一種黃緣盒龜唾液及口腔上皮中提取dna的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種黃緣盒龜唾液及口腔上皮中提取DNA的方法，屬于DNA分離純化技術(shù)領(lǐng)域。用口拭子插入黃緣盒龜?shù)目谇唬诳谇簧舷虏縼砘夭潦煤蠓湃胙b有PBS溶液中，震蕩；加入裂解液，混勻后水??；離心，沉淀加碘化鉀溶液，漩渦，再分別加入NaCl和酚/氯仿溶液，震蕩，離心；取上清液，加入與上清同樣體積的異丙醇，渦旋震蕩離心；棄上清液，在沉淀中加入70%乙醇洗滌，離心；沉淀室溫晾干，當沉淀塊變透明時，加入TE緩沖液溶解。將發(fā)明應(yīng)用于黃緣盒龜DNA提取，具有操作便捷、黃緣盒龜損傷小等優(yōu)點。
【專利說明】
一種黃緣盒龜唾液及口腔上皮中提取DNA的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[00011本發(fā)明涉及一種黃緣盒龜唾液及口腔上皮中提取DNA的方法，屬于DNA分離純化技 術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃緣盒龜（Cistoclemmys flavomarginata,Yellow-margined Box Turtle)隸屬 于龜鱉目（Testudinata)、淡水龜科(Geoemydidae)、盒龜屬（Cistoclemmys)。因其背甲緣盾 腹部黃色，眼眶上有一條金黃色條紋，故得名。黃緣盒龜在我國主要分布于浙江、安徽、福 建、江蘇、河南、廣西、廣東、臺灣等地，鄰國日本也有分布。我省主要分布在臨安、建德、安 吉、龍游、天臺、新昌等地。由于黃緣盒龜為龜中珍品，是高級的滋補品，其藥用價值較高，還 具有較大的觀賞價值。近年來，由于人為過渡捕捉，野生黃緣盒龜資源及其棲息地受到嚴重 破壞，野生數(shù)量急劇減少。1998年該種群已被列入國家珍稀瀕危動物，2006年被聯(lián)合國列為 瀕危級動物種群（IUCN，2006)。除人為因素以外，由于野生黃緣盒龜生長緩慢，加之，全球氣 候變暖以及惡劣反常天氣的頻繁出現(xiàn)，使其交配環(huán)境、孵化條件等與最適條件有了不小的 差距，所以性成熟后產(chǎn)卵量極少，受精率、孵化率及成活率均極低，并且對其性別分化等也 產(chǎn)生了較大影響，導致野生種群瀕臨滅絕。
[0003] 目前，對我省野生黃緣盒龜?shù)姆N質(zhì)資源調(diào)查，以及與臨近省份野生種群親緣關(guān)系 分析鑒定尚未有效開展，對黃緣盒龜擬生態(tài)馴養(yǎng)繁殖開展尚處于探索階段。我省已有幾家 養(yǎng)殖企業(yè)開始試探性養(yǎng)殖黃緣盒龜，但由于黃緣盒龜生長周期長，純系和雜交龜在稚龜期 差異較小，養(yǎng)殖6-8年后珍品黃緣盒龜性狀才能顯現(xiàn)，從而產(chǎn)生了較大的養(yǎng)殖風險。傳統(tǒng)用 于DNA提取的樣本主要來源于血液或組織塊，但是對于野生瀕危動物，取血和獲取組織塊都 對動物本身具有傷害并有可能帶來疾病感染，對其生存具有一定的隱患。
[0004] 基于此，做出本申請。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服現(xiàn)有黃緣盒龜鑒定所存在的上述缺陷，本申請?zhí)峁┮环N簡便易行、采集 方便、無創(chuàng)傷的黃緣盒龜唾液及口腔上皮中提取DNA的方法。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本申請采取的技術(shù)方案如下：
[0007] -種黃緣盒龜唾液及口腔上皮中提取DNA的方法，包括如下步驟：（1)用口拭子插 入黃緣盒龜?shù)目谇?，在口腔上下部來回擦拭后放入裝有500yL的0.01m 〇l/L PBS溶液中，用 渦旋振蕩器震蕩2min，取出口拭子；（2)加入lmL二硫蘇糖醇(DTT)裂解液，混勻后水?。唬?) 離心，沉淀加碘化鉀溶液，漩渦，再分別加入NaCl和酚/氯仿溶液，震蕩，離心；（4)取上清液， 加入與上清同樣體積的異丙醇，渦旋震蕩離心；（5)棄上清液，吸去沉淀中的多余液體，在沉 淀中加入70%乙醇洗滌2次，離心；（6)沉淀室溫晾干，當沉淀塊變透明時，加入TE緩沖液溶 解。
[0008] 進一步的，作為優(yōu)選：
[0009]步驟(2)中，裂解液構(gòu)成為：100mmol/L Tris-HCl，pH8，1.4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA,0.4mol/L DTT〇
[0010] 步驟⑵中，水浴溫度為40~60°C冰浴時間1-4小時。
[0011] 步驟(3)中，碘化鉀溶液的濃度為3-5mol/L。
[0012] 步驟(3)中，NaCl溶液質(zhì)量濃度為0.5-1.5% ;酚/氯仿溶液中，酚:氯仿=25:24(體 積比）;NaCl與酚/氯仿溶液添加體積比為1:1-2。
[0013] 通過本申請技術(shù)方案的實施，通過收集評價野生黃緣盒龜種質(zhì)資源，采用"唾液" 取樣方式，這種方式可在不傷害甚至不必見到動物的情況下，利用這些樣品提取動物DNA并 進行PCR擴增，再利用mtDNA，PCR等遺傳學、分子生物學技術(shù)，建立黃緣盒龜種質(zhì)分子鑒定分 析方法，實現(xiàn)在不影響野生種群分布的前提下探明黃緣盒龜野生資源現(xiàn)狀，所建立的黃緣 盒龜種質(zhì)分子鑒定方法，有利于探明野生黃緣盒龜種質(zhì)資源，并通過對野生黃緣盒龜?shù)纳?活、交配、繁育等條件調(diào)查，構(gòu)建黃緣盒龜擬生態(tài)馴養(yǎng)繁殖體系，從而進行生物個體遺傳信 息的分析;最終有效的保護這一瀕危物種，為保護物種多樣性，也為中醫(yī)藥自然資源的可持 續(xù)利用提供途徑。
【附圖說明】
[0014] 圖1為本申請的瓊脂糖核酸電泳檢測譜圖。
【具體實施方式】
[0015] 實施例1
[0016] 取O.lmL黃緣盒龜唾液置于1.5mL離心管中，加0.01mol/L PBS溶液500yL，反復吹 打幾下，加入裂解液（100mmol/L Tris_HCl，pH = 8，1.4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA， 0.4mol/L DTT)，混勻后40°C水浴4小時；12000g離心5min;沉淀加50yL 3mol/L的碘化鉀溶 液，漩渦308，再加10(^1^0.5%似(：1和10(^1^酚/氯仿溶液（酚：氯仿=25:24)，震蕩30 8， 12000g離心5min;取上清，加入與上清等體積的異丙醇，混勾，12000g離心5min;沉淀加入 500yL無水乙醇洗滌，12000g離心5min。沉淀室溫晾干，用TE緩沖液溶解。
[0017] 實施例2
[0018] 取O.lmL黃緣盒龜唾液置于1.5mL離心管中，加0.01mol/L PBS溶液500yL，反復吹 打幾下，加入裂解液（100mmol/L Tris_HCl，pH = 8，1.4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA， 0.4mol/L DTT)，混勻后45°C水浴3小時；12000g離心5min;沉淀加50yL 4mol/L的碘化鉀溶 液，漩渦308，再加10(^1^1.2%似(：1和12(^1^酚/氯仿溶液（酚：氯仿=25:24)，震蕩30 8， 12000g離心5min;取上清，加入與上清等體積的異丙醇，混勾，12000g離心5min;沉淀加入 500yL無水乙醇洗滌，12000g離心5min。沉淀室溫晾干，用TE緩沖液溶解。
[0019] 實施例3
[0020] 取O.lmL黃緣盒龜唾液置于1.5mL離心管中，加0.01mol/L PBS溶液500yL，反復吹 打幾下，加入裂解液（100mmol/L Tris_HCl，pH = 8，1.4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA， 0.4mol/L DTT)，混勻后55°C水浴2小時；12000g離心5min;沉淀加50yL 5mol/L的碘化鉀溶 液，漩渦308，再加10(^1^0.9%似(：1和15(^1^酚/氯仿溶液（酚：氯仿=25:24)，震蕩30 8， 12000g離心5min;取上清，加入與上清等體積的異丙醇，混勾，12000g離心5min;沉淀加入 500yL無水乙醇洗滌，12000g離心5min。沉淀室溫晾干，用TE緩沖液溶解。
[0021] 實施例4
[0022] 取O.lmL黃緣盒龜唾液置于1.5mL離心管中，加0.01mol/L PBS溶液500yL，反復吹 打幾下，加入裂解液（100mmol/L Tris_HCl，pH = 8，1.4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA， 0.4mol/L DTT)，混勻后60°C水浴1小時；12000g離心5min;沉淀加50yL 5mol/L的碘化鉀溶 液，漩渦308，再加10(^1^1.5%似(：1和20(^1^酚/氯仿溶液（酚：氯仿=25:24)，震蕩30 8， 12000g離心5min;取上清，加入與上清等體積的異丙醇，混勾，12000g離心5min;沉淀加入 500yL無水乙醇洗滌，12000g離心5min。沉淀室溫晾干，用TE緩沖液溶解。
[0023]將上述實施例的溶解液進行如下處理：
[0024] (a)PCR引物設(shè)計
[0025] 表1黃緣盒龜線粒體基因組全序列擴增引物
[0026]
[0027] (b)PCR 擴增
[0028] PCR擴增使用東洋紡(上海)生物技術(shù)有限公司的高保真酶K0D FX。
[0029] 表2 PCR反應(yīng)組分
[0030]
[0031] 表3 PCR反應(yīng)程序
[0032]
[0033] 對線粒體基因 PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳檢測，并用凝膠回收試劑盒（DNA GelExtractionKit，Takara)進行目的片斷的回收;對微衛(wèi)星PCR產(chǎn)物進行聚丙稀酰胺電泳 檢測；用純化試劑盒(￡.2.1'1.4〇7〇16?11代1(;[1:，0111683)進行純化回收?；厥蘸蟮漠a(chǎn)物進行測 序，該序列可用于在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對分析，即完成整個DNA的提取和檢測應(yīng)用。
[0034]電泳檢測：1 %瓊脂糖電泳，結(jié)合圖1，可以看到DNA條帶明顯，DNA采集純度較高。
[0035] 通過本申請技術(shù)方案的實施，通過收集評價野生黃緣盒龜種質(zhì)資源，采用"唾液" 取樣方式，這種方式可在不傷害甚至不必見到動物的情況下，利用這些樣品提取動物DNA并 進行PCR擴增，再利用mtDNA，PCR等遺傳學、分子生物學技術(shù)，建立黃緣盒龜種質(zhì)分子鑒定分 析方法，實現(xiàn)在不影響野生種群分布的前提下探明黃緣盒龜野生資源現(xiàn)狀，所建立的黃緣 盒龜種質(zhì)分子鑒定方法，有利于探明野生黃緣盒龜種質(zhì)資源，并通過對野生黃緣盒龜?shù)纳?活、交配、繁育等條件調(diào)查，構(gòu)建黃緣盒龜擬生態(tài)馴養(yǎng)繁殖體系，從而進行生物個體遺傳信 息的分析;最終有效的保護這一瀕危物種，為保護物種多樣性，也為中醫(yī)藥自然資源的可持 續(xù)利用提供途徑。
[0036] 以上內(nèi)容是結(jié)合本發(fā)明創(chuàng)造的優(yōu)選實施方式對所提供技術(shù)方案所作的進一步詳 細說明，不能認定本發(fā)明創(chuàng)造具體實施只局限于上述這些說明，對于本發(fā)明創(chuàng)造所屬技術(shù) 領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演 或替換，都應(yīng)當視為屬于本發(fā)明創(chuàng)造的保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種黃緣盒龜唾液及口腔上皮中提取DNA的方法，其特征在于，包括如下步驟： (1)用口拭子插入黃緣盒龜?shù)目谇?，在口腔上下部來回擦拭后放入裝有500 yL的O. Ol mol /LPBS溶液中，用渦旋振蕩器震蕩2min，取出口拭子； (2 )加入ImL裂解液，混勻后水??； (3) 離心，沉淀加碘化鉀溶液，漩渦，再分別加入NaCl和酚/氯仿溶液，震蕩，離心； (4) 取上清液，加入與上清同樣體積的異丙醇，渦旋震蕩離心； (5 )棄上清液，在沉淀中加入70%乙醇洗滌2次，離心； (6)沉淀室溫晾干，當沉淀塊變透明時，加入TE緩沖液溶解。2. 如權(quán)利要求1所述的一種黃緣盒龜唾液及口腔上皮中提取DNA的方法，其特征在于： 步驟（2)中，裂解液構(gòu)成為：100 mmol/LTris-HCl，pH=8，1.4 mol/LNaCl，20mmol/LEDTA， 0.4 mol/L DTT03. 如權(quán)利要求1所述的一種黃緣盒龜唾液及口腔上皮中提取DNA的方法，其特征在于： 步驟(2)中，水浴溫度為40~60°C，水浴時間1-4小時。4. 如權(quán)利要求1所述的一種黃緣盒龜唾液及口腔上皮中提取DNA的方法，其特征在于： 步驟(3 )中，碘化鉀溶液的濃度為3-5mo I /L。5. 如權(quán)利要求1所述的一種黃緣盒龜唾液及口腔上皮中提取DNA的方法，其特征在于： 步驟(3)中，NaCl溶液質(zhì)量濃度為0.5-1.5%;酚/氯仿溶液中，酚:氯仿=25:24(體積比）;NaCl 與酚/氯仿溶液添加體積比為1:1-2。
【文檔編號】C12N15/10GK105907750SQ201610431671
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年6月17日
【發(fā)明人】壽建昕
【申請人】紹興文理學院元培學院