一種無(wú)需解剖可判斷中華鱉胚胎發(fā)育時(shí)相的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于溫度決定型性別決定動(dòng)物性別分化和性別調(diào)控領(lǐng)域，特別是涉及一種 無(wú)需解剖可判斷中華鱉胚胎發(fā)育時(shí)相的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 中華鱉(Trionyx sinensis)隸屬爬行綱(Reptilia)、龜鱉目（Testudinata)、鱉科 (Trionychidae)、鱉屬(Pelodiscus)，是我國(guó)名貴的食用水產(chǎn)動(dòng)物，其營(yíng)養(yǎng)豐富，可以入藥， 在國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上十分暢銷(xiāo)。中華鱉屬于溫度性別決定型動(dòng)物，它的性別取決于孵化過(guò)程中 某一特定時(shí)期(溫度敏感期）的孵化溫度，在此期間高溫孵化會(huì)產(chǎn)生較多雄性鱉苗，反之產(chǎn) 生較多雌性鱉苗。由于雄性中華鱉生長(zhǎng)速度快于雌鱉，食用價(jià)值也高于雌鱉，因此，中華鱉 的定性育種技術(shù)備受關(guān)注。
[0003] 由于溫度性別決定型動(dòng)物的性別是在其胚胎發(fā)育的溫度敏感期(龜多數(shù)在15~17 期）內(nèi)由溫度決定的，因此，其胚胎發(fā)育時(shí)相的準(zhǔn)確劃分(特別是14時(shí)相以后)對(duì)于其性別調(diào) 控非常重要。胚胎發(fā)育時(shí)相的劃分方法通常是通過(guò)定期解剖在解剖鏡下觀(guān)察來(lái)確定的。
[0004] 國(guó)際上普遍米用Yntema([l]Yntema C.A series of stages in the embryonic development of Chelydra serpentine[J].Journal of Morphology,1968,125:219-251) 的分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行龜胚胎發(fā)育時(shí)相的劃分，關(guān)于中華鱉胚胎發(fā)育時(shí)相的劃分國(guó)內(nèi)外至今沒(méi)有 一個(gè)系統(tǒng)報(bào)道。
[0005] 國(guó)內(nèi)外關(guān)于中華鱉已有一些報(bào)道，主要涉及提高中華鱉產(chǎn)卵量及長(zhǎng)卵質(zhì)量的養(yǎng)殖 方法（中國(guó)專(zhuān)利CN 103918605)、純種繁育方法（中國(guó)專(zhuān)利CN 103843722A)和性別控制方法 (中國(guó)專(zhuān)利CN 102988986A、CN 102487883A、CN 102934623A)。目前未見(jiàn)到通過(guò)外觀(guān)判斷龜 鱉胚胎發(fā)育時(shí)相的文獻(xiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種無(wú)需解剖可判斷中華鱉胚胎發(fā)育時(shí)相的方法。
[0007] 本發(fā)明包括以下步驟：
[0008] 1)在中華鱉孵化季節(jié)，采集中華鱉受精卵進(jìn)行裸孵；
[0009 ] 2)在整個(gè)裸孵過(guò)程中觀(guān)察受精斑的變化情況，通過(guò)光照觀(guān)察血絲的變化情況并拍 照記錄。孵化第一周時(shí)相變化很快且胚胎太小無(wú)法對(duì)其肉眼觀(guān)察進(jìn)行準(zhǔn)確判斷，因而，孵化 第一周并未進(jìn)行胚胎解剖觀(guān)察，從孵化第8天開(kāi)始每天取4~6枚受精卵觀(guān)察外觀(guān)隨后解剖， 在立體顯微鏡下觀(guān)察胚胎發(fā)育情況，進(jìn)行文字描述并拍照記錄，參考Yntema [1]描述的龜胚 胎發(fā)育時(shí)相的劃分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)中華鱉的胚胎發(fā)育時(shí)相進(jìn)行劃分。
[0010]在步驟1)中，所述裸孵可采用孵化裝置進(jìn)行裸孵，所述孵化裝置設(shè)有離心管和解 剖盤(pán)，受精卵的動(dòng)物極向上平放在離心管架上，受精卵間距保持在1~1.5cm，離心管架置于 解剖盤(pán)上，解剖盤(pán)中盛水，水深2~3cm，將孵化裝置置于可控溫、控濕的孵化室內(nèi)，孵化室的 相對(duì)濕度為65 %~88 %，孵化溫度為26~33 °C。
[0011] 在步驟2)中，所述整個(gè)裸孵過(guò)程涵蓋中華鱉胚胎發(fā)育敏感期開(kāi)始前直到胚胎發(fā)育 結(jié)束的整個(gè)過(guò)程。
[0012] 中華鱉胚胎發(fā)育時(shí)相判斷可參考Yntema[1]的劃分方法并對(duì)中華鱉的時(shí)相發(fā)育做 了重新定義。根據(jù)受精卵外觀(guān)、胚胎日齡及胚胎形態(tài)特征變化將整個(gè)胚胎發(fā)育過(guò)程分為26 期，主要以頭部、四肢、背甲及腹甲的變化作為分期依據(jù)。
[0013] 本發(fā)明首次與國(guó)際通用的龜胚胎發(fā)育時(shí)相標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比對(duì)，確定了中華鱉胚胎發(fā)育 時(shí)相，使得從事中華鱉性別分化與調(diào)控研究的學(xué)者得到的結(jié)果具有可比性，為龜鱉性別分 化比較研究奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明解決中華鱉胚胎發(fā)育時(shí)相的準(zhǔn)確判斷問(wèn)題，特別是無(wú)需解剖 受精卵，僅通過(guò)外觀(guān)觀(guān)察確定其胚胎發(fā)育時(shí)相，為提高中華鱉性別調(diào)控技術(shù)奠定了基礎(chǔ);對(duì) 于生產(chǎn)企業(yè)而言，本發(fā)明為普通生產(chǎn)者成功進(jìn)行中華鱉單性育種奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
[0014] 本發(fā)明首次按照國(guó)際通用的Yntema[1]標(biāo)準(zhǔn)對(duì)中華鱉溫度敏感期開(kāi)始以前至胚胎 發(fā)育結(jié)束期間胚胎發(fā)育時(shí)相進(jìn)行了系統(tǒng)描述。
[0015] 本發(fā)明在于無(wú)需解剖受精卵，通過(guò)受精卵外觀(guān)觀(guān)察可以得到中華鱉溫度敏感期開(kāi) 始前到胚胎發(fā)育結(jié)束整個(gè)過(guò)程的準(zhǔn)確的發(fā)育時(shí)相。
[0016] 本發(fā)明首次提出通過(guò)外觀(guān)觀(guān)察確定中華鱉胚胎發(fā)育時(shí)相劃分的方法，特別是首次 參考國(guó)際通用的龜胚胎發(fā)育時(shí)相劃分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)中華鱉的胚胎發(fā)育進(jìn)行劃分，特別是給出了中 華鱉溫度敏感期開(kāi)始前直到胚胎發(fā)育結(jié)束整個(gè)過(guò)程中華鱉受精卵外觀(guān)形態(tài)特征。本發(fā)明可 以準(zhǔn)確定位中華鱉胚胎發(fā)育時(shí)相，為后期進(jìn)行中華鱉性別調(diào)控研究和操作提供了有力支 撐。
[0017] 運(yùn)用本發(fā)明進(jìn)行中華鱉胚胎發(fā)育時(shí)相判斷的主要優(yōu)點(diǎn)在于：
[0018] 參照國(guó)際通用的龜胚胎發(fā)育時(shí)相劃分標(biāo)準(zhǔn)(共計(jì)26期)對(duì)中華鱉的時(shí)相進(jìn)行劃分， 使得中華鱉性別分化及性別調(diào)控研究學(xué)者的研究工作具有可比性。
[0019] 由于可以通過(guò)外觀(guān)形態(tài)對(duì)中華鱉的發(fā)育時(shí)相進(jìn)行判斷，減少了研究過(guò)程中解剖動(dòng) 物進(jìn)行判斷的工作量，多大提高工作效率。而對(duì)于養(yǎng)殖企業(yè)而言，技術(shù)人員無(wú)需通過(guò)解剖、 解剖鏡下觀(guān)察，無(wú)需高端儀器設(shè)備，僅僅通過(guò)手電筒就可以準(zhǔn)確進(jìn)行發(fā)育時(shí)相的判斷，大大 提高了中華鱉性別調(diào)控的可操作性和操作的成功率。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1為受精卵表面觀(guān)和胚胎側(cè)面觀(guān)圖版。在圖1中，（1)為受精卵表面觀(guān)，（2)為胚胎 左側(cè)面觀(guān)，（3)為胚胎右側(cè)面觀(guān)；11-1~11-3表示孵化8天；12-1~12-3表示孵化9天；13-1~ 13-3表不解化10天；14-1~14-3表不解化12天；15-1~15-3表不解化14天；16-1~16-3表不 孵化16天。
[0021] 圖2為受精卵表面觀(guān)、胚胎背面觀(guān)和胚胎腹面觀(guān)圖版。在圖2中，（1)為受精卵表面 觀(guān)，（2)胚胎背面觀(guān)，（3)胚胎腹面觀(guān)；17-1~17-3表示孵化18天；18-1~18-3表示孵化20天； 19-1~19-3表示孵化23天；20-1~20-3表示孵化26天；21-1~21-3表示孵化29天；22-1~ 22-3表示孵化32天。
[0022]圖3為受精卵表面觀(guān)、胚胎背面觀(guān)和胚胎腹面觀(guān)圖版。在圖3中，（1)為受精卵表面 觀(guān)，（2)胚胎背面觀(guān)，（3)胚胎腹面觀(guān);23-1~23-3表示孵化36天;24-1~24-3表示孵化40天； 25-1~25-3表示孵化44天；26-2~26-3表示孵化48天。
【具體實(shí)施方式】
[0023]中華鱉胚胎發(fā)育時(shí)相具體劃分方法如下：
[0024]中華鱉胚胎發(fā)育時(shí)相判斷主要參考Yntema[1]的劃分方法并對(duì)中華鱉的時(shí)相發(fā)育 做了重新定義。根據(jù)受精卵外觀(guān)、胚胎日齡及胚胎形態(tài)特征變化將整個(gè)胚胎發(fā)育過(guò)程分為 26期，主要以頭部、四肢、背甲及腹甲的變化作為分期依據(jù)。
[0025]以下結(jié)果是受精卵在29°C孵化溫度下的發(fā)育過(guò)程。
[0026] 第^^一期(2%~，第 8 天，圖 1，11_1 ~11-3)
[0027] 受精卵外觀(guān):受精斑發(fā)育至受精卵表面積的1/2,血絲環(huán)完整，細(xì)長(zhǎng)胚體隱約可見(jiàn)。 [0028]胚體外觀(guān):胚體細(xì)長(zhǎng)稍彎曲，肢芽已出現(xiàn)，眼睛黑色素覆蓋不完全。
[0029]第十二期（29 °C，第9天，圖 1，12-1 ~12-3)
[0030] 受精卵外觀(guān):血絲環(huán)完整且明顯，胚體彎曲隱約可見(jiàn)，眼睛隱約可見(jiàn)。
[0031]胚體外觀(guān):胚體加粗，彎曲幅度加大，肢芽更明顯，眼睛仍未完全黑亮。
[0032] 第十三期（2%~，第 10 天，圖 1，13_1 ~13-3)
[0033] 受精卵外觀(guān):胚體上方有兩簇較細(xì)的血絲，胚體可見(jiàn)。
[0034]胚體外觀(guān):胚體呈最大幅度彎曲，肢芽明顯可見(jiàn)；頭部較大，頭突明顯，眼睛黑亮； 尾部完全向腹側(cè)彎曲蜷縮;胚體內(nèi)血管較豐富，心跳活躍。
[0035]第十四期（2%~，第 12 天，圖 1，14_1 ~14-3)
[0036]受精卵外觀(guān)：受精斑超過(guò)受精卵表面積的1/2，胚體上方兩簇血絲明顯，胚體有些 明顯可見(jiàn)，有些隱在血絲下面。
[0037] 胚體外觀(guān):胚體開(kāi)始拉伸變粗，肢芽明顯可見(jiàn)，指板開(kāi)始形成；背甲雛形開(kāi)始出現(xiàn)； 尾部向腹側(cè)蜷縮一直持續(xù)到18期。
[0038] 第十五期（2%~，第 14 天，圖 1，15_1 ~15-3)
[0039] 受精卵外觀(guān):胚體上方兩簇血絲開(kāi)始沿兩頭延長(zhǎng)變粗。
[0040] 胚體外觀(guān):背甲出現(xiàn)，其長(zhǎng)度約占胚體線(xiàn)軸的1/3;指板發(fā)育良好，外周平滑不存在 指間凹槽;吻突出現(xiàn);部分腸道穿過(guò)體壁突出體外。
[0041] 第十六期（29°C，第 16天，圖1，16-1 ~16-3)
[0042]受精卵外觀(guān):胚體上方兩簇血絲明顯延長(zhǎng)加粗成血管，兩側(cè)并延伸出數(shù)條較細(xì)血 絲。
[0043] 胚體外觀(guān):背甲變大，隱約可見(jiàn)背甲肋紋，腹甲雛形開(kāi)始出現(xiàn);指板較大，外周平滑 出現(xiàn)輕微的指間凹槽;上顎突出較明顯，下顎末端到達(dá)晶狀體水平;腸道突出體外一直持續(xù) 到22期。
[0044] 第十七期(29°C，第 18 天，圖 2，17-1 ~17-3)
[0045] 受精卵外觀(guān):受精斑發(fā)育至受精卵的表面積2/3,胚體上方血絲簇延伸加粗并包圍 整個(gè)胚體。
[0046]胚體外觀(guān):背甲長(zhǎng)度約占胚體線(xiàn)軸的1/2,背甲肋紋明顯，約8對(duì)，脊柱明顯并有輕 微色素沉積，裙邊開(kāi)始出現(xiàn);腹甲形成更明顯；指板四周出現(xiàn)輕微鋸齒狀突起，頭部小于身 體部分，眼睛大而突出，下顎末端到達(dá)眼睛前端水平，鼻突出現(xiàn)。
[0047]第十八期（29°C，第 20 天，圖 2，18_1 ~18-3)
[0048]受精卵外觀(guān):胚體變大而不再透明。
[0049]胚體外觀(guān):背甲變寬大，其長(zhǎng)度超過(guò)胚體線(xiàn)軸的1/2,背甲肋紋明顯8對(duì)，脊柱明顯 且色素沉積更多，裙邊明顯，將尾部全部蓋住;腹甲形成更明顯；四肢可自由擺動(dòng)并伴有輕 微色素沉積，足趾突出使得指板四周鋸齒狀突起更深;頭部小于身體部分，眼睛大而突出， 下眼瞼出現(xiàn)，下顎末端延伸遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出眼睛前端水平，鼻突明顯；由于腹甲的良好的形成逐漸 遮擋了心臟的跳躍情況。
[0050]第十九期(29°C，第 23 天，圖 2，19-1 ~19-3)
[0051 ] 受精卵外觀(guān):血管明顯且包圍整個(gè)胚體，胚體明顯變大。
[0052]胚體外觀(guān):背甲約占胚體線(xiàn)軸2/3,脊柱色素沉積更明顯，裙邊明顯，尾部不再向腹 側(cè)蜷縮;腹甲形成良好；四肢色素沉積