙。向離心管中加入TME緩沖液到40ml體積。TME由100mM TRIS堿、20mM MgCl2、2M EDTA組成，加入10N鹽酸使pH為7.4。
細(xì)胞勻漿物4℃下用Beckman Ti-60轉(zhuǎn)頭19000rpm離心20分鐘。沉淀重懸于TME緩沖液中，通過Biorad分析蛋白終濃度為1mg/ml。在200μl體積中進(jìn)行放射性配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)。
通過至少3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)測(cè)定[3H](N)PGE2(特異活性165Ci/mmol)在EP3D受體和[3H]-SQ29548(特異活性41.5Ci/mmol)在TP受體的結(jié)合，每次均重復(fù)測(cè)定兩遍。放射性標(biāo)記的PGE2購自Amersham，放射性標(biāo)記的SQ29548購自New England Nuclear。25℃溫育60分鐘，加入4毫升冰冷的50mM TRIS-HCl終止，然后通過Whatman GF/B濾紙快速過濾，在細(xì)胞收集器(Brandel)中用4ml TRIS-HCl洗滌3次。使用終濃度2.5或者5nM的[3H]PGE2或10nM[3H]-SQ 29548進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)，用10μM相應(yīng)未標(biāo)記的類前列腺素測(cè)定非特異性結(jié)合。對(duì)所有放射性配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)，收錄的標(biāo)準(zhǔn)是＞50％特異性結(jié)合和500到1000可置換計(jì)數(shù)或更佳。
本發(fā)明化合物對(duì)眼內(nèi)壓力的作用可以如下測(cè)定。化合物在含有0.1％聚山梨酸酯80和10mM TRIS堿的賦形劑中制備成所需濃度。用25μl施用至眼表面對(duì)實(shí)驗(yàn)犬進(jìn)行處理，對(duì)側(cè)眼使用賦形劑作為對(duì)照。使用壓平氣動(dòng)眼壓測(cè)量法(applanation pneumatonometry)測(cè)定眼內(nèi)壓力。犬眼內(nèi)壓力在用藥后當(dāng)時(shí)和6小時(shí)后測(cè)定。
本發(fā)明的化合物用于降低哺乳動(dòng)物如人的眼內(nèi)壓力。
前文說明書詳細(xì)記述了可以用于實(shí)施本發(fā)明的具體方法和組合物，代表了申請(qǐng)人設(shè)想的最佳方式。但是，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯而易見的是，具有所需藥理特性的其他化合物可以類似的方式制備，并且公開的化合物也可以由不同的起始化合物通過不同的化學(xué)反應(yīng)得到。同樣，也可以制備和施用不同的藥物組合物得到基本上相同的結(jié)果。因此，前述本文的具體說明不應(yīng)理解為限定了本申請(qǐng)的全部范圍，相反，本申請(qǐng)的范圍僅由權(quán)利要求書限定。
權(quán)利要求
1.一種治療眼內(nèi)壓升高或者青光眼的方法，包括向動(dòng)物給予治療眼內(nèi)壓升高或者青光眼有效量的通式I的化合物 其中，陰影線表示α構(gòu)型，三角形表示β構(gòu)型，波浪線表示α或β構(gòu)型，虛線表示存在或者不存在雙鍵；D表示共價(jià)鍵或者CH2、O、S或者NH；X是CO2R，CONR2，CH2OR，P(O)(OR)2，CONRSO2R，SONR2或者 Y是 Z是CH2或者共價(jià)鍵；R是H或者R2；R1是H、R2、苯基或者COR2；R2是C1-C5低級(jí)烷基或者鏈烯基，R3選自R2、苯基、噻吩基、呋喃基、吡啶基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、萘基或者其取代衍生物，其中取代基可以選自C1-C5烷基、鹵素、CF3、CN、NO2、NR2、CO2R和OR。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述化合物是通式II代表的化合物
3.權(quán)利要求1的方法，其中Z代表共價(jià)鍵。
4.權(quán)利要求1的方法，其中D是CH2。
5.權(quán)利要求1的方法，其中X是CO2R。
6.權(quán)利要求5的方法，其中R選自H和乙基。
7.權(quán)利要求5的方法，其中R是H或C1-C5烷基。
8.權(quán)利要求1的方法，其中R1是H。
9.權(quán)利要求1的方法，其中R3選自苯基、氯苯基和三氟甲基苯基。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述化合物選自7-[2S-[3R-羥基-4-(苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸；7-[2S-[3R-羥基-4-(苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯；7-[2S-[4-(3-氯-苯基)-3R-羥基-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸；7-[2S-[4-(3-氯-苯基)-3R-羥基-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯；7-[2S-[3R-羥基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸；7-[2S-[3R-羥基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯；7-[2S-[3-氧-4-(苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸；7-[2S-[3-氧-4-(苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯；7-[2S-[4-(3-氯-苯基)-3-氧-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸；7-[2S-[4-(3-氯-苯基)-3-氧-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯；7-[2S-[3-氧-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸；7-[2S-[3-氧-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯；7-[2S-[3R-羥基-4-(氯-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸；7-[2S-[3R-羥基-4-(氯-苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸；7-[2S-[3R-羥基-4-(氯-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯；7-[2S-[3R-羥基-4-(氯-苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯；7-[2S-[4-(3-氯-苯基)-3-氧-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸；7-[2S-[4-(3-氯-苯基)-3-氧-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸；7-[2S-[4-(3-氯-苯基)-3-氧-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯；7-[2S-[4-(3-氯-苯基)-3-氧-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯；7-[2S-[3R-羥基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸；7-[2S-[3R-羥基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸；7-[2S-[3R-羥基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯；7-[2S-[3R-羥基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯；7-[2S-[3-氧-4-(三氟甲基苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸；7-[2S-[3-氧-4-(三氟甲基苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸；7-[2S-[3-氧-4-(三氟甲基苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯；7-[2S-[3-氧-4-(三氟甲基苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯；7-[2S-[3R-羥基-(4-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸；7-[2S-[3R-羥基-(4-苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸；7-[2S-[3R-羥基-(4-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯；7-[2S-[3R-羥基-(4-苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯；7-[2S-[3-氧-4-(苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸；7-[2S-[3-氧-4-(苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸；7-[2S-[3-氧-4-(苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯；7-[2S-[3-氧-4-(苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯。
11.含有治療有效量的通式1化合物與無毒的眼科用液體賦形劑混和并包裝在適合計(jì)量使用的容器中的眼用溶液 其中，陰影線表示α構(gòu)型，三角形表示β構(gòu)型，波浪線表示α或β構(gòu)型，虛線表示存在或者不存在雙鍵；D表示共價(jià)鍵或者CH2、O、S或者NH；X是CO2R，CONR2，CH2OR，P(O)(OR)2，CONRSO2RSONR2或者 Y是 Z是CH2或者共價(jià)鍵；R是H或者R2；R1是H、R2、苯基或者COR2；R2是C1-C5低級(jí)烷基或者鏈烯基，R3選自R2、苯基、噻吩基、呋喃基、吡啶基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、萘基或者其取代衍生物，其中取代基可以選自C1-C5烷基、鹵素、CF3、CN、NO2、NR2、CO2R和OR。
12.一種藥物，包括適合以計(jì)量形式分配內(nèi)容物的容器和在容器中的權(quán)利要求11的眼用溶液。
13.用于治療眼內(nèi)壓升高或者青光眼的化合物，包括通式I的化合物 其中，陰影線表示α構(gòu)型，三角形表示β構(gòu)型，波浪線表示α或β構(gòu)型，虛線表示存在或者不存在雙鍵；D表示共價(jià)鍵或者CH2、O、S或者NH；X是CONR2，CH2OR，P(O)(OR)2，CONRSO2R或者SONR2；Y是 Z是GH2或者共價(jià)鍵；R是H或者R2；R1是H、R2、苯基或者COR2；R2是C1-C5低級(jí)烷基或者鏈烯基，R3選自R2、苯基、噻吩基、呋喃基、吡啶基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、萘基或者其取代衍生物，其中取代基可以選自C1-C5烷基、鹵素、CF3、CN、NO2、NR2、CO2R和OR。
14.選自以下的化合物7-[2S-[3R-羥基-4-(苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸；7-[2S-[3R-羥基-4-(苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯；7-[2S-[3-氧-4-(苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸；7-[2S-[3-氧-4-(苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯；7-[2S-[3R-羥基-(4-苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸；7-[2S-[3R-羥基-(4-苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯；7-[2S-[3-氧-4-(苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸；7-[2S-[3-氧-4-(苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種治療眼內(nèi)壓升高或者青光眼的方法，包括向眼內(nèi)壓升高或青光眼的哺乳動(dòng)物施用治療有效量的通式I的化合物，其中X、Y、Z、D和R
文檔編號(hào)A61P27/06GK1653045SQ03811007
公開日2005年8月10日 申請(qǐng)日期2003年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月14日
發(fā)明者D·W·奧爾德, D·T·丁, R·M·伯克 申請(qǐng)人:阿勒根公司