一種蛋白質(zhì)類泛素化修飾位點(diǎn)鑒定方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)類泛素化修飾位點(diǎn)鑒定方法，該特異性富集標(biāo)記鑒定方法首先是對純化后的類泛素化修飾蛋白質(zhì)進(jìn)行酶解，通過特異性類泛素化抗體富集類泛素化修飾的酶切肽段，隨后利用化學(xué)標(biāo)記對所富集肽段中的非修飾化的賴氨酸氨基殘基進(jìn)行保護(hù)，并經(jīng)去泛素化酶催化反應(yīng)以裸露出底物肽段序列上被修飾的賴氨酸，經(jīng)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀分析肽段序列，通過蛋白質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析軟件匹配得到被化學(xué)修飾的肽段序列，其序列中含有游離氨基的賴氨酸位點(diǎn)即為類泛素化修飾位點(diǎn)。與目前常用的基因突變方法獲得位點(diǎn)方式比較，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是無需繁瑣的基因突變技術(shù)手段即可快速、高效、準(zhǔn)確地得到蛋白質(zhì)類泛素化修飾位點(diǎn)信息。
【專利說明】一種蛋白質(zhì)類泛素化修飾位點(diǎn)鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域，更具體地講，涉及蛋白質(zhì)類泛素化修飾位點(diǎn)的鑒定及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)胞內(nèi)存在多種蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式，如磷酸化、乙酰化、泛素化、甲基化等，它們都對蛋白質(zhì)發(fā)揮正常的生物學(xué)功能起著重要作用。其中泛素化(ubiquitylation)是介導(dǎo)蛋白質(zhì)降解的重要方式之一，通過將76個(gè)氨基酸的泛素(ubiquitin，Ub)結(jié)合到靶蛋白上形成多聚泛素鏈，被蛋白酶體識(shí)別，引起蛋白質(zhì)降解。近些年來幾種類泛素蛋白(ubiquitin-likeproteins, Ubls)陸續(xù)被發(fā)現(xiàn),它們結(jié)構(gòu)與泛素類似，在細(xì)胞內(nèi)具有廣泛功能，SUMO (small ubi quit in-re lated modifier)就是其中的重要成員之一。SUMO 是一類高度保守的蛋白質(zhì)家族，該家族的第一個(gè)成員SMT3于1995年在釀酒酵母中被首次發(fā)現(xiàn)，當(dāng)時(shí)認(rèn)為它有參與有絲分裂和減數(shù)分裂的功能。隨著研究的進(jìn)一步深入發(fā)現(xiàn)，SUMO化(sumoylation)功能遠(yuǎn)不限于此。SUMO可與包括雄激素受體(androgen receptor, AR)、I κ Ba、c_Jun、組蛋白去乙?；?histone deacetylases, HDACs)及p53在內(nèi)的多種蛋白質(zhì)結(jié)合，參與了更為廣泛的細(xì)胞內(nèi)代謝途徑，在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、DNA修復(fù)、核轉(zhuǎn)運(yùn)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞周期調(diào)控等多方面均發(fā)揮著重要作用。
[0003]具有修飾功能的SUM0，是一類廣泛存在于真核生物細(xì)胞中的高度保守的蛋白家族，在芽殖酵母、線蟲、果蠅及培養(yǎng)的脊椎動(dòng)物細(xì)胞中均有表達(dá)。人類基因組編碼四種不同的 SUMO蛋白，分別為:SUM0-1 (又稱PIC1, UBLI, sentrin, GMPl 或SMT3)、SUM0-2 (又稱 SMT3A或 sentrin3)、SUM0_3 (又稱 SMT3B 或 sertrin2)和 SUM0-4，其中 SUM0_1、SUM02 及 SUM03 在各種組織中均有表達(dá)，而SUM0-4則主要在腎臟、淋巴結(jié)和脾臟中表達(dá)。其中SUM0-2，3具有97%的同源性，而與SUM0-1的同源性僅50%。序列比對結(jié)果表明:所有的SUMO蛋白都具有保守的泛素結(jié)構(gòu)域和C端雙Gly的斷裂/連接位點(diǎn)，N端延伸區(qū)域富含帶電荷氨基酸、Gly和Pro，為特異的蛋白-蛋白相互作用提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
[0004]SUMO化是動(dòng)態(tài)的可逆性修飾過程，所有的SUMO都以非活性的前體形式存在，需在泛素相似蛋白加工酶(ubiquilin like protein progressing enzyme,ULPs)或 SUMO特異性蛋白酶(SUMO specific proteases, SENP)催化下水解C端短肽以暴露出GlyGly殘基，成為成熟的SUM0。與泛素化修飾相似，成熟的SUMO在ATP存在下，經(jīng)SUMO活化酶El，SUMO結(jié)合酶E2，SUMO連接酶E3的級聯(lián)反應(yīng)，最終其C端Gly殘基與靶蛋白底物L(fēng)ys側(cè)鏈ε -氨基通過異肽鍵偶聯(lián)。研究發(fā)現(xiàn)，連接酶Ε3決定了底物特異性。超過50%SUM0底物靶位點(diǎn)為一保守序列ΨΚΧΕ(Ψ代表L、1、V、F等疏水氨基酸，K代表賴氨酸，X為任意氨基酸，E代表谷氨酸)。另一個(gè)具代表性的保守序列叫做磷酸化依賴的SUMO序列，即ΨΚΧΕ緊連著P介導(dǎo)的磷酸化序列。SUMO修飾的逆反應(yīng)過程是由一組SUMO特異性蛋白酶(SUMO-specificproteases, SENPs)完成。
[0005]對SUMO化修飾蛋白質(zhì)的發(fā)掘已經(jīng)從以往的利用突變技術(shù)集中單個(gè)或少數(shù)蛋白修飾發(fā)展到目前利用高通量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，進(jìn)行大規(guī)模SUMO化修飾蛋白質(zhì)的發(fā)掘與鑒定。與文獻(xiàn)數(shù)以萬計(jì)的磷酸化位點(diǎn)相比，目前鑒定到的SUMO化位點(diǎn)鑒定的研究可謂鳳毛菱角。主要原因如下:第一，由于SUMO化修飾的動(dòng)態(tài)性和可逆性，正常細(xì)胞內(nèi)SUMO化的蛋白占總蛋白比例不超過5%，許多蛋白只有處在特定刺激條件下如細(xì)胞周期、營養(yǎng)狀態(tài)、熱休克、DNA損傷等才會(huì)被SUMO化修飾，如何富集到足夠的SUMO化肽段進(jìn)行鑒定而排除未修飾肽段的干擾，一直是研究的難點(diǎn)；第二，SUMO化修飾使得被胰酶酶切后的SUMO化修飾肽段分子量有顯著遷移(SUM0-1修飾使得肽段分子量增加2136Da，SUM0-2/3修飾使得肽段分子量增加3552Da)，若被修飾肽段帶電荷不足，荷質(zhì)比不在質(zhì)譜檢測范圍內(nèi)(400-1800)，則不能被選中，進(jìn)行MS/MS序列鑒定；第三，高分子量的SUMO化肽段在一級質(zhì)譜中被選定進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離時(shí)，由于碰撞能量有限，往往不能提供足夠豐富的碎片離子供序列鑒定之用；第四，與磷酸化修飾不同，SUMO修飾部分的氨基酸序列也會(huì)產(chǎn)生碰撞解離，使得整張SUMO化肽段MS/MS質(zhì)譜圖相當(dāng)復(fù)雜。盡管有所嘗試，目前尚未有可商業(yè)化數(shù)據(jù)分析軟件，能夠?qū)@些SUMO修飾質(zhì)譜的MS/MS進(jìn)行高通量識(shí)別，鑒定出底物肽段序列及修飾位點(diǎn)。體外反應(yīng)體系鑒定到僅有少量SUMO化位點(diǎn)。采取對SUMO序列特定氨基酸進(jìn)行突變可獲得一些位點(diǎn)數(shù)據(jù)。
[0006]確定蛋白質(zhì)SUMO化修飾位點(diǎn)不僅能夠闡明可能發(fā)生修飾的保守氨基酸序列或者結(jié)構(gòu)基序的特定規(guī)律，而且為研究此類修飾對于蛋白質(zhì)在信號(hào)通路的潛在功能提供了重要證據(jù)，對于明確蛋白質(zhì)SUMO修飾的生物學(xué)效應(yīng)，深入研究SUMO化修飾在細(xì)胞生長、發(fā)育、凋亡過程中的關(guān)鍵調(diào)控作用，具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]為解決類泛素化修飾位點(diǎn)鑒定的困難，本發(fā)明提供一種可快速、準(zhǔn)確鑒定蛋白質(zhì)類泛素化修飾位點(diǎn)鑒定的方法。
[0008]本發(fā)明的第二個(gè)目的，是提供化學(xué)標(biāo)記在蛋白質(zhì)類泛素化修飾位點(diǎn)鑒定中的應(yīng)用。
[0009]為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種蛋白質(zhì)類泛素化修飾位點(diǎn)鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0010](I)對純化的SUMO化蛋白進(jìn)行酶切；
[0011](2)特異性抗體對SUMO化修飾肽段富集；
[0012](3)化學(xué)標(biāo)記對所富集肽段中的非修飾化的賴氨酸氨基殘基進(jìn)行保護(hù)；
[0013](4)去泛素化酶催化反應(yīng)以裸露出底物肽段序列上被修飾的賴氨酸；
[0014](5)液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀分析肽段序列；
[0015](6)利用蛋白質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析軟件匹配得到被化學(xué)修飾的肽段序列，其序列中含游離氨基的賴氨酸位點(diǎn)即為類泛素化修飾位點(diǎn)；
[0016]所述SUMO化修飾包括SUMOl，SUM02和SUM03類泛素化修飾。
[0017]作為一個(gè)優(yōu)選方案，步驟(2)所述抗體是指對SUMO化肽段進(jìn)行修飾的特異性抗體，經(jīng)兔血清免疫所得，可分別特異性識(shí)別類泛素修飾SUMOl，SUM02或者SUMO 3所對應(yīng)的特定氨基酸序列。
[0018]作為又一個(gè)優(yōu)選方案，步驟(3)所述化學(xué)標(biāo)記為二烷基化修飾或乙?；揎椈螂一揎椫械囊环N。
[0019]所述二烷基化修飾包括如下步驟:
[0020](a)將樣品溶于pH7.5緩沖溶液中，加入新鮮配置的醛類溶液中，混合均勻；
[0021](b)加入新鮮配置的還原試劑，混合均勻，反應(yīng)完畢后用終止溶液淬滅反應(yīng)；
[0022](C)用色譜預(yù)柱脫鹽。
[0023]作為一個(gè)優(yōu)選方案，步驟(a)所述的醛類化學(xué)結(jié)構(gòu)式為R1CHC^R1為碘取代的C1~C10的烷基，濃度為0.01 -1M之間；
[0024]步驟(b)所述的還原試劑為硼氫化鈉、氰基硼氫化鈉或者硼烷中的一種，濃度為
0.01 -1M之間；反應(yīng)溫度0-60°C之間；反應(yīng)時(shí)間1-48小時(shí)；所述的終止溶液指酸性溶液，為鹽酸、甲酸、乙酸或者三氟乙酸溶液中的一種或幾種，濃度在0.1-5%之間；
[0025]步驟(C)所述色譜預(yù)柱為Ziptip脫鹽柱。
[0026]所述乙?；揎棸ㄈ缦虏襟E:
[0027](a)將樣品溶于pH7.5緩沖溶液中，加入新鮮配置的N-乙酸基取代物溶液中，混合均勻；
[0028](b)加入新鮮配置的去酯化反應(yīng)溶液，混合均勻，用終止溶液淬滅反應(yīng)；
[0029](C)用色譜預(yù)柱脫鹽。
[0030]作為一個(gè)優(yōu)選方案，步驟(a)所述的N-乙酸基取代物溶液為N-乙酸基乙酰氯、N-乙酸基乙酸、N-乙酸基琥珀酰亞胺或者N-乙酸基甘氨酸中的一種或幾種，濃度為
0.01-1M之間，反應(yīng)溫度25-60。。之間;反應(yīng)時(shí)間1-24小時(shí)；
[0031]步驟(b)所述的去酯化反應(yīng)溶液為鹽酸羥胺、硫酸羥胺、N，N-二乙基羥胺、硝酸羥胺或者磷酸羥胺中的一種或幾種，濃度為0.01 -1M之間，所述終止溶液為谷氨酸、甘氨酸或者亮氨酸中的一種或幾種，濃度在1-1OOmM之間；
[0032]步驟(C)所述色譜預(yù)柱為Ziptip脫鹽柱。
[0033]所述胍基化修飾包括如下步驟:
[0034](a)將樣品溶解于堿性緩沖溶液中，加入新鮮配置的鄰甲基異脲硫酸鹽溶液，啟動(dòng)化學(xué)反應(yīng)；
[0035](b)加入酸性緩沖溶液，調(diào)pH值至酸性淬滅反應(yīng)；
[0036](C)用色譜預(yù)柱脫鹽。
[0037]作為一個(gè)優(yōu)選方案，步驟(a)所述的堿性緩沖溶液為氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉或者氨水中的一種或幾種，濃度為1-10M之間；反應(yīng)溫度在-20-100°C之間，反應(yīng)時(shí)間1-24小時(shí)；
[0038]步驟(b)所述的酸性緩沖溶液為甲酸、乙酸、丁酸、醋酸或者三氟乙酸中的一種或幾種，濃度為0.01%-20%之間；
[0039]步驟(C)所述色譜預(yù)柱為Ziptip脫鹽柱。
[0040]作為又一個(gè)優(yōu)選方案，步驟(4)所述去泛素化酶催化反應(yīng)包括如下步驟:
[0041](a)將樣品重新溶于去泛素化酶及酶催化反應(yīng)緩沖溶液，混合均勻，37°C反應(yīng)；
[0042](b)色譜預(yù)柱脫鹽。
[0043]作為一個(gè)優(yōu)選方案，步驟(a)所述去泛素化酶指SENP，包括SENP1，SENP2或者SENP3中的一種或幾種；所述酶催化反應(yīng)溶液為含有還原試劑和氯化鈉的磷酸、Tris-HCl或!fepes-HCl緩沖溶液，所述還原試劑為二硫蘇糖醇或者β -巰基乙醇溶液，還原試劑濃度為0.0Ol -1M之間，氯化鈉濃度為0.05 -1M之間；
[0044]步驟(b)所述色譜預(yù)柱為Ziptip脫鹽柱。
[0045]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明第二個(gè)目的，本發(fā)明提供化學(xué)標(biāo)記在蛋白質(zhì)類泛素化修飾位點(diǎn)鑒定中的應(yīng)用。
[0046]作為一個(gè)優(yōu)選方案，蛋白質(zhì)類泛素化修飾位點(diǎn)鑒定包括如下步驟:
[0047]( I)對純化的SUMO化蛋白進(jìn)行酶切；
[0048](2 )特異性抗體對SUMO化修飾肽段富集；
[0049](3)化學(xué)標(biāo)記對所富集肽段中的非修飾化的賴氨酸氨基殘基進(jìn)行保護(hù)；
[0050](4)去泛素化酶催化反應(yīng)以裸露出底物肽段序列上被修飾的賴氨酸；
[0051](5)液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀分析肽段序列；
[0052](6)利用蛋白質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析軟件匹配得到被化學(xué)修飾的肽段序列，其序列中含游離氨基的賴氨酸位點(diǎn)即為類泛素化修飾位點(diǎn)；
[0053]所述SUMO化修飾包括SUMOl，SUM02和SUM03類泛素化修飾。
[0054]作為一個(gè)優(yōu)選,所述化學(xué)標(biāo)記是指二烷基化修飾、乙?；揎椈蛘唠一揎棥?br> [0055]本發(fā)明的SUMO化蛋白純化和對純化的SUMO化蛋白進(jìn)行酶切為常規(guī)步驟，一般包括如下步驟:
[0056](a)將蛋白溶液中加入還原試劑，使蛋白二硫鍵打開；
[0057](b)加入烷基化試劑，避光室溫孵育30min，將蛋白巰基烷基化；
[0058](c)取3-10mg蛋白，加入適量蛋白水解酶,酶解消化后中止酶活性；
[0059](d)真空濃縮機(jī)濃縮干燥成粉末后，再加入ImL去離子水，反復(fù)重復(fù)此過程3-4次。
[0060]步驟(a)所述的還原試劑推薦為二硫蘇糖醇或者β -巰基乙醇等。
[0061]步驟(b)所述的烷基化試劑推薦為R1 (CO) NH2，其中=R1推薦為碘取代的C1-Cltl的烷基，優(yōu)選為碘取代的C1~C4的烷基。
[0062]步驟(C)所述蛋白水解酶可以為typsin, Lys-C, Arg-C等。與蛋白的反應(yīng)比例推薦在1:50-1:100之間,視酶活性而定。
[0063]步驟(2)特異性抗體對SUMO化修飾肽段富集是采用肽段富集的常規(guī)操作步驟，一般包括如下步驟:
[0064](a)將酶解肽段溶于抗體富集緩沖溶液，加入抗體，溫和轉(zhuǎn)動(dòng)孵育12h后，用富集緩沖溶液洗三次，12000g離心30s ；
[0065](b)將可識(shí)別抗體的特異性微珠加入到(a)溶液中，溫和轉(zhuǎn)動(dòng)孵育4_8h ；
[0066](c)離心lOOOg，小心移去上清，ImL用洗滌緩沖溶液洗滌微珠三次；
[0067](d)完全移去液體，加入150uL洗脫溶液，重復(fù)洗滌3次，收集所有上清，真空干燥。
[0068]需要特別說明的是，步驟(2)所述對SUMO化肽段進(jìn)行修飾的特異性抗體，經(jīng)兔血清免疫所得，其抗體特征在于，可分別特異性識(shí)別類泛素修飾SUM01，SUM02或者SUM03所對應(yīng)的特定氨基酸序列。
[0069]步驟(a)所述的富集緩沖溶液為pH值8.0的緩沖溶液，含氯化鈉，乙二胺四乙酸鈉、及少量表面活性劑。緩沖溶液推薦為Tris-HCl緩沖溶液。氯化鈉濃度為0.05-1M之間，乙二胺四乙酸濃度為5-100mM之間，表面活性劑可以為Bri j35，Triton-XlOO等，濃度在0.005-5% 之間。
[0070]步驟(b)所述的可識(shí)別抗體的特異性微珠推薦為商品化的proteinA微珠。
[0071]步驟(c)所述的洗滌緩沖溶液可為磷酸、Tris-HCl緩沖溶液或H印es-HCl緩沖溶液。
[0072]步驟(d)所述的洗脫緩沖溶液指酸性溶液，可為鹽酸、甲酸、乙酸、三氟乙酸溶液，濃度在0.1-5%之間。
[0073]本發(fā)明所用的液相色譜-質(zhì)譜連用儀器指納升液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，為本領(lǐng)域常規(guī)使用的檢測儀器，推薦使用液相色譜儀為Agilentl200，推薦使用質(zhì)譜為LTQ-Orbitrap。儀器參數(shù)根據(jù)儀器型號(hào)進(jìn)行設(shè)定。
[0074]本發(fā)明所用的數(shù)據(jù)分析軟件指Sequest、Moscot、Protein Discovery等商用蛋白質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析鑒定軟件。搜索參數(shù)根據(jù)液相色譜-質(zhì)譜連用儀器配置決定，均為本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)操作方法。
[0075]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:(I)本發(fā)明首次在蛋白質(zhì)類泛素化修飾位點(diǎn)的檢測和鑒定方法中通過特異性類泛素化抗體富集被修飾化的酶切肽段，隨后利用化學(xué)標(biāo)記對所富集肽段的游離氨基進(jìn)行保護(hù)，并經(jīng)去泛素化酶催化反應(yīng)以裸露出底物肽段序列上被修飾的賴氨酸，僅需2-3天即可完成整個(gè)流程，不需要繁瑣的基因突變技術(shù)手段即可快速、高效、準(zhǔn)確地得到蛋白質(zhì)類泛素化修飾位點(diǎn)信息。(2)可通過市售商品化搜索軟件對質(zhì)譜鑒定結(jié)果進(jìn)行分析，無需專門編寫SUMO化肽段質(zhì)譜分析程序，節(jié)約了開發(fā)軟件耗費(fèi)的大量人力物力財(cái)力。(3)方法穩(wěn)定可靠，重復(fù)性良好。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0076]圖1為類泛素化修飾位點(diǎn)鑒定方法流程示意圖。
[0077]圖2A 為 IPTG 誘導(dǎo)表達(dá) Rangap-His-SUMOISDS-PAGE 圖；圖 2B 為 Western Blot 證明目標(biāo)分子量區(qū)域，蛋白R(shí)angap-His-SUMOl被表達(dá)。
[0078]圖3為蛋白R(shí)angap-His-SUMOl表達(dá)純化色譜圖。
[0079]圖 4 為 SUMO 化修飾肽段 GFQANVFITSLLVQMGLL (ELGMEEEDVIEVYQEQTGG) KSEDK 的二級質(zhì)譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0080]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Samtoook等人，分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0081]實(shí)施例:Rangap-Hi s-SUMO I類泛素化修飾位點(diǎn)鑒定
[0082]1.目的蛋白純化
[0083](I)構(gòu)建含非洲爪蟾的RanGap片段與人源His-SUMOl共表達(dá)質(zhì)粒(以下簡稱Rangap-His-SUMOl)，25 μ I菌接種25ml LB培養(yǎng)基小搖，按1:100接種菌液至2 X YT培養(yǎng)基大搖，2L/菌，添加相應(yīng)抗生素，280rpm, 37°C，約2_3h后檢測菌液0D600，待菌液溫度稍降至室溫 20°C左右，加 IPTG 誘導(dǎo)，180rpm，25°C，12h。
[0084]收取IPTG誘導(dǎo)后的菌蛋白，也收取相等量的菌液20D，考染檢測蛋白是否被誘導(dǎo)表達(dá)。12%SDS-PAGE考染如圖2-A所示，在目標(biāo)分子量區(qū)域，有蛋白被表達(dá)，通過WesternBlot證明該條帶為Rangap-His-SUMOl如圖2-B所示。
[0085](2)加入裂解液，高壓破碎，至菌液不再粘稠，超速離心，20，OOOrpm, lh, 4°C。
[0086](3)采用蛋白純化儀對目標(biāo)蛋白進(jìn)行純化。色譜柱為鎳柱。A相為20mM咪唑，0.5M氯化鈉，20mM磷酸鈉；B相為200mM咪唑，0.5M氯化鈉，20mM磷酸鈉。流速為5mL/min，采用20分鐘梯度，20分鐘內(nèi)線性梯度從0-100%B，隨后10倍柱體積100%B，及10倍柱體積100%A沖洗色譜柱。
[0087]圖3為蛋白純化時(shí)色譜圖。
[0088]2.蛋白酶切
[0089](I) Iml蛋白溶液加入10 μ 10.5Μ還原試劑，室溫30min。
[0090](2)加入27 μ 10.55Μ烷基化試劑，避光室溫孵育30min。
[0091](3)取3-10mg蛋白，加入胰酶(1: 50胰酶/蛋白)，37°C消化過夜，99°C加熱5min，中止胰酶活性。12000g離心lOmin，棄沉淀留上清。
[0092](4)真空濃縮機(jī)濃縮干燥成粉末后，再加入ImL去離子水，反復(fù)重復(fù)此過程3-4次。
[0093](5)將所得肽段取適量進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜鑒定。液相采用固定相為MichiOmBioresources 公司 Magic C18AQ, 0.1 X 150mm,粒徑 3 μ m,孔徑IOOA H m ;A 相為 2% 乙腈，98%水，0.1%甲酸，B相為2%水，98%乙腈，0.1%甲酸。采用90分鐘梯度，90分鐘內(nèi)線性梯度從O - 35%B，8min內(nèi)維持80%B，12分鐘內(nèi)維持95%B，隨后20分鐘維持0%B。質(zhì)量分析器:LTQ/Orbit rap;掃描模式:正離子；離子源:Michrom公司Advance nonoESI噴霧;電壓:1.6kV ；管狀透鏡電壓:125V ;一級質(zhì)譜使用全質(zhì)量數(shù)掃描，m/z350-1800，R=IOOO, 000 (at m/z400)，使用m/z=445.120025作為實(shí)時(shí)內(nèi)標(biāo)；and ion accumulation to a target value of 106.二級質(zhì)譜通過數(shù)據(jù)依賴的掃描方式，分析一級質(zhì)譜圖中強(qiáng)度最高的十個(gè)母離子，動(dòng)態(tài)質(zhì)量排除時(shí)間27s ;碰撞誘導(dǎo)解離能量設(shè)置為35%。
[0094](6)將步驟(5)獲取的質(zhì)譜譜圖通過Sequest搜索算法對非洲爪蟾和人類蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫搜索引擎進(jìn)行比對，明確肽段序列、肽段修飾位點(diǎn)及其對應(yīng)蛋白。搜索參數(shù)為:MSl質(zhì)量精度±10ppm，MS2質(zhì)量精度IDa,可變修飾:0xidation (M)+15.99492，；肽段允許6個(gè)可變動(dòng)態(tài)修飾，每種修飾最多出現(xiàn)3次。
[0095]搜庫得到結(jié)果如表I所示,從表I中可知，目標(biāo)蛋白R(shí)angap-His-SUMOl被富集純化。
[0096]表1.非洲爪蟾和人類蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫搜索結(jié)果
[0097]
【權(quán)利要求】
1.一種蛋白質(zhì)類泛素化修飾位點(diǎn)鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)對純化的SUMO化蛋白進(jìn)行酶切； (2)特異性抗體對SUMO化修飾肽段富集； (3)化學(xué)標(biāo)記對所富集肽段中的非修飾化的賴氨酸氨基殘基進(jìn)行保護(hù)； (4)去泛素化酶催化反應(yīng)以裸露出底物肽段序列上被修飾的賴氨酸； (5)液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀分析肽段序列； (6)利用蛋白質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析軟件匹配得到被化學(xué)修飾的肽段序列，其序列中含游離氨基的賴氨酸位點(diǎn)即為類泛素化修飾位點(diǎn)； 所述SUMO化修飾包括SUMOl，SUM02和SUM03類泛素化修飾。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蛋白質(zhì)類泛素化修飾位點(diǎn)鑒定方法，其特征在于，步驟(2)所述抗體是指對SUMO化肽段進(jìn)行修飾的特異性抗體，經(jīng)兔血清免疫所得，可分別特異性識(shí)別類泛素修飾SUMOl，SUM02或者SUM03所對應(yīng)的特定氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蛋白質(zhì)類泛素化修飾位點(diǎn)鑒定方法，其特征在于，步驟(3 )所述化學(xué)標(biāo)記是指二烷基化修飾、乙?；揎椈蛘唠一揎椫械囊环N。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種蛋白質(zhì)類泛素化修飾位點(diǎn)鑒定方法，其特征在于，所述二烷基化修飾包括如下步驟:` Ca)將樣品溶于pH7.5緩沖溶液中，加入新鮮配置的醛類溶液中，混合均勻； (b)加入新鮮配置的還原試劑,混合均勻，反應(yīng)完畢后用終止溶液淬滅反應(yīng)； (c)用色譜預(yù)柱脫鹽。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種蛋白質(zhì)類泛素化修飾位點(diǎn)鑒定方法，其特征在于， 步驟(a)所述的醛類化學(xué)結(jié)構(gòu)式為R1CHO, R1為碘取代的C1~Cltl的烷基，濃度為0.01-1M 之間； 步驟(b)所述的還原試劑為硼氫化鈉、氰基硼氫化鈉或者硼烷中的一種，濃度為0.01-1M之間；反應(yīng)溫度0-60°C之間；反應(yīng)時(shí)間1-48小時(shí)；所述的終止溶液指酸性溶液，為鹽酸、甲酸、乙酸或者三氟乙酸溶液中的一種或幾種，濃度在0.1-5%之間； 步驟(c)所述色譜預(yù)柱為Ziptip脫鹽柱。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種蛋白質(zhì)類泛素化修飾位點(diǎn)鑒定方法，其特征在于，所述乙酰化修飾包括如下步驟: Ca)將樣品溶于pH 7.5緩沖溶液中，加入新鮮配置的N-乙酸基取代物溶液中，混合均勻； (b)加入新鮮配置的去酯化反應(yīng)溶液，混合均勻，用終止溶液淬滅反應(yīng)； (c)用色譜預(yù)柱脫鹽。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種蛋白質(zhì)類泛素化修飾位點(diǎn)鑒定方法，其特征在于， 步驟(a)所述的N-乙酸基取代物溶液為N-乙酸基乙酰氯、N-乙酸基乙酸、N-乙酸基琥珀酰亞胺或者N-乙酸基甘氨酸中的一種或幾種，濃度為0.01 -1M之間，反應(yīng)溫度25-60°C之間；反應(yīng)時(shí)間1-24小時(shí)； 步驟(b)所述的去酯化反應(yīng)溶液為鹽酸羥胺、硫酸羥胺、N，N- 二乙基羥胺、硝酸羥胺或者磷酸羥胺中的一種或幾種，濃度為0.01 -1M之間，所述終止溶液為谷氨酸、甘氨酸或者亮氨酸中的一種或幾種，濃度在1-1OOmM之間；步驟(C)所述色譜預(yù)柱為Ziptip脫鹽柱。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種蛋白質(zhì)類泛素化修飾位點(diǎn)鑒定方法，其特征在于，所述胍基化修飾包括如下步驟: (a)將樣品溶解于堿性緩沖溶液中，加入新鮮配置的鄰甲基異脲硫酸鹽溶液，啟動(dòng)化學(xué)反應(yīng); (b)加入酸性緩沖溶液，調(diào)pH值至酸性淬滅反應(yīng)； (c)用色譜預(yù)柱脫鹽。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種蛋白質(zhì)類泛素化修飾位點(diǎn)鑒定方法，其特征在于， 步驟(a)所述的堿性緩沖溶液為氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉或者氨水中的一種或幾種，濃度為1-10M之間；反應(yīng)溫度在-20-100°C之間，反應(yīng)時(shí)間1-24小時(shí)； 步驟(b)所述的酸性緩沖溶液為甲酸、乙酸、丁酸、醋酸或者三氟乙酸中的一種或幾種，濃度為0.01%-20%之間； 步驟(c)所述色譜預(yù)柱為Ziptip脫鹽柱。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蛋白質(zhì)類泛素化修飾位點(diǎn)鑒定方法，其特征在 于，步驟(4)所述去泛素化酶催化反應(yīng)包括如下步驟: Ca)將樣品重新溶于去泛素化酶及酶催化反應(yīng)緩沖溶液，混合均勻，37°C反應(yīng)； (b)色譜預(yù)柱脫鹽。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的一種蛋白質(zhì)類泛素化修飾位點(diǎn)鑒定方法，其特征在于， 步驟(a)所述去泛素化酶指SENP，包括SENPl，SENP2或者SENP3中的一種或幾種；所述酶催化反應(yīng)溶液為含有還原試劑和氯化鈉的磷酸、Tris-HCl或H印es-HCl緩沖溶液，所述還原試劑為二硫蘇糖醇或者β-巰基乙醇溶液，還原試劑濃度為0.001 -1M之間，氯化鈉濃度為0.05-1M之間； 步驟(b)所述色譜預(yù)柱為Ziptip脫鹽柱。
12.化學(xué)標(biāo)記在蛋白質(zhì)類泛素化修飾位點(diǎn)鑒定中的應(yīng)用。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的化學(xué)標(biāo)記在蛋白質(zhì)類泛素化修飾位點(diǎn)鑒定中的應(yīng)用，其特征在于，所述蛋白質(zhì)類泛素化修飾位點(diǎn)鑒定包括如下步驟: (1)對純化的SUMO化蛋白進(jìn)行酶切； (2)特異性抗體對SUMO化修飾肽段富集； (3)化學(xué)標(biāo)記對所富集肽段中的非修飾化的賴氨酸氨基殘基進(jìn)行保護(hù)； (4)去泛素化酶催化反應(yīng)以裸露出底物肽段序列上被修飾的賴氨酸； (5)液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀分析肽段序列； (6)利用蛋白質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析軟件匹配得到被化學(xué)修飾的肽段序列，其序列中含游離氨基的賴氨酸位點(diǎn)即為類泛素化修飾位點(diǎn)； 所述SUMO化修飾包括SUMO 1，SUM02和SUM03類泛素化修飾。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的化學(xué)標(biāo)記在蛋白質(zhì)類泛素化修飾位點(diǎn)鑒定中的應(yīng)用，其特征在于，所述化學(xué)標(biāo)記是指二烷基化修飾、乙酰化修飾或者胍基化修飾。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK103776909SQ201210398526
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2012年10月18日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月18日
【發(fā)明者】王立順, 汪彤丹, 余韻, 韓冰 申請人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院