專利名稱：蛋白質(zhì)與修飾多糖的偶聯(lián)的制作方法
最近幾十年基因工程的快速發(fā)展已經(jīng)導(dǎo)致新鑒定了大量具有潛在治療效果的蛋白質(zhì)基因，并且可以在生物表達(dá)系統(tǒng)的幫助下毫無(wú)困難相對(duì)大量地生產(chǎn)純或幾乎純的相應(yīng)基因產(chǎn)物。
然而，這些蛋白質(zhì)在實(shí)際中的應(yīng)用，例如在診斷、治療和生物轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用常常遇到困難，因?yàn)樗鼈兊姆€(wěn)定性和可溶性通常不能令人滿意，特別是在生理pH值下。這些蛋白質(zhì)的兩個(gè)實(shí)例是腫瘤壞死因子TNF-α或白介素-2。
另外，糖蛋白在原核系統(tǒng)如大腸桿菌中表達(dá)時(shí)經(jīng)常出現(xiàn)可溶性問題，因?yàn)樗鼈儧]有經(jīng)過自然糖基化就被表達(dá)，在有些情況下導(dǎo)致溶解度大大降低。這可能要求必須使用成本高得多的真核表達(dá)系統(tǒng)。
在體內(nèi)治療的應(yīng)用方面，多種蛋白質(zhì)被極快地從血流中清除或降解。全身施用分子量大于約70kD的蛋白質(zhì)可能被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)或者通過與細(xì)胞受體的特異性相互作用從循環(huán)中清除。分子量小于約70kD的較小蛋白質(zhì)還可以被腎臟的腎小球?yàn)V過而大量清除(排阻限度約為70kD)。
最近解決所述問題的一種方法包括將這些問題蛋白質(zhì)與具有良好水溶性的生物相容聚合物(例如，聚乙二醇和葡聚糖)偶聯(lián)。一方面，通過偶聯(lián)能夠使分子量升高到70kD的閾值以上，使得較小蛋白質(zhì)的血漿滯留時(shí)間能夠顯著延長(zhǎng)，另一方面，親水性聚合物部分能夠提高蛋白質(zhì)在水介質(zhì)中的溶解度。
此外，可能與蛋白質(zhì)與這些聚合物偶聯(lián)有關(guān)的有利作用通常是基于結(jié)合的聚合物對(duì)蛋白質(zhì)分子上蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)和抗原決定簇的掩蔽。一方面，治療性蛋白質(zhì)基本上能夠避免被水解降解，另一方面，基本上抑制了外源性治療性蛋白質(zhì)引起的變態(tài)反應(yīng)的誘導(dǎo)。除了分子量增加外，聚合物的存在保護(hù)蛋白質(zhì)免于酶降解，另外通常免于熱變性。在許多情況下，蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和體內(nèi)半衰期顯著增加，而免疫原性和抗原性降低。
迄今為止，大多數(shù)修飾用聚乙二醇或葡聚糖進(jìn)行，通常優(yōu)選PEG，因?yàn)樗a(chǎn)生較簡(jiǎn)單的產(chǎn)物。
目前只有少數(shù)關(guān)于蛋白質(zhì)葡聚糖偶聯(lián)的描述，例如鏈激酶，纖溶酶、血紅蛋白或抑酶肽。然而，葡聚糖偶聯(lián)物通常顯示可能由葡聚糖降解產(chǎn)物引起的高變應(yīng)原性，低代謝穩(wěn)定性，以及在許多情況下偶聯(lián)反應(yīng)的低產(chǎn)率。這使得這些葡聚糖偶聯(lián)產(chǎn)物至今均未被批準(zhǔn)用于人或動(dòng)物的治療。
PEG衍生化已經(jīng)被相當(dāng)頻繁地進(jìn)行，因此該方法現(xiàn)在可以被認(rèn)為是提高蛋白質(zhì)分子量的標(biāo)準(zhǔn)方法。這些衍生物中的一些在美國(guó)處于臨床試驗(yàn)的不同階段或者已經(jīng)被批準(zhǔn)。PEG-血紅蛋白和超氧化物歧化酶(SOD)的一種PEG加合物目前處于III期臨床實(shí)驗(yàn)，后者是在聚合物偶聯(lián)方面研究得最多的蛋白質(zhì)。PEG偶聯(lián)的天冬酰胺酶已經(jīng)被用于急性淋巴細(xì)胞白血病的治療。2001年，PEG-干擾素α被批準(zhǔn)用于丙型肝炎患者的治療。
然而，也報(bào)道了關(guān)于這些PEG偶聯(lián)物使用的從不適到危險(xiǎn)的副作用，如瘙癢、超敏反應(yīng)和胰腺炎。另外，PEG偶聯(lián)后蛋白質(zhì)的生物活性通常非常低，PEG偶聯(lián)物降解產(chǎn)物的代謝仍然基本上不為人知，并且可能是一種健康危險(xiǎn)。
WO 99/49897描述了血紅蛋白的偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物是由氧化開環(huán)多糖(如羥乙基淀粉或葡聚糖)的醛基與蛋白質(zhì)的伯胺基反應(yīng)形成。然而，在這種情況下，使用的多糖被用作多功能試劑，產(chǎn)生性質(zhì)難以調(diào)節(jié)的非常不均勻的產(chǎn)物混合物。
美國(guó)專利6,083,909描述了在DMSO中將選擇性氧化的羥乙基淀粉與血紅蛋白偶聯(lián)的一種方法。然而，我們的研究表明，在所述條件下不能獲得希望的產(chǎn)物，因?yàn)檠t蛋白在DMSO中變性，從而喪失了生物活性。
因此仍然需要生理上良好耐受的葡聚糖或PEG偶聯(lián)蛋白質(zhì)的替代物，它們能夠提高蛋白質(zhì)的溶解度，或者能夠延長(zhǎng)蛋白質(zhì)的血漿滯留時(shí)間。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供這些替代物，以及發(fā)展制備這些替代蛋白質(zhì)衍生物的簡(jiǎn)單、有效的方法。
用具有以下特征的羥烷基淀粉-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的這個(gè)目的羥烷基淀粉分子與蛋白質(zhì)之間的結(jié)合作用是以以下基團(tuán)之間偶聯(lián)反應(yīng)形成的共價(jià)鍵合為基礎(chǔ)羥烷基淀粉分子的末端醛基或通過化學(xué)反應(yīng)由該醛基衍生的官能團(tuán)，和能夠與羥烷基淀粉分子的該醛基或由其衍生的官能團(tuán)反應(yīng)的蛋白質(zhì)的官能團(tuán)，其中偶聯(lián)反應(yīng)直接形成的鍵合必要時(shí)可以通過進(jìn)一步的反應(yīng)進(jìn)行修飾。
本發(fā)明還包括含有這些偶聯(lián)物的藥物組合物，以及這些偶聯(lián)物和組合物在人或動(dòng)物體預(yù)防或治療中的用途，以及制備這些偶聯(lián)物和組合物的方法。
令人吃驚地發(fā)現(xiàn)，通過適當(dāng)選擇條件，上述反應(yīng)能夠在水溶液中進(jìn)行，從而使得蛋白質(zhì)在許多情況下生物活性被完全或部分保留。
在這種情況下，用于偶聯(lián)反應(yīng)的水反應(yīng)介質(zhì)優(yōu)選是水或水與有機(jī)溶劑的混合物，其中混合物中水的比例至少約為70％(重量)，優(yōu)選至少約80％(重量)，更優(yōu)選至少約90％(重量)。
偶聯(lián)反應(yīng)中羥烷基淀粉(HAS)與蛋白質(zhì)的摩爾比通常約為20∶1到1∶1，優(yōu)選約為5∶1到1∶1。
基于蛋白質(zhì)最初活性，本發(fā)明羥烷基淀粉-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的剩余生物活性通常為至少40％，優(yōu)選至少50％，更優(yōu)選至少70％，進(jìn)一步優(yōu)選至少90％，最優(yōu)選至少95％。
本發(fā)明使用的羥烷基淀粉(HAS)能夠用已知的方法制備，例如用烯化氧或2-氯鏈烷醇如2-氯乙醇，使淀粉在脫水葡萄糖單元的C2和/或C6位點(diǎn)處羥烷基化(關(guān)于淀粉的羥乙基化，參見例如US 5,218,108)，它們具有希望的不同分子量范圍和取代程度。也可以使用可以購(gòu)到的任何制品。此處所用的“羥烷基淀粉”中烷基的定義包括甲基、乙基、異丙基和正丙基，特別優(yōu)選乙基。HES的一個(gè)基本優(yōu)點(diǎn)是，它已經(jīng)被官方批準(zhǔn)作為生物相容性血漿增容劑(expander)，并在臨床上大規(guī)模使用。
羥烷基淀粉的平均分子量可以是約3kD到幾百萬(wàn)道爾頓，優(yōu)選約4kD到約1000kD，更優(yōu)選約4kD到約50kD，或者約70kD到約1000kD，特別優(yōu)選約130kD。為了與小分子蛋白質(zhì)偶聯(lián)，優(yōu)選地選擇羥烷基淀粉的平均分子量，使得偶聯(lián)物超過上述70kD的閾值，而對(duì)于與大分子蛋白質(zhì)的偶聯(lián)，羥烷基淀粉的平均分子量?jī)?yōu)選在所述范圍的較低區(qū)域。由于偶聯(lián)可能在蛋白質(zhì)的多個(gè)位點(diǎn)發(fā)生，因此偶聯(lián)多個(gè)小聚合物鏈而不是一個(gè)高分子量聚合物也可能是有利的。取代程度(修飾的脫水葡萄糖單元的數(shù)量與脫水葡萄糖單元總數(shù)之比)同樣可能不同，通常在約0.2到0.8范圍內(nèi)，優(yōu)選約0.3到0.7，更優(yōu)選約0.5。(注意數(shù)值與介于0到1之間的“取代程度”有關(guān))。C2與C6取代之比通常在4到16范圍內(nèi)，優(yōu)選8到12范圍內(nèi)。
這些參數(shù)可以用已知方法調(diào)整。使用羥乙基淀粉(HES)作為血液代用品的經(jīng)驗(yàn)表明，HES在血漿中的滯留時(shí)間取決于分子量和取代程度以及取代類型(C2取代或C6取代)，較高的分子量、較高的取代程度和較高比例的C2取代可延長(zhǎng)滯留時(shí)間。
這些關(guān)系也適用于本發(fā)明的羥烷基淀粉-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，因此血漿中一種具體偶聯(lián)物的滯留時(shí)間能夠通過多糖的比例進(jìn)行調(diào)節(jié)。
平均分子量為130kD、取代程度為0.5和平均分子量為200kD、取代程度為0.25的羥乙基淀粉產(chǎn)物已經(jīng)在臨床上用作血液代用品，也適于在本發(fā)明中使用。
適用于本發(fā)明的蛋白質(zhì)原則上是具有與HAS分子官能團(tuán)反應(yīng)的必要官能團(tuán)(例如游離氨基、硫醇基或羧基)的任何蛋白質(zhì)。
也可以通過使蛋白質(zhì)與一種適合的、生理耐受的雙功能接頭分子反應(yīng)來(lái)引入希望的官能團(tuán)。對(duì)于本發(fā)明目的而言，偶聯(lián)的接頭分子的剩余反應(yīng)性官能團(tuán)同樣被看作“該蛋白質(zhì)的反應(yīng)性官能團(tuán)”。
適合的接頭分子在一端含有一個(gè)能夠與蛋白質(zhì)的反應(yīng)性官能團(tuán)(例如氨基、硫醇基或羧基)共價(jià)鍵合的基團(tuán)，在另一端含有一個(gè)能夠與末端醛基或通過化學(xué)反應(yīng)由它衍生的官能團(tuán)(例如羧基、活化的羧基、氨基或硫醇基)共價(jià)鍵合的基團(tuán)。在接頭分子的兩個(gè)官能團(tuán)之間有一個(gè)適當(dāng)長(zhǎng)度的生物相容的橋連分子，例如來(lái)源于鏈烷烴的基團(tuán)、(寡)烷撐二醇基團(tuán)或另一種適合的寡聚物基團(tuán)。優(yōu)選能夠與氨基反應(yīng)的基團(tuán)是，例如N-羥基琥珀酰亞胺酯、磺基-N-羥基琥珀酰亞胺酯、亞氨酸酯或其它活化的羧基；優(yōu)選能夠與硫醇基反應(yīng)的基團(tuán)是，例如馬來(lái)酰亞胺和羧基；優(yōu)選能夠與醛基或羧基反應(yīng)的基團(tuán)是，例如氨基或硫醇基。
用于連接SH和NH官能團(tuán)的接頭分子的實(shí)例有AMAS (N-α(馬來(lái)酰亞胺基乙酰氧基)琥珀酰亞胺酯)BMPS (N-β(馬來(lái)酰亞胺基丙氧基)琥珀酰亞胺酯)GMBS (N-γ(馬來(lái)酰亞胺基丁酰氧基)琥珀酰亞胺酯)EMCS (N-ε(馬來(lái)酰亞胺基己酰氧基)琥珀酰亞胺酯)MBS (m-(馬來(lái)酰亞胺基苯甲酰)-N-羥基琥珀酰亞胺酯)SMCC (4-(N-馬來(lái)酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯)SMPB (4-(對(duì)馬來(lái)酰亞胺基苯基)丁酸琥珀酰亞胺酯)SPDP (3-(2-吡啶二硫代)丙酸琥珀酰亞胺酯)Sulfo-GMBS (N-γ(馬來(lái)酰亞胺基丁酰氧基)磺基琥珀酰亞胺酯)Sulfo-EMCS (N-ε(馬來(lái)酰亞胺基己酰氧基)磺基琥珀酰亞胺酯)用于連接SH和SH官能團(tuán)的接頭分子的實(shí)例有BMB (1，4-二-馬來(lái)酰亞胺基丁烷)BMDB (1，4-二-馬來(lái)酰亞胺基-2，3-二羥基丁烷)BMH(二-馬來(lái)酰亞胺基己烷)BMOE(二-馬來(lái)酰亞胺基乙烷)DTME(二硫代-二-馬來(lái)酰亞胺基乙烷)HBVS (1，6-己烷-二-乙烯砜)BM(PEO)3(1，8-二-馬來(lái)酰亞胺基三甘醇)BM(PEO)4(1，11-二-馬來(lái)酰亞胺基四甘醇)
用于連接NH和NH官能團(tuán)的接頭分子的實(shí)例有BSOCOES (二-(2-琥珀酰亞胺基氧基羰氧基)乙基)砜BS3(辛二酸二-(磺基琥珀酰亞胺基)酯)DFDNB (1，5-二氟-2，4-硝基苯)DMA (己二酰亞氨酸二甲酯HCl)DSG (戊二酸二琥珀酰亞胺基酯)DSS (辛二酸二琥珀酰亞胺基酯)EGS (雙(琥珀酰亞胺基琥珀酸)乙二醇酯)。
用于連接SH和CHO官能團(tuán)的接頭分子的實(shí)例有BMPH (N-β(馬來(lái)酰亞胺基丙酸)酰肼TFA)EMCA (N-ε(馬來(lái)酰亞胺基己酸)酰肼)KMUH (N-κ(馬來(lái)酰亞胺基十一烷酸)酰肼)M2C2H(4-(N-馬來(lái)酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧基酰肼HCl)MPBH (4-(4-N-馬來(lái)酰亞胺基苯基)丁酸酰肼HCl)PDPH (3-(2-吡啶基二硫代)丙?；ｋ?。
用于連接SH和OH官能團(tuán)的接頭分子的實(shí)例有PMPI (異氰酸N-(對(duì)馬來(lái)酰亞胺基苯基)酯)用于將SH官能團(tuán)轉(zhuǎn)化為COOH官能團(tuán)的接頭分子的實(shí)例有BMPA (N-β-馬來(lái)酰亞胺基丙酸)EMCH (N-β-馬來(lái)酰亞胺基己酸)KMUA (N-κ-馬來(lái)酰亞胺基十一烷酸)用于將NH官能團(tuán)轉(zhuǎn)化為COOH官能團(tuán)的接頭分子的實(shí)例有MSA(己二酸N-琥珀酰亞胺基酯甲基酯)或其更長(zhǎng)鏈的同系物或乙二醇的相應(yīng)衍生物。
用于將COOH官能團(tuán)轉(zhuǎn)化為NH官能團(tuán)的接頭分子的實(shí)例有DAB(1，4-二氨基丁烷)或其更長(zhǎng)鏈的同系物或乙二醇的相應(yīng)衍生物。
與分子的氨基反應(yīng)、并且為了避免空間位阻在距該分子較遠(yuǎn)距離處提供保護(hù)氨基的一個(gè)接頭分子實(shí)例是TFCS(N-ε(三氟乙酰己酰氧基)-琥珀酰亞胺酯)。
其它適合的接頭分子為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，可以購(gòu)到或者能夠如需要進(jìn)行設(shè)計(jì)，并且取決于將要偶聯(lián)的HAS和蛋白質(zhì)中存在和希望的官能團(tuán)，利用已知的方法制備。
對(duì)于本發(fā)明目的，術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”包括含有至少9-12個(gè)氨基酸、優(yōu)選至少15個(gè)氨基酸、更優(yōu)選至少25個(gè)氨基酸、特別優(yōu)選至少50個(gè)氨基酸的任何氨基酸序列，也包括天然衍生物，例如前(pre)或原(pro)形式的蛋白質(zhì)、糖蛋白、磷蛋白或合成的修飾衍生物，例如融合蛋白、新糖蛋白，或通過基因工程方法修飾的蛋白質(zhì)，例如融合蛋白、氨基酸交換引入優(yōu)選偶聯(lián)位點(diǎn)的蛋白質(zhì)。
為了人或動(dòng)物體的預(yù)防或治療，有關(guān)蛋白質(zhì)將在體內(nèi)行使所希望的特定功能。因此，該蛋白質(zhì)優(yōu)選具有例如調(diào)節(jié)或催化功能、信號(hào)傳導(dǎo)或轉(zhuǎn)運(yùn)功能、或者免疫應(yīng)答或免疫應(yīng)答誘導(dǎo)中的功能。
例如，該蛋白質(zhì)可以選自酶、抗體、抗原、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、生物粘附蛋白、激素、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、受體、抑制因子、激活劑、抑制劑或其功能衍生物或片段。就此而言，“功能衍生物或片段”是指全部或部分保留(例如至少10-30％，優(yōu)選50％以上，更優(yōu)選70％以上，最優(yōu)選90％以上)希望的母體分子的生物學(xué)性質(zhì)或活性的衍生物或片段。這種片段的特別優(yōu)選實(shí)例是抗體片段。
具體例子有α-、β-或γ-干擾素，白介素-例如IL-1到IL-18，生長(zhǎng)因子-例如表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、血小板生長(zhǎng)因子(PDGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、腦源性生長(zhǎng)因子(BDGF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、B細(xì)胞生長(zhǎng)因子(BCGF)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子(BDNF)、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子如TGF-α或TGF-β，集落刺激因子(CSF)-例如GM-CSF、G-CSF，BMP(骨形態(tài)發(fā)生蛋白)，生長(zhǎng)激素-例如人生長(zhǎng)激素，腫瘤壞死因子-例如TNF-α或TNF-β，促生長(zhǎng)素抑制素，促生長(zhǎng)素，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素，血清蛋白-例如凝血因子II-X III，白蛋白，促紅細(xì)胞生成素，肌紅蛋白，血紅蛋白，纖溶酶原活化因子-例如組織纖溶酶原活化因子，激素或激素原-例如胰島素，促性腺激素，黑素細(xì)胞刺激素(α-MSH)，曲普瑞林，下丘腦激素-例如抗利尿激素(ADH)和催產(chǎn)素，釋放素和抑制素，甲狀旁腺激素，甲狀腺激素-例如甲狀腺素、促甲狀腺素、促甲狀腺素釋放素，催乳素，降鈣素，胰高血糖素，胰高血糖素樣肽(GLP-1、GLP-2等)，腸促胰島素類似物(exendin)-例如腸促胰島素類似物-4，瘦素(leptin)，加壓素，胃泌素，促胰液素，整聯(lián)蛋白(integrin)，糖蛋白激素(例如LH、FSH等)，色素激素，脂蛋白和載脂蛋白-例如Apo-B、Apo-E、Apo-La，免疫球蛋白-例如IgG、IgE、IgM、IgA、IgD或其片段，水蛭素，組織途徑抑制劑，植物蛋白-例如凝集素或蓖麻毒素，蜂毒，蛇毒，免疫毒素，E抗原，butroxobina，α-蛋白酶抑制劑，豚草變應(yīng)原，黑色素，寡賴氨酸蛋白(oligolysine protein)，RGD蛋白，或適當(dāng)時(shí)這些蛋白質(zhì)之一的相應(yīng)受體；或這些蛋白質(zhì)或受體之一的功能衍生物或片段。
例如，適合的酶可選自碳水化合物特異性酶，蛋白水解酶，氧化酶，氧化還原酶，轉(zhuǎn)移酶，水解酶，裂合酶，異構(gòu)酶，激酶和連接酶。具體的非限制性實(shí)例有天冬酰胺酶，精氨酸酶，精氨酸脫氨酶，腺苷脫氨酶，谷氨酰胺酶，谷氨酰胺酶-天冬酰胺酶，苯丙氨酸-氨裂合酶，色氨酸酶，酪氨酸酶，超氧化物歧化酶，內(nèi)毒素酶(endotoxinase)，過氧化氫酶，過氧化物酶，激肽釋放酶，胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，彈性蛋白酶，嗜熱菌蛋白酶，脂酶，尿酸酶，腺苷二磷酸酶，嘌呤核苷磷酸化酶，膽紅素氧化酶，葡萄糖氧化酶，glucodase，葡糖酸氧化酶，半乳糖苷酶，葡糖腦苷脂酶，葡糖苷酸酶，透明質(zhì)酸酶，組織因子，組織纖溶酶原激活物，鏈激酶，尿激酶，MAP激酶，DNAse，RNAse，乳鐵蛋白，及其功能衍生物或片段。
如上所述，HAS分子參與偶聯(lián)反應(yīng)的官能團(tuán)是末端醛基或通過化學(xué)反應(yīng)由其衍生的基團(tuán)。
這種化學(xué)反應(yīng)的一個(gè)實(shí)例是，利用一種溫和氧化劑，例如碘、溴或某些金屬離子，或者通過電化學(xué)氧化，將該醛基選擇性氧化為羧基或活化的羧基，例如酯、內(nèi)酯、酰胺，該羧基必要時(shí)在第二次反應(yīng)中被轉(zhuǎn)化為活化的衍生物。該羧基或活化羧基然后可與蛋白質(zhì)的伯氨基或硫醇基偶聯(lián)，形成酰胺鍵或硫酯鍵。
在一種特別優(yōu)選的制備方法中，該醛基用摩爾過量的碘在堿性水溶液中選擇性氧化，碘與HAS的摩爾比優(yōu)選為2∶1到20∶1，特別優(yōu)選約5∶1到6∶1。在實(shí)施例1描述的優(yōu)化方法中，開始時(shí)將一定量的羥烷基淀粉溶解于熱蒸餾水中，加入優(yōu)選濃度為約0.05-0.5N、特別優(yōu)選約0.1N的略低于1摩爾當(dāng)量的碘水溶液。之后，以幾分鐘的間隔，向反應(yīng)溶液中逐滴緩慢加入摩爾濃度為碘溶液的約5-15倍、優(yōu)選約10倍的NaOH水溶液，直到溶液在加入后再變澄清。再向反應(yīng)溶液中加入略低于1摩爾當(dāng)量的上述碘水溶液，再次逐滴加入NaOH溶液，重復(fù)加入碘和NaOH，直到已經(jīng)加入了基于羥烷基淀粉的約5.5-6摩爾當(dāng)量的碘溶液和11-12摩爾當(dāng)量的NaOH溶液。然后終止反應(yīng)，使反應(yīng)溶液脫鹽(例如通過透析或超濾)，進(jìn)行陽(yáng)離子交換層析，通過凍干法獲得反應(yīng)產(chǎn)物。利用該方法，獲得與HAS分子量無(wú)關(guān)的基本定量的產(chǎn)率。
在另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，用堿穩(wěn)定的金屬離子(例如Cu++或Ag+)溶液進(jìn)行選擇性氧化，也得到基本定量的產(chǎn)率(實(shí)施例2)。在這種情況下優(yōu)選使用約3-10倍摩爾過量的氧化劑。
已經(jīng)形成的選擇性氧化的羥烷基淀粉(ox-HAS)隨后在活化試劑存在下與所需蛋白質(zhì)的游離氨基反應(yīng)，形成酰胺鍵。適合的活化試劑的實(shí)例有N-羥基琥珀酰亞胺，N-羥基鄰苯二甲酰亞胺，苯硫酚，對(duì)硝基酚，鄰，對(duì)-二硝基酚，三氯苯酚，三氟苯酚，五氯苯酚，五氟苯酚，1-羥基-1H-苯并三唑(HOBt)，HOOBt，HNSA，2-羥基嘧啶，3-羥基嘧啶，3，4--二氫-4-氧代苯并三嗪-3-醇，4-羥基-2，5-二苯基-3(2H)-噻吩酮1，1-二氧化物，3-苯基-1-(對(duì)硝基苯基)-2-吡唑啉-5-酮)，[1-苯并-三唑基-N-氧三(二甲氨基)鏻六氟磷酸鹽](BOP)，[1-苯并三唑基氧三吡咯烷基鏻六氟磷酸鹽](PyBOP)，[O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽(HBTU)，[O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(TBTU)，[O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-二(亞戊基)脲鎓六氟磷酸鹽]，[O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-二(四亞甲基)脲鎓六氟磷酸鹽，羰基二咪唑(CDI)，或者優(yōu)選碳二亞胺，例如1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)，二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，二異丙基碳二亞胺(DIPC)，特別優(yōu)選EDC。與關(guān)于類似偶聯(lián)反應(yīng)的文獻(xiàn)中描述的常規(guī)方法相反，令人吃驚地發(fā)現(xiàn)常規(guī)使用碳二亞胺后不必使用其它必須的活化劑如三唑(例如HOBt)，它們甚至使產(chǎn)量降低。在EDC的存在下和在不含HOBt的情況下，ox-HES與各種典型化合物進(jìn)行的本發(fā)明偶聯(lián)反應(yīng)能夠獲得基本與HES分子量無(wú)關(guān)的高產(chǎn)率(參見實(shí)施例)。
除羧基或活化羧基與蛋白質(zhì)的(例如賴氨酸或精氨酸殘基的)游離伯氨基反應(yīng)外，與蛋白質(zhì)的(半胱氨酸的)硫醇基的類似反應(yīng)在原則上也是可能的。然而，就這一點(diǎn)而言，必須考慮半胱氨酸通常參與S-S鍵，因此不能用于偶聯(lián)反應(yīng)。另一方面，如果存在游離半胱氨酸，它們通常在催化中起重要作用，或者與亞單位的接觸位點(diǎn)有關(guān)。對(duì)這些半胱氨酸的修飾將導(dǎo)致生物活性部分或完全喪失?？梢岳贸Ｒ?guī)基因工程方法解決這一問題，例如在已知不參與活性的蛋白質(zhì)位點(diǎn)處進(jìn)行定點(diǎn)誘變或化學(xué)肽合成，導(dǎo)入游離半胱氨酸。這樣對(duì)偶聯(lián)位點(diǎn)進(jìn)行最佳控制成為可能。同樣，也可以向蛋白質(zhì)內(nèi)定向引入其它反應(yīng)氨基酸，例如Lys、His、Arg、Asp、Glu。
羥烷基淀粉分子的反應(yīng)性基團(tuán)也可能是通過末端醛基的化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的胺或硫醇基團(tuán)。例如，在氫和催化劑存在下、或者在氰基硼氫化鈉存在下，通過與氨反應(yīng)能夠進(jìn)行醛基的還原胺化。產(chǎn)生的氨基或硫醇基然后可與蛋白質(zhì)(例如任選活化的谷氨酸或天冬氨酸)的游離羧基反應(yīng)，形成酰胺或硫酯鍵。
羥烷基淀粉分子的末端醛基或通過化學(xué)反應(yīng)由其衍生的官能團(tuán)也可以與合適的生理耐受的雙功能接頭分子反應(yīng)。在這種情況下，參與偶聯(lián)反應(yīng)的“通過化學(xué)反應(yīng)由羥烷基淀粉分子的末端醛基衍生的官能團(tuán)”是與末端醛基或由其衍生的官能團(tuán)反應(yīng)的雙功能接頭分子的剩余反應(yīng)性官能團(tuán)。這樣，就可以將末端醛基轉(zhuǎn)化為希望的官能團(tuán)。
適合的接頭分子在一端含有一個(gè)能夠與末端醛基或通過化學(xué)反應(yīng)由它衍生的官能團(tuán)(例如羧基、活化的羧基、氨基或硫醇基)共價(jià)鍵合的基團(tuán)，在另一端含有一個(gè)能夠與蛋白質(zhì)的反應(yīng)性官能團(tuán)(例如氨基、硫醇基或羧基)共價(jià)鍵合的基團(tuán)。在接頭分子的兩個(gè)官能團(tuán)之間有一個(gè)適當(dāng)長(zhǎng)度的生物相容的橋連分子，例如來(lái)源于鏈烷烴的基團(tuán)、(寡聚)亞烷基二醇基團(tuán)或另一種適合的寡聚物基團(tuán)。能夠與氨基反應(yīng)的優(yōu)選基團(tuán)是，例如N-羥基琥珀酰亞胺酯、磺基-N-羥基琥珀酰亞胺酯、亞氨酸酯或其它活化的羧基；能夠與硫醇基反應(yīng)的優(yōu)選基團(tuán)是，例如馬來(lái)酰亞胺和羧基；能夠與醛基或羧基反應(yīng)的優(yōu)選基團(tuán)是，例如氨基或硫醇基。
適合的接頭分子的多個(gè)具體非限制性實(shí)例已經(jīng)在上文關(guān)于接頭分子與蛋白質(zhì)偶聯(lián)的部分中列出。
在本發(fā)明的另一種偶聯(lián)方法中，末端醛基直接與蛋白質(zhì)的(例如賴氨酸或精氨酸殘基的或N端的)伯氨基反應(yīng)，形成希夫堿。形成的希夫堿隨后或者平行地通過與適合的還原劑反應(yīng)被還原，形成在水介質(zhì)中穩(wěn)定的蛋白質(zhì)與HAS的鍵合。優(yōu)選的還原劑是硼氫化鈉、氰基硼氫化鈉、有機(jī)硼復(fù)合物，例如4-(二甲基氨基)吡啶-硼復(fù)合物、N-乙基二異丙基胺-硼復(fù)合物、N-乙基嗎啉-硼復(fù)合物、N-甲基嗎啉-硼復(fù)合物、N-苯基嗎啉-硼復(fù)合物、盧剔啶-硼復(fù)合物、三乙基胺-硼復(fù)合物、三甲基胺-硼復(fù)合物；適合的立體選擇性還原劑有，例如三乙酸硼氫化鈉、三乙基硼氫化鈉、三甲氧基硼氫化鈉、三仲丁基硼氫化鉀(K-Selectride)、三仲丁基硼氫化鈉(N-Selectride)、三仲丁基硼氫化鋰(L-Selectride)、三戊基硼氫化鉀(KS-Selectride)和三戊基硼氫化鋰(LS-Selectride)。
通過適當(dāng)改變反應(yīng)條件能夠提高產(chǎn)率。這些優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的參數(shù)包括反應(yīng)混合物的pH(堿性硼氫化物引起的可能的蛋白質(zhì)降解)、溫度和溫育時(shí)間，和一鍋反應(yīng)的還原劑的性質(zhì)。另一個(gè)選擇是分兩步進(jìn)行反應(yīng)，在此情況下還原步驟可以使用固定化的還原劑。
偶聯(lián)反應(yīng)的產(chǎn)物可以用已知方法進(jìn)行研究，可以測(cè)定偶聯(lián)效率。因此，例如可以在與三硝基苯磺酸偶聯(lián)之前和之后測(cè)定蛋白質(zhì)中游離的伯氨基(Habeeb，ASAF，Anal.Biochem.14，328-336(1966))。伯胺反應(yīng)的偶聯(lián)產(chǎn)率也可以通過用熒光胺衍化非反應(yīng)性胺及測(cè)定熒光來(lái)檢測(cè)。分子量分布可以通過SDS-PAGE和凝膠滲透來(lái)測(cè)定。偶聯(lián)物中的蛋白質(zhì)含量可以通過SDS-PAGE和隨后的銀染色檢測(cè)，而糖含量可以通過將SDS-PAGE分離的帶印跡到膜上后進(jìn)行聚糖特異性染色來(lái)確定。也可以進(jìn)行定量聚糖測(cè)定。通過作肽圖和/或MALDI-TOF質(zhì)譜法或電噴霧電離質(zhì)譜法能夠準(zhǔn)確地鑒定蛋白質(zhì)上的偶聯(lián)位點(diǎn)。這樣就可以優(yōu)化偶聯(lián)、預(yù)先確定分子量分布、甚至可能預(yù)先確定(例如，如果蛋白質(zhì)上的反應(yīng)性基團(tuán)的反應(yīng)性不同)產(chǎn)物的偶聯(lián)位點(diǎn)。
本發(fā)明的偶聯(lián)物適當(dāng)時(shí)可以直接使用，或者以藥物組合物的形式用于人或動(dòng)物體的預(yù)防或治療。
這種類型的組合物包括藥學(xué)有效量的作為活性成分的本發(fā)明偶聯(lián)物，和可藥用載體，以及必要的其它治療劑或藥學(xué)成分或賦形劑。賦形劑可包括，例如稀釋劑、緩沖劑、調(diào)味劑、粘合劑、表面活性劑、增稠劑、潤(rùn)滑劑、防腐劑(包括抗氧化劑)和用來(lái)使制劑與目的受體的血液等滲的物質(zhì)。藥學(xué)有效量是在在治療過程中一次或多次施用后足以顯示所需有效效果以緩解、治愈或預(yù)防一種病理狀態(tài)的量?？伤幱幂d體是與藥物活性成分和患者身體均相容的載體。
組合物的形式因希望或適合的給藥途徑而不同。一種優(yōu)選途徑是腸胃外給藥，例如皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、鞘內(nèi)、硬膜外注射或必要時(shí)輸注。也可以鼻內(nèi)、氣管內(nèi)或局部給藥。例如，局部施用根據(jù)本發(fā)明偶聯(lián)的生長(zhǎng)因子可以加速創(chuàng)傷愈合。藥物組合物可以方便地以劑量單位的形式提供，用藥學(xué)領(lǐng)域眾所周知的任何方法生產(chǎn)。
本發(fā)明的偶聯(lián)物也可以用于已經(jīng)使用其它蛋白質(zhì)-聚合物偶聯(lián)物(例如PEG-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物)的其它所有領(lǐng)域。一些具體的非限制性實(shí)例包括使用HAS-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物作為在不均相中反應(yīng)的固定化催化劑或反應(yīng)物，或者作為(免疫)親和層析的柱材料。了解此處公開的本發(fā)明HAS-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物性質(zhì)的熟練技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道其它可能的用途。
下列實(shí)施例旨在更詳細(xì)地說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。具體而言，也可以用羥甲基淀粉和羥丙基淀粉進(jìn)行類似的反應(yīng)，并且能夠獲得類似的結(jié)果。
實(shí)施例1用碘選擇性氧化羥乙基淀粉(HES)通過在圓底燒瓶中加熱，將10g HES-130kD溶解于12ml去離子水中。向該溶液中加入2ml I2溶液(0.1N)。含有2ml 1.0N NaOH的一個(gè)移液管通過一個(gè)雙向連接器與該燒瓶連接，以每4分鐘約1滴的速度逐滴加入NaOH溶液。在加入約0.2ml NaOH溶液后使該溶液脫色，同時(shí)加入第二部分2ml 0.1N碘溶液。在加入總共14ml碘溶液和2.8ml NaOH溶液后完成反應(yīng)。然后用去離子水透析反應(yīng)混合物。
內(nèi)酯化為了將醛糖酸鹽基團(tuán)轉(zhuǎn)化為醛糖酸基團(tuán)，部分脫鹽的溶液在陽(yáng)離子交換柱(Amberlite IR-120，H+型)上進(jìn)行層析。隨后通過凍干除去水，獲得內(nèi)酯形式。
氧化程度的測(cè)定每次將1ml堿性銅試劑(3.5g Na2PO4、4.0g酒石酸鉀鈉溶于50ml H2O中，加10ml 1N NaOH，8.0ml 10％濃度(重量/體積)CuSO4溶液和溶于10ml H2O中的0.089g碘酸鉀，加入18g硫酸鈉后，補(bǔ)水至100ml)在N2氣環(huán)境下移液到1ml樣品溶液中。將該混合物在100℃下加熱45分鐘。冷卻后，加入0.2ml 2.5％濃度的KI溶液和0.15ml 1M H2SO4。5分鐘后加入1滴酚紅指示劑溶液(1％重量/體積)，用5mM Na2S2O3溶液進(jìn)行滴定直到顏色消失。未反應(yīng)醛基的濃度可以根據(jù)滴定劑的消耗量來(lái)計(jì)算。
獲得近乎定量的產(chǎn)率(＞98％)。通過該方法，能夠像氧化較低分子量(例如10kD、25kD、40kD)的羥乙基淀粉一樣以類似高產(chǎn)率氧化較高分子量(例如130kD、250kD、400kD)的羥乙基淀粉。
實(shí)施例2用Cu2+離子選擇性氧化HES通過加熱在10ml去離子水中制備0.24mmol HES-130kD的溶液。將該溶液在100ml圓底燒瓶中加熱至70-80℃，加入1.17mmol穩(wěn)定化Cu2+(例如使用作為穩(wěn)定劑的羅謝爾鹽或其它穩(wěn)定劑)和稀NaOH水溶液(終濃度為0.1N NaOH)。然后升高溫度至100℃，繼續(xù)反應(yīng)直到出現(xiàn)微紅色。終止反應(yīng)，將反應(yīng)混合物冷卻到4℃，過濾除去微紅色沉淀。濾液用去離子水透析，然后如實(shí)施例1所述轉(zhuǎn)化為內(nèi)酯并凍干。氧化是定量進(jìn)行的(產(chǎn)率＞99％)。通過該方法也能夠氧化低分子量HES(例如HES-10kD、HES-25kD、HES-40kD)和較高分子量的HES類。
實(shí)施例3選擇性氧化的高分子量HES(ox-HES-130kD)與人血清白蛋白(HSA)的偶聯(lián)通過在具有磁力攪拌器的圓底燒瓶中溫和加熱，使4.3gox-HES-130kD和200mg HAS(Sigma，Taufkirchen)完全溶解于水中。向該溶液中加入溶于水的30mg乙基二甲基氨丙基碳二亞胺(EDC)。非常溫和地?cái)嚢?小時(shí)后，加入第二部分30mg EDC。非常溫和地再攪拌2小時(shí)后，加入第三部分40mg碳二亞胺。將反應(yīng)混合物在這些條件下放置過夜，用蒸餾水透析15小時(shí)，然后凍干。通過凝膠滲透層析、SDS-PAGE和印跡到PVDF膜后進(jìn)行碳水化合物特異性染色(Glyco-Dig試劑盒，來(lái)自Roche-Boehringer，Basle)證實(shí)偶聯(lián)成功。偶聯(lián)產(chǎn)物的產(chǎn)率約為90％。
實(shí)施例4選擇性氧化的低分子量HES(ox-HES-10kD)與人血清白蛋白(HSA)的偶聯(lián)在有磁力攪拌器的圓底燒瓶中使7.4g ox-HES-10kD和50mgHAS完全溶解于水中。通過上述對(duì)高分子量HES的方法進(jìn)行反應(yīng)，分三份加入總共282mg EDC。將反應(yīng)混合物如上所述透析并凍干。分析(見上)表明獲得偶聯(lián)產(chǎn)物，但是產(chǎn)率略低于與高分子量ox-HES的偶聯(lián)。
實(shí)施例5ox-HES-130kD與肌紅蛋白(Mb)的偶聯(lián)將4.3g ox-HES-130kD完全溶解于水(6-7ml)中，然后加入溶解于10ml 0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.0)的100mg Mb(Sigma，Taufkirchen)。加入30mg EDC開始偶聯(lián)反應(yīng)。每2小時(shí)重復(fù)加入EDC，直到消耗總共90mg碳二亞胺。反應(yīng)混合物然后用50mM磷酸鹽緩沖液pH7.0透析，凍干。GPC顯示在450nm處的滯留體積中檢測(cè)到一個(gè)明確的產(chǎn)物峰?？梢該?jù)此計(jì)算出偶聯(lián)產(chǎn)率為88％。HES化肌紅蛋白的氧氣結(jié)合能力約為未修飾Mb結(jié)合能力的76％。
實(shí)施例6ox-HES-10kD與超氧化物歧化酶(SOD)的偶聯(lián)將一體積份的ox-HES-10kD水溶液(1.05g/ml)與一體積份的7mg/ml SOD溶液(Sigma，Taufkirchen)在50mM磷酸鹽緩沖液pH7.6中室溫溫育。在24小時(shí)內(nèi)分5份加入280mg EDC開始偶聯(lián)反應(yīng)。在磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行GPC分析，并在280nm下檢測(cè)，跟蹤反應(yīng)的進(jìn)程。24小時(shí)后，在分離柱的較高分子量區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)81％的蛋白質(zhì)，之后終止反應(yīng)。反應(yīng)混合物用30kD膜透濾，然后凍干。產(chǎn)物的質(zhì)譜分析顯示HES與蛋白質(zhì)的平均摩爾比約為3∶1。
實(shí)施例7ox-HES-130kD與鏈激酶(SK)的偶聯(lián)將3.8mg ox-HES-130kD與35mg鏈激酶(Sigma，Taufkirchen)一起溶解于最小量的50mM磷酸鹽緩沖液pH7.2中。在室溫下，加入46.5mg EDC和20mg水合1-羥基苯并三唑(HOBt)，輕輕攪拌維持反應(yīng)總共24小時(shí)。透析并冷凍干燥后，經(jīng)GPC分析發(fā)現(xiàn)約78％的蛋白質(zhì)為HES偶聯(lián)物。在銀染色的SDS-PAGE中，可以觀察到鏈激酶分子量明顯提高。與之平行，利用洋地黃毒苷法在高分子波段中明顯檢測(cè)到碳水化合物結(jié)構(gòu)。
實(shí)施例8ox-HES-130 kD與人白介素-1(IL-2)的偶聯(lián)溫和加熱，使45mg ox-HES-130kD完全溶解于0.5ml 50mM磷酸鈉緩沖液pH6.5中。加入0.25mg人IL-2(Sigma，Taufkirchen)，后者使溶液不透明，在室溫下攪拌混合物4-6小時(shí)。然后以2小時(shí)的時(shí)間間隔分4份加入5mg EDC，持續(xù)攪拌過夜，形成澄清的溶液。GPC分析顯示偶聯(lián)產(chǎn)率約為65％。
實(shí)施例9ox-HES-25kD與人腫瘤壞死因子α(TNFα)的偶聯(lián)將0.3mg hTNFα(Sigma，Taufkirchen)加入86mg ox-HES-25kD在約0.4ml 0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中的溶液中。將該渾濁的溶液攪拌約2小時(shí)，之后加入1mg EDC和0.5mg HOBt。繼續(xù)攪拌約6小時(shí)，溶液在反應(yīng)時(shí)間內(nèi)變得澄清。偶聯(lián)產(chǎn)物通過超濾分離、冷凍干燥，通過GPC和在280nm處的檢測(cè)進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)本反應(yīng)的偶聯(lián)產(chǎn)率約為74％。
實(shí)施例10ox-HES-130kD與胰高血糖素樣肽(GLP-1)的偶聯(lián)通過加熱和輕柔攪拌將7.4g ox-HES-130kD溶解于最小體積的水中。用移液管加入10mg酰胺形式的GLP-1(Bachem，瑞士)在50mM磷酸鹽緩沖液pH7.4中的溶液。加入35mg EDC開始反應(yīng)，小心攪拌2小時(shí)。該步驟重復(fù)兩次，在這之后，在GPC分析中280nm處的肽峰不再明顯，即幾乎完全轉(zhuǎn)化為偶聯(lián)產(chǎn)物。該偶聯(lián)產(chǎn)物用30kD膜透濾，從磷酸鹽緩沖液中凍干。根據(jù)MALDI質(zhì)譜分析的結(jié)果能夠推斷肽與HES的化學(xué)定量為1∶1。
實(shí)施例11高分子量HES(HES-130kD)與人血清白蛋白(HSA)的偶聯(lián)將9.75g HES-130kD完全溶解于水(6-7ml)中，然后加入溶解于1ml 0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中的50mg HSA。反應(yīng)混合物用磁力攪拌器攪拌。該溶液然后與NaBH3CN(50-70mg)混合，輕輕攪拌幾分鐘。每2小時(shí)進(jìn)一步攪拌該溶液15分鐘。然后加入另一等份NaBH3CN(約50mg)。最終(接近36小時(shí)的反應(yīng)時(shí)間之后)使用了總量為285mg的NaBH3CN。然后將該溶液透析并凍干。如實(shí)施例4所述進(jìn)行分析。偶聯(lián)效率約為65％。
實(shí)施例12低分子量HES(HES-130kD)與人血清白蛋白(HSA)的偶聯(lián)將4.5g HES完全溶解于水(4-5ml)中，加入溶解于1ml 0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中的50mg HSA。當(dāng)溶液澄清時(shí)(必要時(shí)用磁力攪拌器攪拌實(shí)現(xiàn))，加入NaBH4(50-70mg)，輕輕攪拌混合。將該溶液不加攪拌靜置2小時(shí)，然后如同與高分子量HES的反應(yīng)一樣每2小時(shí)攪拌15分鐘。當(dāng)溶液不再有任何氣泡時(shí)(生成H2)，加入另一份NaBH4(約50mg)。最終使用了總量為180mg的NaBH4。然后將該溶液透析并凍干。通過凝膠滲透層析(GPC)進(jìn)行分析，產(chǎn)率約為15％。
實(shí)施例13HES-40kD與天冬酰胺酶的偶聯(lián)將3.0g HES-40kD完全溶解于水(約4ml)中。加入80mg天冬酰胺酶(Sigma，Taufkirchen)在6ml 0.1M硼酸鹽緩沖液pH9.0中的溶液，攪拌直到反應(yīng)混合物澄清。然后使溫度升高到37℃，2小時(shí)后加入約50mg NaBH3CN。該反應(yīng)循環(huán)再重復(fù)3次。反應(yīng)混合物用0.1M磷酸鹽緩沖液pH7.4透析，獲得產(chǎn)物。偶聯(lián)產(chǎn)物的產(chǎn)率約為61％，約73％的天冬酰胺酶活性保留。
實(shí)施例14HES-130kD與人白介素-2(IL-2)的偶聯(lián)將50mg HES-130kD完全溶解于水(約0.2ml)中。加入0.25mg人IL-2(Sigma，Taufkirchen)在0.2ml 0.1M硼酸鹽緩沖液pH9.0中的懸液，攪拌直到反應(yīng)混合物澄清(4小時(shí))。以每4小時(shí)的間隔加入1mg份的NaBH3CN，持續(xù)攪拌。再經(jīng)過24小時(shí)的反應(yīng)時(shí)間后，混合物用0.1M磷酸鹽緩沖液pH7.4透析，凍干。根據(jù)GPC分析，偶聯(lián)產(chǎn)物的產(chǎn)率約為42％。
實(shí)施例15HES-130kD與胰島素的偶聯(lián)將4.0g HES-130kD完全溶解于水(約6ml)中。加入溶于7.5ml0.1M硼酸鹽緩沖液(pH9.0)的55mg來(lái)自牛胰腺的胰島素(Sigma，Taufkirchen)，在37℃下攪拌約24小時(shí)。在8小時(shí)內(nèi)緩慢逐滴加入還原劑NaBH3CN(60mg，30ml)。然后再攪拌反應(yīng)混合物24小時(shí)，通過超濾(30kD)除去無(wú)關(guān)物質(zhì)和未反應(yīng)的試劑。凍干產(chǎn)生穩(wěn)定的偶聯(lián)產(chǎn)物。使用的胰島素中約有55％作為HES偶聯(lián)物回收。
實(shí)施例16ox-HES-130kD與超氧化物歧化酶(SOD)的偶聯(lián)將130mg ox-HES-130kD完全溶解于6ml PBS pH 6中，然后加入溶于1ml PBS pH 6的10mg SOD(Roche，Mannheim)。加入10mgEDC開始偶聯(lián)反應(yīng)。每3小時(shí)重復(fù)加入EDC，直到消耗39mg碳二亞胺。通過GPC在258nm處監(jiān)測(cè)反應(yīng)。24小時(shí)后，在分離柱的高分子量區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)50％的蛋白質(zhì)，終止反應(yīng)。反應(yīng)混合物用25mM磷酸鹽緩沖液pH7.2透析，凍干。SOD活性是最初活性的95％。通過GPC-光散射聯(lián)合測(cè)定HES蛋白質(zhì)樣品的質(zhì)量分布，顯示HES與蛋白質(zhì)的摩爾比為1∶1。
實(shí)施例17ox-HES 70kD與胰高血糖素的偶聯(lián)將胰高血糖素(66×10-9mol，0.23mg)、ox-HES 70kD(6.6×10-6mol，123mg)在圓底燒瓶中溶解于磷酸鹽緩沖液(1ml，pH 5)中。以1小時(shí)的間隔分10份加入26mg EDC。在24小時(shí)反應(yīng)時(shí)間后，加入10ml水終止反應(yīng)。用水透析后通過GPC和離子交換層析純化偶聯(lián)產(chǎn)物。冷凍干燥產(chǎn)生88mg白色偶聯(lián)產(chǎn)物(73％)。
權(quán)利要求
1.一種羥烷基淀粉-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，其特征在于羥烷基淀粉分子與蛋白質(zhì)之間的結(jié)合作用是以共價(jià)鍵合為基礎(chǔ)，該鍵合由下述兩種基團(tuán)偶聯(lián)反應(yīng)形成(i)羥烷基淀粉分子的末端醛基，或通過化學(xué)反應(yīng)由該醛基衍生的官能團(tuán)，(ii)能夠與羥烷基淀粉分子的該醛基或由其衍生的官能團(tuán)反應(yīng)的蛋白質(zhì)的官能團(tuán)，其中偶聯(lián)反應(yīng)直接產(chǎn)生的鍵合必要時(shí)可以通過進(jìn)一步反應(yīng)被適宜地修飾形成上述共價(jià)鍵合。
2.如權(quán)利要求1所述的羥烷基淀粉-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，其特征在于通過化學(xué)反應(yīng)由羥烷基淀粉分子的末端醛基衍生的官能團(tuán)是已經(jīng)與末端醛基反應(yīng)的雙功能接頭分子的官能團(tuán)之一。
3.如權(quán)利要求1或2所述的羥烷基淀粉-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，其特征在于該蛋白質(zhì)的反應(yīng)性官能團(tuán)是已經(jīng)與該蛋白質(zhì)偶聯(lián)的雙功能接頭分子的官能團(tuán)之一。
4.如權(quán)利要求1或2所述的羥烷基淀粉-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，其特征在于該蛋白質(zhì)的反應(yīng)性官能團(tuán)是通過對(duì)原始氨基酸序列進(jìn)行重組修飾而引入蛋白質(zhì)內(nèi)。
5.如權(quán)利要求1、3或4所述的羥烷基淀粉-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，其特征在于共價(jià)鍵合由下述兩種基團(tuán)的偶聯(lián)反應(yīng)形成羥烷基淀粉分子的末端醛基通過選擇性氧化形成的羧基或活化的羧基與蛋白質(zhì)的伯氨基或硫醇基。
6.如權(quán)利要求5所述的偶聯(lián)物，其特征在于共價(jià)鍵合是是由下述兩種基團(tuán)的偶聯(lián)反應(yīng)形成的酰胺鍵羥烷基淀粉分子的末端醛基通過選擇性氧化形成的活化羧基與蛋白質(zhì)的伯氨基。
7.如權(quán)利要求1、3或4所述的偶聯(lián)物，其特征在于共價(jià)鍵合是如下形成的酰胺鍵羥烷基淀粉分子的末端醛基與蛋白質(zhì)的伯氨基之間的偶聯(lián)反應(yīng)形成希夫堿、再將希夫堿還原為胺。
8.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的偶聯(lián)物，其特征在于羥烷基淀粉分子的分子量為約4到約1000kD。
9.如權(quán)利要求8所述的偶聯(lián)物，其特征在于羥烷基淀粉分子的分子量為約4到約50kD。
10.如權(quán)利要求8所述的偶聯(lián)物，其特征在于羥烷基淀粉分子的分子量為約70到約1000kD。
11.如權(quán)利要求10所述的偶聯(lián)物，其特征在于羥烷基淀粉分子的分子量約為130kD。
12.如權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的偶聯(lián)物，其特征在于羥烷基淀粉分子的取代程度為約0.3到約0.7。
13.如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的偶聯(lián)物，其特征在于羥烷基淀粉分子的C2與C6取代之比為8到12。
14.如權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的偶聯(lián)物，其特征在于羥烷基淀粉分子是一種羥乙基淀粉分子。
15.如權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的偶聯(lián)物，其特征在于該蛋白質(zhì)具有調(diào)節(jié)或催化功能、信號(hào)傳導(dǎo)或轉(zhuǎn)運(yùn)功能、或在免疫應(yīng)答或誘導(dǎo)免疫應(yīng)答中的功能。
16.如權(quán)利要求15所述的偶聯(lián)物，其特征在于該蛋白質(zhì)選自酶、抗體、抗原、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、生物粘附蛋白、激素和激素原、生長(zhǎng)因子和生長(zhǎng)因子受體、細(xì)胞因子、受體、抑制因子、激活劑、抑制劑或其功能衍生物或片段。
17.如權(quán)利要求15或16所述的偶聯(lián)物，其特征在于該蛋白質(zhì)是α-、β-或γ-干擾素，白介素，血清蛋白質(zhì)如白蛋白或凝血因子，促紅細(xì)胞生成素，肌紅蛋白，血紅蛋白，纖溶酶原活化因子，BCGF，BDGF，EGF，F(xiàn)GF，NGF，PDGF，BDNF，CNTF，TGF-α，TGF-β，集落刺激因子，BMP，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素，促生長(zhǎng)素，促生長(zhǎng)素抑制素，胰島素，促性腺激素，α-MSH，曲普瑞林，催乳素，降鈣素，胰高血糖素，胰高血糖素樣肽如GLP-1或GLP-2，腸促胰島素類似物，瘦素，胃泌素，促胰液素，整聯(lián)蛋白，下丘腦激素如ADH、催產(chǎn)素、釋放素或抑制素，甲狀腺激素如甲狀腺素、促甲狀腺素、促甲狀腺素釋放素，生長(zhǎng)激素如人生長(zhǎng)激素，LH，F(xiàn)SH，色素激素，TNF-α或TNF-β，水蛭素，脂蛋白或載脂蛋白如Apo-B、Apo-E、Apo-La，寡賴氨酸蛋白，RGD蛋白，凝集素或蓖麻毒素，蜂毒或蛇毒，免疫毒素，豚草變應(yīng)原，E抗原，免疫球蛋白，或這些蛋白質(zhì)之一的受體，或這些蛋白質(zhì)或受體之一的功能衍生物或片段。
18.如權(quán)利要求15或16所述的偶聯(lián)物，其特征在于該蛋白質(zhì)是選自下列的酶天冬酰胺酶，精氨酸酶，精氨酸脫氨酶，腺苷脫氨酶，谷氨酰胺酶，谷氨酰胺酶-天冬酰胺酶，苯丙氨酸氨裂合酶，色氨酸酶，酪氨酸酶，超氧化物歧化酶，內(nèi)毒素酶，過氧化氫酶，過氧化物酶，激肽釋放酶，胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，彈性蛋白酶，嗜熱菌蛋白酶，脂酶，尿酸酶，腺苷二磷酸酶，嘌呤核苷磷酸化酶，膽紅素氧化酶，葡萄糖氧化酶，glucodase，葡糖酸氧化酶，半乳糖苷酶，葡糖腦苷脂酶，葡糖苷酸酶，透明質(zhì)酸酶，組織因子，組織纖溶酶原激活物，鏈激酶，尿激酶，MAP激酶，DNAse，RNAse，乳鐵蛋白，及其功能衍生物或片段。
19.一種藥物組合物，其含有有效量的權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)所述的偶聯(lián)物，和可藥用載體，和必要時(shí)其它賦形劑和活性成分。
20.如權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)所述的偶聯(lián)物或如權(quán)利要求19所述的組合物在人或動(dòng)物治療或預(yù)防中的用途。
21.一種制備如權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)所述的羥烷基淀粉-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的方法，其特征在于在水溶液中進(jìn)行下述基團(tuán)之間的偶聯(lián)反應(yīng)羥烷基淀粉分子的末端醛基、或通過化學(xué)反應(yīng)由該醛基衍生的官能團(tuán)，以及能夠與羥烷基淀粉分子的該醛基或由其衍生的官能團(tuán)反應(yīng)的蛋白質(zhì)的官能團(tuán)，偶聯(lián)反應(yīng)直接形成的鍵合必要時(shí)通過進(jìn)一步反應(yīng)進(jìn)行修飾。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于該偶聯(lián)反應(yīng)的反應(yīng)介質(zhì)是水或水與有機(jī)溶劑的混合物，其中混合物的含水量至少為80％。
23.如權(quán)利要求21或22所述的方法，其特征在于通過選擇性氧化將羥烷基淀粉分子的末端醛基轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的羧基官能團(tuán)，后者隨后在活化條件下在水溶液中與蛋白質(zhì)的游離氨基反應(yīng)，使得羥烷基淀粉分子通過酰胺鍵與該蛋白質(zhì)連接。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于用碘或金屬離子在堿性水溶液中進(jìn)行醛基的選擇性氧化。
25.如權(quán)利要求23或24所述的方法，其特征在于偶聯(lián)反應(yīng)在碳二亞胺存在下進(jìn)行。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于碳二亞胺是1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)。
27.如權(quán)利要求21或22所述的方法，其特征在于羥烷基淀粉分子的末端醛基與蛋白質(zhì)的游離氨基偶聯(lián)形成希夫堿，形成的希夫堿被還原為胺，使得羥烷基淀粉分子通過胺鍵與該蛋白質(zhì)連接。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于偶聯(lián)和還原都在水溶液中發(fā)生。
29.如權(quán)利要求27或28所述的方法，其特征在于還原劑是硼氫化鈉、氰基硼氫鈉或有機(jī)硼復(fù)合物。
30.如權(quán)利要求27-29中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于偶聯(lián)和還原反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行。
31.一種制備在末端醛基處被選擇性氧化的羥烷基淀粉的方法，其特征在于羥烷基淀粉在堿性水溶液中與碘反應(yīng)，碘與HAS的摩爾比為2∶1到20∶1。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于碘與HAS的摩爾比為約5∶1到6∶1。
33.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于a)一定量的羥烷基淀粉溶解于溫蒸餾水中，加入略低于1摩爾當(dāng)量的碘水溶液，b)以幾分鐘的間隔，向反應(yīng)溶液中逐滴緩慢加入摩爾濃度為碘溶液的約5-15倍的NaOH溶液，直到溶液在加入后再次開始變澄清，c)再向反應(yīng)溶液中加入略低于1摩爾當(dāng)量的碘水溶液，d)重新逐滴加入NaOH溶液，e)重復(fù)步驟b)-d)，直到加入了基于羥烷基淀粉約5.5-6摩爾當(dāng)量的碘溶液和11-12摩爾當(dāng)量的NaOH溶液，f)然后終止反應(yīng)，使反應(yīng)溶液脫鹽，進(jìn)行陽(yáng)離子交換層析，通過凍干法獲得反應(yīng)產(chǎn)物。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于碘水溶液是約0.05-0.5N的碘溶液。
35.如權(quán)利要求33或34所述的方法，其特征在于NaOH溶液的摩爾濃度約為碘溶液的10倍。
36.一種制備在末端醛基處被選擇性氧化的羥烷基淀粉的方法，其特征在于HAS在堿水溶液中用摩爾過量的穩(wěn)定化金屬離子氧化，該離子選自Cu2+離子和Ag+離子。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種將蛋白質(zhì)與一種淀粉衍生的修飾多糖偶聯(lián)的方法。修飾多糖與蛋白質(zhì)之間的結(jié)合作用以共價(jià)鍵為基礎(chǔ)，該共價(jià)鍵是下列兩種基團(tuán)之間偶聯(lián)反應(yīng)的結(jié)果修飾多糖分子的末端醛基或者通過該醛基化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的官能團(tuán)，和能夠與多糖分子的醛基或所產(chǎn)生的官能團(tuán)反應(yīng)的蛋白質(zhì)官能團(tuán)。偶聯(lián)反應(yīng)直接產(chǎn)生的鍵可以任選地通過進(jìn)一步反應(yīng)進(jìn)行修飾形成上述共價(jià)鍵。本發(fā)明還涉及含有在該偶聯(lián)過程中形成的偶聯(lián)物的藥物組合物，以及所述偶聯(lián)物和組合物在人或動(dòng)物體的預(yù)防或治療中的用途。
文檔編號(hào)A61K38/22GK1638808SQ03805183
公開日2005年7月13日 申請(qǐng)日期2003年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月6日
發(fā)明者于爾根·亨貝格爾, 米歇爾·奧蘭多 申請(qǐng)人:弗雷澤紐斯卡比德國(guó)有限公司