專利名稱：用鱉或/和龜?shù)难逄崛〉奶蔷Y合物chb和制備工藝及其在制藥中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬生物技術領域，其產品可用于制造醫(yī)藥保健品類，具體說是涉及一種用生物技術將鱉或/和龜?shù)难逯刑崛√蔷Y合物CHB的制備工藝及該糖綴合物在制備治療和預防與免疫相關疾病、造血系統(tǒng)相關疾病、肝病和降低AFP及抗腫瘤藥物中的應用。
背景技術：
中華鱉(Trionyx Sinesis)俗稱甲魚，是我國的一種傳統(tǒng)動物中藥，據眾多古代醫(yī)書記載，甲魚具有“滋陰清熱，軟堅散結”的功效。用于“腎陰不足，肝風內動，消瘀腫，斂潰癰”等治療。鱉血得鱉的全身精華，其味甘微咸、其性平微溫。甘能補中益血入心脾，咸能滋陰填精養(yǎng)肝腎。所以古今文獻如《本草綱目》，《中藥大詞典》等多有記載，經過長期實踐認識到，“鱉血之性急縮走血”，在臨床上除了治療“虛勞骨蒸潮熱”，還用以治療“目瞬、唇動、口歪”等癥。清代名醫(yī)擅用鱉血，常用鱉血拌炒柴胡、拌炒青蒿用以治療陰虛發(fā)放、虛勞骨蒸潮熱。國內外對甲魚血有效成分的研究報道很少，國外曾報道從海龜(turtle)血中分離到一種性甾體結合蛋白(Sexsteroid-binding protein，SBP)，其含量為人血漿的4000倍，但其生理功能尚未闡明。國內曾報道從甲魚肉中分離到一種粗蛋白，稱具有促抗體生成，抗疲勞作用，但尚未見到有甲魚血的研究報道，而通常將甲魚血作為廢棄物處理。糖綴合物CHB是從鱉或/和龜?shù)难逯蟹蛛x、提取得到的一種多糖化合物。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種從鱉或/和龜?shù)难逯蟹蛛x、提取得到的一種糖綴合物CHB。
本發(fā)明的另一目的是提供上述糖綴合物CHB的制備工藝。
本發(fā)明的還有一個目的是提供上述糖綴合物CHB在制備藥物中的應用。
實際上，本發(fā)明涉及上述糖綴合物CHB在制備治療和預防與免疫相關疾病、肝病和降低AFP及抗腫瘤藥物中的應用。
還涉及上述糖綴合物CHB在制備治療和預防與造血系統(tǒng)相關疾病藥物中的應用。
本發(fā)明的目的可以通過以下措施來達到一、材料經預處理后的鱉或/和龜?shù)难濉?br>
二、分離提取1.分離將經預處理的鱉和/或龜?shù)难逵媚し蛛x一次，或對水透析12～36小時，以除去小分子物質，離心分離得上清液(I)；2.提取在上清液(I)中加入乙醇或丙酮，直至沉淀完全；3.再分離取出沉淀，用適量水溶解、離心分離后得上清液(II)；將上清液(II)再用膜分離一次或對水透析16～32小時，離心得上清液(III)；4.后處理將上清液(III)進行減壓濃縮、冷凍干燥，得糖綴合物；必要時可用乙醇或丙酮精制。
糖綴合物CHB的的理化性質一、性狀本品為白色或類白色粉末狀固體、無臭、易溶于水，水溶液pH為6.5～7.0。
二、化學組成1.中性糖含量為5～10％。
2.元素分析結果C在40.36～42.61％，H在6.8～7.18％，N在9.97％～13.29％。根據含N量計算，蛋白質含量在60～80％。
3.氨基酸分析結果糖綴合物CHB含18種氨基酸(色氨酸未測)，各種氨基酸的含量比例如下表
三、理化性質1.紫外光譜除了在遠紫外區(qū)有-OH等強烈吸收外，在275mm附近有明顯蛋白質吸收峰。
2.紅外光譜3392cm-1為-OH伸縮振動吸收，1658cm-1為酰氨鍵羰基特征峰，1200～1010cm-1處有三個吸收峰為糖環(huán)吸收。
3.高效液相色譜(HPLC)行為色譜柱為TSK-G2000SW，流動相為水，流速為1.0ml/min。在14.0min附近有一吸收峰，含量在80～90％。
4.分子量估測用上述TSK-G2000SW柱條件，糖綴合物CHB主峰的分子量分布約為2000～5000。
圖1為該糖綴合物CHB的紫外光譜。
圖2為該糖綴合物CHB的紅外光譜。
圖3為該糖綴合物CHB的高效液相色譜。
具體實施例方式
下面通過實施例、活性實驗例進一步闡明本發(fā)明所述的糖綴合物CHB的制備工藝、生理活性及其在制備治療與免疫相關疾病、造血液系統(tǒng)疾病、肝病及抗腫瘤藥物中的應用。
取經預處理后的鱉或/和龜?shù)难逖?00毫升，用截留分子量為500～1000道爾頓的鈉濾膜分離后，加入5倍體積的無水乙醇提取得沉淀，靜置過夜，取出沉淀，先用適量的水溶解，再用截留分子量500～1000道爾頓鈉濾膜分離。母液經離心后將上清液減壓濃縮、冷凍干燥得糖綴合物CHB980mg，得率1.97mg/mL。該糖綴合物中含性糖5.1％，含氮量為9.97％，含18種氨基酸(色氨酸未測)。
取經預處理后的鱉或/和龜?shù)难?00毫升，用截留分子量為500～1000道爾頓的透析膜對水透析48小時后，減壓濃縮，加入5倍體積的丙酮提取得沉淀。靜置過夜，取出沉淀，先用適用量的水溶解，再用上述透析膜對水透析48小時后，離心分離，將上清液減壓濃縮、冷凍干燥，得糖綴合物CHB1050mg，得率為2.1mg/mL。該糖綴合物中含中性糖5.2％，含氮量為13.29％，含18種氨基酸(色氨酸未測)。
生物之光口服液及糖綴合物CHB對小鼠免疫功能影響的比較性研究實驗材料1、生物之光口服液及糖綴合物CHB由常州寧康生物工程公司提供2、Balb/c小鼠購自上海第二醫(yī)科大學動物房3、羊紅細胞4、ConA購自Sigma公司；印度墨汁補體取自新鮮豚鼠血清實驗方法1、將按以下方案分組，每組7只(1)生理鹽水組5ml/kg(2)生物之光口服液組5ml/kg(3)糖綴合物CHBa1組51mg/kg(4)糖綴合物CHBa3組4.5mg/kg
(5)糖綴合物CHBb1組415mg/kg(6)糖綴合物CHBb3組10mg/kg(7)糖綴合物CHB1組4.2mg/kg(8)糖綴合物CHB3組1.5mg/kg注生物之光口服液為鱉或/和龜?shù)难河弥行缘鞍酌干锩附庖院蠹觿游锉薜木凭鲆号渲瞥傻目诜?；CHBa1為鱉或/和龜?shù)难河弥行缘鞍酌干锩附庖院蟮腃HB粗提取物；CHBa3為鱉或/和龜?shù)难河弥行缘鞍酌干锩附庖院蟮腃HB精提取物；CHBb1為鱉或/和龜?shù)难河弥行缘鞍酌干锩附庖院蠹觿游锉薜木凭鲆旱腃HB粗提取物；CHBb3為鱉或/和龜?shù)难河弥行缘鞍酌干锩附庖院蠹觿游锉薜木凭鲆旱腃HB精提取物；CHB1為鱉或/和龜?shù)难宓腃HB粗提取物；CHB3為鱉或/和龜?shù)难宓腃HB精提取物；連續(xù)15天胃飼小鼠，生物之光口服液及糖綴合物CHB的用量按小鼠重量計，由常州寧康生物工程公司提供。
2、小鼠脾臟細胞制備將小鼠處死，75％酒精浸泡，無菌獲取脾臟。將脾臟置100目網上輕輕碾碎，濾過入試管。1000r/min，5min洗滌細胞，棄上清。用1640培養(yǎng)液還原細胞至4ml，輕輕鋪于3ml小鼠淋巴細胞分離液(比重1.088)上，離心2000r/min，20min。吸取單個核淋巴細胞(PBL)，1000r/min，5min洗滌2遍。計數(shù)細胞，用10％FCS的1640調整PBL濃度為5×106/ml待用。
3、小鼠T淋巴細胞增殖實驗(3H-TdR摻入試驗)采用常規(guī)3H-TdR摻入試驗。小鼠脾細胞懸液(5×106/ml)，加入96孔圓底細胞培養(yǎng)板內，100μl/孔，5×105/ml細胞/孔。分別加入ConA10μg/孔，對照組以1640營養(yǎng)液補足體積至200μl。置37℃5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72小時。終止試驗前16小時加入3H-TdRluCi/孔。用細胞收集儀將細胞吸附在玻璃纖維濾紙上，β閃爍儀測得cpm值并計算刺激指數(shù)SI。
4、小鼠碳粒廓清試驗小鼠稱重，按每20g體重尾靜脈注射1∶2稀釋的印度墨汁0.1ml，注入后立即計時。分別于第5和第10分鐘用抗凝過的平口毛細管從小鼠眼眶內側靜脈叢取血0.025ml，0.1％碳酸鈉溶液2ml中，于650nm波長處測吸光度(OD)值。用碳酸鈉溶液校正零點。用頸椎移位法殺死小鼠，取肝、脾稱重。
以公式K=logOD1-logOD2T2-T1]]>求出K值。
按α=K3WWL.S]]>校正K值，求出α值。
5、血清溶血素含量的測定胃飼10天后，每只小鼠腹腔內注射2％綿羊紅細胞0.2ml，并繼續(xù)胃飼至15天；取小鼠眼眶血，離心后收集血清。取血清稀釋64倍后，加入96孔圓底板中，并依次加入2％SRBC，1∶10稀釋的新鮮豚鼠補體，并設不加血清和不加補體的空白對照管，37℃水浴45min后，測定541nm的光密度值；SRBC半數(shù)溶血時的光密度值為1ml2％SRBC溶于7ml蒸餾水后的光密度值。
實驗結果1、小鼠T淋巴細胞增殖實驗(3H-TdR摻入試驗)表1淋巴細胞增殖轉化試驗
注P值均為實驗組生理鹽水組結論淋巴細胞增殖實驗是檢測淋巴細胞功能的方法之一。本實驗采用ConA(刀豆蛋白A)作為小鼠T淋巴細胞的有絲分裂劑。結果顯示，小鼠T細胞在服用糖綴合物CHB后，大部分被激活，表明糖綴合物CHB對于小鼠的T細胞功能具有上調作用。
2、小鼠碳粒廓清試驗表2小鼠體重、肝、脾重量
表3各組α值結果
注P值均為實驗組生理鹽水組結論吞噬細胞的功能之一是對外源性物質具有吞噬和清除能力。本實驗采用經典的炭粒廓清實驗，分析比較了生物之光口服液及糖綴合物CHB對正常小鼠吞噬細胞的功能的影響。結果表明，所有實驗組的α值均大于正常對照組，經團體T檢驗后，只有CHB3組具有統(tǒng)計學的差異，表明CHB3組小鼠的吞噬細胞的吞噬能力和正常組之間有統(tǒng)計學上的差異。
3、血清溶血素含量的測定表4
注P值均為實驗組生理鹽水組結論血清溶血素部分代表了小鼠的體液免疫功能，本實驗結果顯示，各實驗組的溶血素均大于正常對照組，且在統(tǒng)計學上均有意義，表明口服這些制劑后，小鼠的體液免疫功能具有明顯提高，其中又以糖綴合物CHB系列組的作用更為明顯。
上述三項試驗結果表明生物之光口服液組及糖綴合物CHB組對上述三種小鼠免疫功能均有上調作用，表明該制劑對正常小鼠具有正向調節(jié)作用，其中CHB1和CHB3對小鼠的吞噬功能和體液免疫功能上調作用很明顯。表明糖綴合物CHB可用于制備治療和預防免疫性疾病的藥物。
生物之光口服液及糖綴合物CHB對小鼠細胞誘生主要細胞因子影響的比較性研究實驗材料1、生物之光口服液及糖綴合物CHB由常州寧康生物工程公司提供2、Balb/c小鼠購自上海第二醫(yī)科大學動物房3、小鼠T細胞表面標志單克隆抗體購自北京醫(yī)科大學免疫室4、ConA購自Sigma公司；5、小鼠細胞因子檢測試劑盒購自上海森雄公司進口分裝。
實驗方法1、將Balb/c小鼠按以下方案分組，每組10只(1)生理鹽水組(2)環(huán)磷酰胺組(3)環(huán)磷酰胺組+生物之光口服液低、高劑量組(4)環(huán)磷酰胺組+糖綴合物CHB低、中、高劑量組連續(xù)15天胃飼小鼠，生物之光口服液及糖綴合物CHB的用量按小鼠重量計，由常州寧康生物工程公司提供。
2、小鼠脾臟細胞制備將小鼠處死，75％酒精浸泡，無菌獲取脾臟。將脾臟置100目網上輕輕碾碎，濾過入試管。1000r/min，5min洗滌細胞，棄上清。用1640培養(yǎng)液還原細胞至4ml，輕輕鋪于3ml小鼠淋巴細胞分離液(比重1.088)上，離心2000r/min，20min。吸取單個核淋巴細胞(PBL)，1000r/min，5min洗滌2遍。計數(shù)細胞，用10％FCS的1640調整PBL濃度為5×106/ml待用。
3、小鼠T淋巴細胞增殖實驗(3H-TdR摻入試驗)采用常規(guī)3H-TdR摻入試驗。小鼠脾細胞懸液(5×106/ml)，加入96孔圓底細胞培養(yǎng)板內，100μl/孔，5×105/ml細胞/孔。分別加入ConA10μg/孔，對照組以1640營養(yǎng)液補足體積至200μl。置37℃5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72小時。終止試驗前16小時加入3H-TdRluCi/孔。用細胞收集儀將細胞吸附在玻璃纖維濾紙上，β閃爍儀測得cpm值并計算刺激指數(shù)SI。
4、小鼠T細胞表面標志檢測采用常規(guī)間接免疫熒光方法及流式細胞儀分析。用抗小鼠L3T4(CD4)和Lyt2(CD8)檢測小鼠T細胞的表面標志。
5、小鼠NK殺傷功能檢測(LDH釋放法)小鼠脾細胞懸液(5×106/ml)加入96孔細胞培養(yǎng)板內，100μl/孔。體外傳代培養(yǎng)的YAC-1靶細胞離心，調整細胞濃度1×105/ml。100μl/孔，1×104/孔細胞。置37℃5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4小時，并設自然釋放和最大釋放組作為實驗的陰陽性對照。離心1000r/min，5min。吸取上清100μl，加入LDH底物液100μl，靜置3分鐘顯色。隨后加入1NHCL中止。490nm讀取OD值。計算NK細胞的殺傷百分率。
6、小鼠細胞因子的檢測小鼠眼球取血，室溫放置，離心獲得小鼠血清；收集脾臟細胞經過刺激后的細胞培養(yǎng)上清，按照細胞因子檢測試劑盒操作說明分別測定不同的細胞因子。
實驗結果1小鼠T細胞表面標志檢測表5生物之光口服液及糖綴合物CHB對小鼠T細胞亞群的影響
結論
(1)環(huán)磷酰胺組的T細胞亞群數(shù)量明顯降低，CD4和CD8陽性細胞分別為對照組的55.3％和42.1％，P值＜0.05，表明環(huán)磷酰胺已造成小鼠T細胞亞群數(shù)量減少，實驗系統(tǒng)成立。
(2)生物之光口服液和糖綴合物CHB對免疫功能低下小鼠T細胞亞群數(shù)量均具有上調作用，而且不同劑量的提取物的作用呈現(xiàn)一定的劑量關系，其中高劑量與環(huán)磷酰胺組經過統(tǒng)計學分析，P值＜0.05。
2淋巴細胞增殖轉化實驗表6生物之光口服液及糖綴合物CHB對小鼠淋巴細胞轉化功能的影響
結論環(huán)磷酰胺組和正常對照組相比，P值＜0.01；生物之光口服液及糖綴合物CHB作用后的小鼠淋巴細胞轉化功能較環(huán)磷酰胺組的小鼠功能有明顯上升，特別是糖綴合物CHB的中、高劑量和生物之光口服液的高劑量組的SI指數(shù)均高于正常對照組，作用明顯，有顯著差異。
3小鼠NK細胞殺傷功能檢測表7生物之光口服液及糖綴合物CHB對小鼠NK細胞殺傷功能的影響
結論(1)環(huán)磷酰胺組NK的殺傷活性相當于正常對照組的51.5％，表明本實驗系統(tǒng)中已成功建立了免疫功能低下的小鼠模型，可進一步用于檢測不同中藥制劑對其的免疫調節(jié)作用。
(2)糖綴合物CHB不同劑量的NK殺傷活性為環(huán)磷酰胺組的1.52倍、1.54倍和2.8倍，表明糖綴合物CHB對CTX免疫抑制效應具有拮抗作用；與正常對對照組相比，低劑量和中劑量組的NK殺傷活性為78.5％和79.1％，并未達到正常值，而高劑量組則為正常對照組的1.44倍，顯示糖綴合物CHB的不同劑量對免疫功能低下小鼠的正向免調節(jié)功能存在一定的劑量依賴性，與環(huán)磷酰胺組相比較，高劑量組的結果P值＜0.05，有顯著差異。
(3)生物之光口服液和糖綴合物CHB對免疫功能低下小鼠的免疫調節(jié)功能的正向調節(jié)作用。
4、小鼠細胞因子的檢測表8生物之光口服液和糖綴合物CHB對小鼠細胞因子產生的影響
結論(1)IL-4和INF-γ測定結果顯示，生物之光口服液和糖綴合物CHB組中INF-γ的分泌量較環(huán)磷酰胺組有明顯升高，經過統(tǒng)計學分析，其P值＜0.01，有顯著差異；而IL-4的分泌量很低，在糖綴合物CHB的低劑量和中劑量組中幾乎為零，表明生物之光口服液和糖綴合物CHB的免疫上調作用主要作用于CD4+Th1細胞，并增進免疫功能低下小鼠的細胞免疫功能；兩者對小鼠INF-γ的分泌呈現(xiàn)劑量依賴性。
(2)IL-6的測定結果提示胃飼小鼠組的分泌量除糖綴合物CHB的低劑量組外，其余均升高，對環(huán)磷酰胺作用后的小鼠具有正向免疫調節(jié)作用；(3)TNF-α在血清中的含量很低，經統(tǒng)計學分析，無顯著差異，但檢測結果表明生物之光口服液和糖綴合物CHB對其分泌仍有一定的促進作用。
糖綴合物CHB對化療藥致小鼠骨髓抑制的保護作用實驗觀察骨髓抑制是化療常見副作用之一。本實驗通過腹腔注射環(huán)磷酰胺制成的小鼠骨髓抑制模型，觀察了糖綴合物CHB對化療藥致小鼠骨髓抑制的保護作用。24只雄性昆明小鼠，體重25～30克，隨機分為四組，每組6只。A組每日腹腔注射生理鹽水1ml，B組每日服用糖綴合物CHB，C組每日腹腔注射環(huán)磷酰胺0.15mg/g，D組腹腔注射環(huán)磷酰胺同時服用糖綴合物CHB。三天后所有小鼠均處死，處死前取尾靜脈血涂片，觀察粒細胞與淋巴細胞的比例(G/L)，處死后取股骨和肝臟作病理檢查，觀察骨髓象中粒系比例G/E。結果C組G/E(0.18±0.03)和D組G/E(0.28±0.02)與A組G/E(0.41±0.03)相比差異顯著(p＜0.05)，B組與A組G/E相比無顯著差異。對各組G/L值的統(tǒng)計分析結果與G/E相同。各組動物的肝臟病理檢查均無明顯異常。
結論糖綴合物CHB對環(huán)磷酰胺造成的小鼠骨髓抑制有顯著的保護作用，但不影響正常骨髓的造血功能，服用此品未引起肝臟組織形態(tài)發(fā)生病理變化。表明糖綴合物CHB可用于制備治療和預防血液系統(tǒng)疾病的藥物和支持腫瘤放化療的藥物。
權利要求
1.一種從鱉和/或龜?shù)难逯刑崛〉奶蔷Y合物，其特征是含有重量比為5～10％的中性多糖，60～80％的蛋白質，其余為糖脂。
2.根據權利要求1所述的糖綴合物，其特征在于該糖綴合物a.為白色或類白色粉末狀固體，無臭、易溶于水，水溶液pH為6.5～7.0；b.元素分析結果為C在40.36％～42.61％，H在6.8％～7.18％，N在9.97％～13.29％；c.紫外光譜除了在遠紫外區(qū)有-OH強烈吸收外，在275mm附近有明顯蛋白質吸收峰；d.紅外光譜3392cm-1為-OH伸縮振動吸收，1658cm-1為酰氨鍵羰基特征峰，1200～1010cm-1處有三個吸收峰為糖環(huán)吸收；e.用色譜柱為TSK-G2000SW，流動相為水，流速為1.0ml/min的高效液相色譜測定在14.0min附近有一吸收峰，含量在80～90％；f.在上述TSK-G2000SW柱條件下該糖綴合物主峰的分子量分布約為2000～5000。
3.一種從鱉和/或龜?shù)难逯刑崛√蔷Y合物的制備工藝，其特征在于依次包括下列步驟a.分離將經預處理的鱉和/或龜?shù)难逵媚し蛛x一次，或對水透析12～36小時，以除去小分子物質，離心分離得上清液(I)；b.提取在上清液(I)中加入乙醇或丙酮，直至沉淀完全；c.再分離取出沉淀，用適量水溶解、離心分離后得上清液(II)；將上清液(II)再用膜分離一次或對水透析16～32小時，離心得上清液(III)；d.后處理將上清液(III)進行減壓濃縮、冷凍干燥，得糖綴合物；必要時可用乙醇或丙酮精制。
4.根據權利要求3所述的制備工藝，其特征在于分離所用的膜其截留分子量為500～1000的鈉濾膜。
5.一種從鱉和/或龜?shù)难逯刑崛〉奶蔷Y合物在制備治療或預防與免疫相關疾病的藥物中的應用。
6.一種從鱉和/或龜?shù)难逯刑崛〉奶蔷Y合物在制備治療或預防與造血系統(tǒng)相關疾病的藥物中的應用。
7.一種從鱉和/或龜?shù)难逯刑崛〉奶蔷Y合物在制備治療肝病和降低AFP藥物中的應用。
8.一種從鱉和/或龜?shù)难逯刑崛〉奶蔷Y合物在制備治療腫瘤疾病藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從鱉或/和龜血清中提取的糖綴合物(CHB)、制備工藝及該糖綴合物在制備治療或預防免疫性疾病、造血系統(tǒng)疾病、肝病及抗腫瘤的藥物中的應用，該綴合物中蛋白質含量為60％～80％，制備工藝包括分離、沉淀、再分離、提取等步驟，本發(fā)明提供的糖綴合物具有較強的免疫活性作用和調節(jié)造血功能，可用于制備治療或預防與免疫相關疾病、與造血系統(tǒng)相關疾病和肝病及抗腫瘤的藥物，本發(fā)明提供的制備工藝簡單易操作。
文檔編號A61P1/00GK1566151SQ0313181
公開日2005年1月19日 申請日期2003年6月9日 優(yōu)先權日2003年6月9日
發(fā)明者吳志大 申請人:吳志大