專利名稱：升高丙酮酸脫氫酶活性的被取代的n－苯基2－羥基－2－甲基－3,3,3－三氟丙酰胺衍生物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及升高化合物、它們的制備方法、含有其作為活性成分的藥用組合物、治療與PDH活性降低有關的病癥的方法、涉及它們作為藥物的用途以及它們在制備用于升高溫血動物(如人)的PDH活性的藥物中的用途。本發(fā)明尤其是涉及用于治療溫血動物(如人)的糖尿病、外周血管疾病和心肌缺血的化合物，更具體地說，是涉及這些化合物在制備用于治療溫血動物(如人)的糖尿病的藥物中的用途。
在組織中，三磷酸腺苷(ATP)提供合成復雜分子和肌肉收縮的能量。ATP由高能物質如葡萄糖或長鏈游離脂肪酸的裂解產(chǎn)生。在氧化組織如肌肉中，大多數(shù)的ATP由進入檸檬酸循環(huán)的乙酰輔酶A生成，因此，乙酰輔酶A的供給是氧化組織中ATP產(chǎn)生的至關重要的決定性因素。乙酰輔酶A或者通過脂肪酸的β-氧化而產(chǎn)生，或者經(jīng)糖酵解途徑由葡萄糖代謝產(chǎn)生?？刂朴善咸烟切纬梢阴］o酶A的速率的關鍵調(diào)節(jié)酶為PDH，其催化丙酮酸氧化為乙酰輔酶A和二氧化碳，同時催化煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)還原為NADH。
在諸如非胰島素依賴型糖尿病(2型)和胰島素依賴型糖尿病(1型)的病癥中，脂質的氧化隨著葡萄糖利用的減少而增加，從而引起高血糖癥。1型和2型兩種糖尿病中葡萄糖利用的減少與PDH活性的降低有關。此外，PDH活性降低的進一步的后果可能是丙酮酸濃度的增加導致作為肝糖原異生物質的乳酸的利用率增加。有理由期望增加PDH活性除了能減少肝葡萄糖的輸出量外，還能增加葡萄糖的氧化率，由此增加總葡萄糖的利用率。另一個與糖尿病有關的致病因素為胰島素分泌受損，已表明此種受損與胰β-細胞的PDH活性降低有關(糖尿病的嚙齒動物遺傳模型，Zhou等(1996)Diabetes 45580-586)。
與脂肪酸的氧化相比，葡萄糖的氧化每摩爾氧能夠產(chǎn)生更多的ATP。在能量需要超過能量供應的疾病如心肌缺血、間歇性跛行、大腦局部缺血和再灌注中，(Zaidan等，1998；J.Neurochem.70233-241)，通過提高PDH活性使物質利用的平衡朝有利于葡萄糖代謝的方向移動，可望改善維持ATP水平及由此而來的功能的能力。
也期望能夠提高PDH活性的藥物有益于治療其表現(xiàn)為循環(huán)乳酸過量的疾病，如某些膿毒癥的病例。
已表明在快速給予動物后能增強PDH活性的藥物二氯乙酸(DCA)(Vary等.，1988；Circ.Shock，243-18)具有降低血糖的預期效果，(Stacpoole等，1978；N.Engl.J.Med.298526-530)，并可用于治療心肌缺血(Bersin和Stacpoole，1997；American Heart Journal，134841-855)和乳酸血癥(Stacpoole等，1983；N.Engl.J.Med.309390-396)。
PDH為由幾種亞基的多個拷貝組成的線粒體內(nèi)多酶復合體，其中所述亞基包括三種酶活性體E1、E2和E3，是為完成丙酮酸向乙酰輔酶A的轉化所必需的(Patel和Roche 1990；FASEB J.，43224-3233)。E1催化從丙酮酸中不可逆地除去二氧化碳；E2形成乙酰輔酶A；E3使NAD還原為NADH。兩種另外的酶活性體與所述復合體有關能夠在三個絲氨酸殘基上磷酸化E1的特異性激酶和逆轉該磷酸化的不密切-相關的特異性磷酸酯酶。三個絲氨酸殘基中的其中一個的磷酸化可使E1失活?；钚?去磷酸化)狀態(tài)的PDH的比例通過所述激酶和磷酸酯酶的活性之間的平衡來確定。所述激酶的活性可通過代謝物質(如NAD/NADH，輔酶A/乙酰輔酶A和腺苷二磷酸(ADP)/ATP)的相對濃度以及通過丙酮酸本身的利用度在體內(nèi)被調(diào)節(jié)。
能提高PDH活性的化合物可對治療與葡萄糖利用紊亂有關的病癥如糖尿病、肥胖癥(Curto等，1997；Int.J.Obes.211137-1142)及乳酸血癥具有潛在價值。另外，可期望該化合物能夠用于其中高能物質向組織的供應受到限制的疾病，如外周血管疾病(包括間歇性跛行)、心力衰竭和某些心肌疾病、肌無力、高脂血癥和動脈粥樣硬化(Stacpoole等，1978；N.Engl.J.Med.298526-530)。激活PDH的化合物也可用于治療阿爾茨海默氏病(AD)(J Neural Transm(1998)105，855-870)。
歐洲專利公布617010和524781號描述了能松弛膀胱平滑肌并可用于治療急迫性尿失禁的化合物。國際申請WO 9944618、WO9947508、WO 9962506、WO 9962873、WO 01/17942、WO 01/17955和WO 01/17956描述了提高PDH活性的化合物。本發(fā)明的化合物在任何以上申請中都未明確地公開，并且我們驚奇地發(fā)現(xiàn)這些化合物在一或多種其藥理活性(尤其是作為升高丙酮酸脫氫酶的化合物)和/或藥動學、效力、代謝和毒理學方面具有有益的性質，這些性質使其特別適合體內(nèi)給予溫血動物，如人。
因此，本發(fā)明提供一種式(I)的化合物或其藥學上可接受的鹽或體內(nèi)可水解的酯 其中R為甲基或甲磺?；?。
在本發(fā)明的一方面，R為甲基。
在本發(fā)明的另一方面，R為甲磺?；?br> 本發(fā)明的另一方面涉及一種化合物或其藥學上可接受的鹽。
還應清楚式(I)的化合物及其藥學上可接受的鹽和其體內(nèi)可水解的酯可以以溶劑化物和非溶劑化物的形式存在，如水合物形式。應清楚本發(fā)明包含能提高PDH活性的所有這些溶劑化物形式。
因此，式(I)的化合物及其藥學上可接受的鹽和其體內(nèi)可水解的酯可通過已知適用于制備化學上有關的化合物的任何方法制備。此類方法包括，例如，在歐洲專利申請、公布0524781、0617010、0625516號和在GB 2278054以及國際申請WO 9323358、WO9738124、WO9944618、WO 9947508、WO 9962506、WO 9962873、WO 01/17942、WO 01/17955和WO 01/17956中說明的那些方法。
本發(fā)明的另一方面提供制備式(I)化合物或其藥學上可接受的鹽或體內(nèi)可水解的酯的方法，該方法(其中除非另外指明，否則各種基團按式(I)化合物所定義)包括(a)將被保護的式(II)化合物脫保護 其中Pg為一種醇保護基；(b)將式(III)化合物氧化 其中a為0或1；(c)使式(IV)化合物 與式(V)的酸偶合
其中X為OH；(d)使式(IV)的苯胺與式(V)的活性酸衍生物偶合；(e)使式(VI)化合物與4-甲磺酰基哌嗪或4-甲基哌嗪反應 其中L為一種可取代的基團；(f)為制備其中R為甲基的式(I)化合物，將式(VII)化合物甲基化； (g)為制備其中R為甲磺?；氖?I)化合物，將式(VII)化合物甲磺?；?；(h)將式(VIII)化合物氯化 (i)將式(IX)化合物的官能團轉化為氯
其中Fg為一種官能團；(j)將有機金屬試劑加入到式(X)化合物中 (k)將有機金屬試劑加入到式(XI)化合物中 (l)將式(V)化合物(其中X為NH2)加入到式(XII)化合物中 其中L為一種可取代基團；(m)式(XII)化合物的Smiles重排
或(n)拆分式(I)化合物的(R)和(S)對映體混合物，得到(R)-對映體；隨后如果需要，可形成藥學上可接受的鹽或體內(nèi)可水解的酯。
Pg的適宜的涵義為芐基、甲硅烷基(例如三烷基甲硅烷基或烷基二苯基甲硅烷基)或乙?；Ｗo基。
當式(V)是一種活化的酸衍生物時，X的適宜的涵義包括鹵代基(例如氯或溴)、酸酐、芳氧基(如4-硝基苯氧基或五氟苯氧基)或咪唑-1-基。
L是可取代基團。L的適宜的涵義包括氟代基、氯代基、溴代基、硝基、甲磺酸根和三氟甲磺酸根。
Fg是官能團。適宜的官能團為氨基，其可通過重氮化，然后該重氮鹽與氯在銅催化下反應而相互轉化。
上述反應的具體條件如下方法(a)用于式(II)的醇去保護的適宜的試劑的實例為1)當Pg為芐基時i)在鈀/碳催化劑存在下的氫，即氫解；或ii)溴化氫或碘化氫；2)當Pg為甲硅烷基保護基團時i)氟化四丁基銨；或ii)氫氟酸或鹽酸；3)當Pg為乙?；鶗r
i)溫和的堿水溶液，如氫氧化鋰；或ii)氨或胺，如二甲胺。
該反應可在合適的溶劑如乙醇、甲醇、乙腈或二甲亞砜中進行，并可在-40至100℃的溫度范圍內(nèi)方便地進行。
根據(jù)下面的流程可制備式(II)化合物 流程1E為羧基保護基團。E的適宜的涵義包括C1-6烷基，如甲基和乙基。
式(IIa)化合物為可市售獲得的化合物。
方法(b)合適的氧化劑包括高錳酸鉀、OXONETM、高碘酸鈉、過酸(如3-氯過氧苯甲酸或過乙酸)、過氧化氫、TPAP(過釕酸四丙基銨)或氧。該反應可在合適的溶劑如乙醚、DCM、甲醇、乙醇、水、乙酸或這些溶劑的兩種或兩種以上的混合物中進行。該反應可在-40至100℃的溫度范圍內(nèi)方便地進行。
根據(jù)下面的流程可制備式(III)化合物
流程2式(IIIa)化合物為可市售獲得的化合物方法(c)該反應可在合適的偶合劑存在下進行?？墒褂帽绢I域已知的標準酰胺偶合劑作為合適的偶合劑，例如，如在上面用于(IIIa)和(V)或(IV)和(IId)的偶合所描述的那些條件，或者例如二環(huán)己基碳二亞胺，任選在催化劑如二甲基氨基吡啶或4-吡咯烷基吡啶的存在下，任選在堿如三乙胺、吡啶或2，6-二烷基-吡啶(如2，6-二甲基吡啶或2，6-二叔丁基吡啶)或2，6-二苯基吡啶的存在下進行。合適的溶劑包括二甲基乙酰胺、DCM、苯、THF和DMF。該偶合反應可在-40至40℃的溫度范圍內(nèi)方便地進行。
根據(jù)下面的流程可制備式(IV)化合物 流程3Pg為如下所述的胺保護基。
式(IVa)和(V)的化合物為可市售獲得的化合物，并且它們是文獻已知的化合物。
例如，所述式(V)的拆分的酸可通過制備旋光活性體的任何已知方法制備(例如通過手性鹽的重結晶{如WO 9738124}、通過酶拆分或通過使用手性固定相層析分離)。例如，所述(R)-(+)拆分的酸可通過國際專利申請公布號WO 9738124中流程2的用于制備(S)-(-)酸的方法制備，即采用歐洲專利申請公布號EP 0524781中所述的、也是用于制備(S)-(-)酸的典型拆分方法制備，但使用(1S，2R)-降麻黃堿代替(S)-(-)-1-苯基乙胺。通過在Tetrahedron Asymmetry，1999，10，679中所述的酶拆分方法也可制備該手性酸。
方法(d)這種偶合可任選在堿如三乙胺、吡啶、2，6-二烷基-吡啶(如2，6-二甲基吡啶或2，6-二叔丁基吡啶)或2，6-二苯基吡啶的存在下實現(xiàn)。合適的溶劑包括二甲基乙酰胺、DCM、苯、THF和DMF。該偶合反應可在-40至40℃的溫度范圍內(nèi)方便地進行。
方法(e)該反應可通過在溶劑如N-甲基-2-吡咯烷酮或二甲基乙酰胺中或無溶劑下，在40至160℃的溫度下加熱，使1-甲磺酰基哌嗪(US6140351)或1-甲基哌嗪(1-20摩爾當量，優(yōu)選2-10摩爾當量)與(VI)反應實現(xiàn)。
根據(jù)下面的流程可制備式(VI)化合物，其中L是氟。
流程4方法(f)在適合的溶劑如1，2-二氯乙烷、DCM或THF中，在0℃至回流的溫度范圍內(nèi)，優(yōu)選在室溫或接近室溫下，使用甲醛和還原劑如硼氫化鈉或三乙酰氧基硼氫化鈉，可將化合物(VII)甲基化?；蛘咴谌軇┤绫駾MF中，在堿如碳酸氫鈉、碳酸鈉或氫氧化鈉存在下，任選保護羥基的條件下，使用甲基化試劑如碘甲烷或硫酸二甲酯，可將化合物(VII)甲基化?；衔?VII)的制備在以下方法1中描述。
方法(g)在堿如三乙胺存在下，在適合的溶劑如DCM、THF、吡啶或乙酸乙酯中，在-40℃至回流的溫度范圍內(nèi)，優(yōu)選在室溫或接近室溫下，使用適合的試劑如甲磺酰氯，可將化合物(VII)甲磺?；?。
方法(h)在溶劑如DCM、乙腈、異丙醇或DMF中，在0℃至回流的溫度范圍內(nèi)，使用N-氯代琥珀酰亞胺進行氯化反應；或者在催化劑如三氯化鐵存在下，在適合的溶劑如乙酸、DMF或乙腈中，在-20℃至40℃的溫度范圍內(nèi)，優(yōu)選在室溫或低于室溫下，用氯進行氯化反應，接著從不需要的異構體雜質(如果形成)中分離出所需要的產(chǎn)物。
根據(jù)下面的流程可制備式(VIII)化合物。
流程5式(VIIIa)的化合物為可市售獲得。
方法(i)這些官能團相互轉化所用的試劑和反應條件是化學領域熟知的。
例如，可在0℃至回流的溫度下，優(yōu)選在室溫或接近室溫下，在溶劑如乙腈中，在催化劑如氯化銅存在下，通過用如亞硝酸叔丁酯等重氮化進行式(IX)化合物(其中Fg是NH2)向式(I)化合物的官能團轉化?；蛘?，可在-20至-40℃的溫度下，在溶劑如水、乙酸或這兩種溶劑的混合物中，在酸如HCl或硫酸存在下，通過用亞硝酸鹽重氮化，接著在0℃至回流的溫度下，在相同溶劑中，使所形成的重氮鹽與氯化銅反應而進行轉化。
根據(jù)下面的流程可制備式(IX)化合物。
方法(j)該反應可通過加入適當?shù)脑噭┤鏑F3SiMe3來進行(Ruppert氏試劑，Tetrahedron，2000，56(39)，7613)，該反應可通過采用適當?shù)拇呋瘎┤缡中苑量蓪廂}催化劑不對稱性實現(xiàn)，(Tetrahedron Lett.，1994，35，3137)，接著用酸性水溶液進行后處理以使反應中產(chǎn)生的叔醇甲硅烷基醚進行水解。該反應可在-100℃至室溫至回流的溫度下，優(yōu)選在-78℃至室溫下，在適合的溶劑如甲苯中進行。
式(X)化合物例如可通過方法(c)的方法，即通過式(IV)化合物與代替式(V)酸的丙酮酸偶合制備。
方法(k)該反應可在-120℃至40℃的溫度下，在溶劑如乙醚或THF中，在手性催化劑如TADDOL(四芳基二甲基二氧戊環(huán)二甲醇，例如其中芳基是苯基或2-萘基；Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，1992，31，84-6)存在下，通過加入適當?shù)挠袡C金屬性試劑如CH3MgBr或CH3CeCl2進行。
式(XI)化合物例如可通過方法(c)的方法，即通過式(IV)化合物與代替式(V)酸的三氟丙酮酸偶合(Tetrahedron Lett.，1989，30(39)，5243)制備。
方法(l)該反應可通過在20-160℃的溫度下，在適當?shù)娜軇┤鏣HF或NMP中，使式(XII)化合物與通過將式(V)化合物(其中X是NH2)用2摩爾當量堿如氫化鈉處理形成的二價陰離子反應進行。
式(XII)化合物(其中L是Cl)例如可通過采用方法(i)中說明的方法，由式(IV)化合物的重氮化制備。
方法(m)所述Smiles重排可通過在溶劑(如DMF)中，將式(XIV)化合物用堿如氫化鈉處理進行。
可在20-160℃的溫度下，在溶劑如THF或NMP中，用式(XII)化合物(其中L是Cl)與式(V)化合物(其中X是NH2)和1摩爾當量堿如氫化鈉制備式(XIV)化合物。
方法(n)使用本領域技術人員熟知的標準方法，例如重結晶、酶拆分或對映體的色譜分離法，通過拆分式(I)化合物及其相應的(S)對映體的混合物，可以得到所需的式(I)化合物的光學活性體。
如果不能由市售獲得，則對于例如上述方法必需的原料可以通過選自標準有機化學技術、類似于已知的結構類似的化合物的合成技術、或類似于上述方法的技術或實施例中描述的方法制備。
應注意到用于如上所述的合成方法的許多原料為可市售獲得的和/或是科學文獻中所廣泛報道的，或者可采用科學文獻中報道的改進方法從市售可獲得的化合物制備。有關反應條件和試劑的通用指導，讀者可進一步參考John Wiley & Sons，1992出版的Jerry March編寫的第四版Advanced Organic Chemistry。
還應該理解，在此提及的某些反應中，保護化合物中的任何敏感基團可能是必需的/符合需要的。必需或需要保護的情況和合適的保護方法是本領域技術人員已知的。可根據(jù)標準操作規(guī)范使用常規(guī)的保護基(說明見T.W.Greene，Protective Groups in Organic Synthesis，JohnWiley and Sons，1991)。
羥基的合適的保護基團的實例有例如烷酰基如乙?；?、芳?；绫郊柞；弱；?，甲硅烷基如三甲基甲硅烷基或者芳基甲基如芐基。以上保護基團的去保護條件將必須隨著保護基團的選擇而變化。因此，例如，?；缤轷；蚍减；梢裕?，通過用合適的堿如堿金屬氫氧化物(如氫氧化鋰或氫氧化鈉)水解脫去?；蛘撸坠柰榛缛谆坠柰榛缈赏ㄟ^氟或通過酸水溶液脫去；或者，芳基甲基如芐基可以例如經(jīng)催化劑如披鈀碳存在下的氫化脫去。
氨基的合適的保護基團有例如?；?，如乙酰基等烷?；⒓籽趸驶?、乙氧基羰基或叔丁氧基羰基等烷氧基羰基、芐氧基羰基等芳基甲氧基羰基、或苯甲酰基等芳?；τ谏鲜霰Ｗo基團的去保護條件必須隨保護基團的選擇而變化。因此，例如烷?；蛲檠趸驶弱；蚍减；梢岳缤ㄟ^用合適的堿如堿金屬氫氧化物(如氫氧化鋰或氫氧化鈉)水解脫去?；蛘撸；缡宥⊙趸驶梢酝ㄟ^用合適的酸如鹽酸、硫酸或磷酸或三氟乙酸處理脫去，芳基甲氧基羰基如芐氧基羰基可以例如通過經(jīng)催化劑如披鈀碳氫化或通過用路易斯酸如三(三氟乙酸)硼處理脫去。伯氨基的合適的備選保護基團有例如鄰苯二甲酰基，其可通過用烷基胺(例如二甲基氨基丙胺或2-羥基乙胺)或肼處理脫去。
采用化學領域熟知的常規(guī)技術，可以在所述合成的任何方便的階段除去保護基團，或者在后期的反應階段或后處理過程中除去。
式(I)化合物可形成穩(wěn)定的酸式或堿式鹽，在這種情況下以鹽的形式給予化合物是適合的，并且可通過如下所述的常規(guī)的方法制備藥學上可接受的鹽。合適的藥學上可接受的鹽的實例為與形成生理學上可接受的陰離子的酸形成的有機酸加成鹽，例如甲苯磺酸鹽、甲磺酸鹽和α-甘油磷酸鹽。也可以形成合適的無機鹽，如硫酸鹽、硝酸鹽和鹽酸鹽。
采用本領域熟知的標準方法，例如，通過使式(I)化合物(及某些情況下其酯)與可提供生理學上可接受的陰離子的合適的酸反應，可以獲得藥學上可接受的鹽。通過在含水介質中用1當量堿金屬氫氧化物或醇鹽或者0.5當量堿土金屬氫氧化物或醇鹽(如乙醇鹽或甲醇鹽)處理式(I)化合物(及某些情況下其酯)，并隨后采用常規(guī)純化技術，也可能制備相應的堿金屬(如鈉、鉀或鋰)或堿土金屬(如鈣)的鹽。
式(I)化合物的體內(nèi)可水解的酯為例如在人體或動物體內(nèi)可被水解而產(chǎn)生母體酸或醇的藥學上可接受的酯。
與羥基形成的式(I)化合物的適當?shù)捏w內(nèi)可水解的酯包括無機酯，如磷酸酯和α-酰氧基烷基醚。α-酰氧基烷基醚的實例包括如乙酰氧基甲氧基和2，2-二甲基丙酰氧基甲氧基。羥基形成的其它體內(nèi)可水解的酯的基團包括烷?；?、苯甲?；?、苯基乙?；腿〈谋郊柞；捅交阴；?、烷氧基羰基(得到烷基碳酸酯)、二烷基氨基甲?；蚇-(二烷基氨基乙基)-N-烷基氨基甲酰基(得到氨基甲酸酯)、二烷基氨基乙酰基和羧基乙?；１郊柞；娜〈膶嵗▎徇瓦哙夯?piperazino)，并從其環(huán)氮原子經(jīng)亞甲基連接于苯甲?；h(huán)的3-或4-位上。
升高PDH活性的化合物的鑒定為本發(fā)明的主題。這些性質例如可采用一或多種文獻中已知的實驗方法測定，例如WO 9962506中提出的方法；名稱為實驗(a)體外PDH活性的升高，實驗(b)分離的原代細胞的體外PDH活性的升高和實驗(c)體內(nèi)PDH活性的升高，這些實驗結合到本發(fā)明中作為參考?；蛘呖赏ㄟ^以下實驗測定這些化合物的性質體外PDH活性的升高這種測定法測定試驗化合物升高PDH活性的能力。通過聚合酶鏈反應(PCR)和隨后的克隆可以獲得編碼PDH激酶的cDNA。這可表達于合適的表達系統(tǒng)中，以獲得具有PDH激酶活性的多肽。例如，發(fā)現(xiàn)通過在大腸桿菌(Escherichia coli)(E.Coli)中表達重組蛋白所獲得的人體PDH激酶2(rPDHK2)呈現(xiàn)PDH激酶活性。
通過Baker等(2000)J.Biol.Chem.275，15773-15781中所述的方法克隆并表達人體rPDHK2(Genbank登錄號L42451.1)。根據(jù)該參考文獻中所述，將蛋白酶切割位點結合于所述表達的蛋白中?？梢砸灶愃品绞娇寺『捅磉_測定中使用的其它已知的PDH激酶。為表達rPDHK2的活性，用含有rPDHK2 cDNA的pET28載體轉化大腸桿菌株BL21(DE3)細胞。該載體將6-His標記物(tag)結合到蛋白質N-末端上。在37℃下，使大腸桿菌在發(fā)酵罐中生長至12(550nm)的光密度，降低至22℃，直至光密度達到15，然后通過加入0.5mM異丙硫基-β-半乳糖苷酶誘導蛋白質表達。使細胞于22℃生長3小時，然后離心收集。通過高壓勻化使再懸浮的細胞漿溶解，經(jīng)以26000xg離心30分鐘除去不溶性物質。用經(jīng)20mM N-[2-羥乙基]哌嗪-N’-[2-乙磺酸(HEPES)、50mM氯化鈉、1％(v/v)乙二醇、0.1％(w/v)Pluronics F-68 pH 8.0洗滌的鈷螯合樹脂(TALONClontech)基質，從上清液中除去6-His標記的蛋白，然后用添加了100mM咪唑pH 8.0的類似緩沖液逐步梯度洗脫結合的蛋白。合并含6-His標記蛋白的洗脫部分，加入乙二胺四乙酸(EDTA)和二硫蘇糖醇(DTT)至終濃度為1mM，通過加入PreScission蛋白酶(Amersham Pharmacia Biotech)斷裂標記物。采用谷胱甘肽瓊脂糖凝膠(Amersham Pharmacia Biotech)移出該蛋白酶。將未標記的蛋白透析至20mM HEPES-Na、150mM氯化鈉、0.5mM EDTA、0.1％(w/v)PluronicsF68、1％(v/v)乙二醇pH 8.0的儲備緩沖液中，然后以等分液于-80℃貯存。
對測定中的每批新的貯備PDHK酶進行滴定，以確定在該測定條件下產(chǎn)生PDH的約75％抑制的濃度。在4℃下，在含有50mM 3-[N-嗎啉代]丙磺酸(MOPS)、20mM正磷酸二鉀、60mM氯化鉀、2mM氯化鎂、0.4mM乙二胺四乙酸(EDTA)、0.2mM Pluronics F68、1mM二硫蘇糖醇(DTT)pH 7.3的緩沖液中，使貯備酶(一般為20μg/ml)與PDH(豬心PDH Sigma P7032)(0.05U/ml)締合24小時。
為測定新化合物的活性，將化合物稀釋于5％DMSO中，然后取5μl轉移至384-孔測定板的各孔中。對照孔裝有5μl5％DMSO以代替化合物。為測定PDH反應的最大速率，第二系列的對照孔裝有5μl激酶反應中終濃度為10μM的已知抑制劑。
加入40μl預締合的酶溶液，通過在以上緩沖液中加入5μl 10μMATP激發(fā)磷酸化反應。室溫下45分鐘后，通過加入體積為40μl的底物(2.5mM輔酶A、2.5mM硫胺素焦磷酸(輔羧酶)、2.5mM丙酮酸鈉、6mM NAD)測定PDH的殘留活性，然后將測定板于室溫下溫育90分鐘。使用板讀數(shù)分光光度計，經(jīng)測量340nm處的光密度，確立還原的NAD(NADH)的產(chǎn)生。用來自12種濃度的化合物的結果，以常規(guī)方法測定試驗化合物的EC50。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種藥用組合物，它包含如前定義的式(I)化合物或其藥學上可接受的鹽或體內(nèi)可水解的酯，以及藥學上可接受的賦形劑或載體。
所述組合物可以為適用于口服給藥的形式，例如，作為片劑或膠囊，適用于胃腸外注射(包括靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、血管內(nèi)或輸注)的形式，例如，作為無菌溶液、懸浮液或乳液，適用于局部給藥的形式，例如，作為軟膏劑或乳膏劑，或者適用于直腸給藥的形式，例如，作為栓劑。一般來說，可以以常規(guī)方法，采用常規(guī)賦形劑制備以上的組合物。
本發(fā)明的組合物以單位劑型提供更為有利。所述化合物正常應以每平方米動物體表面積5-5000mg，即大約0.1-100m/kg范圍內(nèi)的單位劑量給予溫血動物。設計的單位劑量范圍在例如1-100mg/kg，優(yōu)選1-50mg/kg內(nèi)，這通?？商峁┲委熒系挠行┝?。單位劑量形式(如片劑或膠囊)將通常含有例如1-250mg的活性成分。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種如前定義的式(I)化合物或其藥學上可接受的鹽或體內(nèi)可水解的酯，其用于通過療法治療人或動物體的方法中。
我們發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的化合物能升高PDH活性，因而具有降低血葡萄糖的重要作用。
本發(fā)明的另一個特征是用作藥物的式(I)化合物及其藥學上可接受的鹽或體內(nèi)可水解的酯。
正是式(I)化合物或其藥學上可接受的鹽或體內(nèi)可水解的酯可方便地用作在溫血動物(如人)體內(nèi)產(chǎn)生升高PDH活性的藥物。
特別是式(I)化合物或其藥學上可接受的鹽或體內(nèi)可水解的酯可用作在溫血動物(如人)體內(nèi)治療糖尿病的藥物。
特別是式(I)化合物或其藥學上可接受的鹽或體內(nèi)可水解的酯可用作在溫血動物(如人)體內(nèi)治療糖尿病、外周血管疾病和心肌缺血的藥物。
因此，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供式(I)化合物或其藥學上可接受的鹽或體內(nèi)可水解的酯在制備用于在溫血動物(如人)體內(nèi)產(chǎn)生升高PDH活性的藥物中的用途。
因此，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供式(I)化合物或其藥學上可接受的鹽或體內(nèi)可水解的酯在制備用于治療溫血動物(如人)的糖尿病的藥物中的用途。
因此，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供式(I)化合物或其藥學上可接受的鹽或體內(nèi)可水解的酯在制備用于治療溫血動物(如人)的糖尿病、外周血管疾病和心肌缺血的藥物中的用途。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種用于在溫血動物(如人)體內(nèi)產(chǎn)生升高PDH活性的藥用組合物，該組合物包含與藥學上可接受的賦形劑或載體相結合的如前定義的式(I)化合物或其藥學上可接受的鹽或體內(nèi)可水解的酯。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種用于治療溫血動物(如人)的糖尿病的藥用組合物，該組合物包含與藥學上可接受的賦形劑或載體相結合的如前定義的式(I)化合物或其藥學上可接受的鹽或體內(nèi)可水解的酯。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種用于治療溫血動物(如人)的糖尿病、外周血管疾病和心肌缺血的藥用組合物，該組合物包含與藥學上可接受的賦形劑或載體相結合的如前定義的式(I)化合物或其藥學上可接受的鹽或體內(nèi)可水解的酯。
根據(jù)本發(fā)明的另一個特征，提供一種用于在需要此種治療的溫血動物(如人)體內(nèi)產(chǎn)生升高PDH活性的方法，該方法包括給予所述動物有效量的如前定義的式(I)化合物或其藥學上可接受的鹽或體內(nèi)可水解的酯。
根據(jù)本發(fā)明的另一個特征，提供一種對需要此種治療的溫血動物(如人)的糖尿病進行治療的方法，該方法包括給予所述動物有效量的如前定義的式(I)化合物或其藥學上可接受的鹽或體內(nèi)可水解的酯。
根據(jù)本發(fā)明的另一個特征，提供一種對需要此種治療的溫血動物(如人)的糖尿病、外周血管疾病和心肌缺血進行治療的方法，該方法包括給予所述動物有效量的如前定義的式(I)化合物或其藥學上可接受的鹽或體內(nèi)可水解的酯。
如上所述，用于治療性或預防性治療具體病癥所需的劑量大小將必須根據(jù)所治療的宿主、給藥途徑和待治療疾病的嚴重程度而變化。優(yōu)選使用1-50mg/kg范圍內(nèi)的日劑量。然而，所述日劑量將必須根據(jù)所治療的宿主、給藥的具體途徑和待治療疾病的嚴重程度而變化。因此，最適劑量可由治療任何具體病人的醫(yī)師決定。
如上所述，本發(fā)明定義的化合物因其升高PDH活性的能力而引人注目。因此，本發(fā)明的化合物可以用于以下范圍的病癥，包括糖尿病、外周血管疾病(包括間歇性跛行)、心力衰竭和某些心肌疾病、心肌缺血、大腦局部缺血和再灌注、肌無力、高脂血癥、阿爾茨海默氏病和/或動脈粥樣硬化。或者，本發(fā)明的這類化合物可以用于以下范圍的病癥，包括外周血管疾病(包括間歇性跛行)、心力衰竭和某些心肌疾病、心肌缺血、大腦局部缺血和再灌注、肌無力、高脂血癥、阿爾茨海默氏病和/或動脈粥樣硬化，尤其外周血管疾病和心肌缺血。
式(I)化合物及其藥學上可接受的鹽和體內(nèi)可水解的酯除了用作治療藥物外，還可用作體外和體內(nèi)試驗系統(tǒng)的開發(fā)和標準化(作為研究新治療劑的一部分)的藥理學工具，用以評價實驗室動物(如貓、狗、兔、猴、大鼠和小鼠)中PDH活性升高的效應。
現(xiàn)在，本發(fā)明將由以下非限制性實施例加以說明，其中，除非另外說明，否則(i)溫度以攝氏度(℃)給出；操作在室溫或環(huán)境溫度下，即在18-25℃的溫度范圍內(nèi)且在惰性氣體(如氬氣)的氣氛下進行；(ii)有機溶液經(jīng)無水硫酸鎂干燥；在減壓(600-4000帕斯卡；4.5-30mmHg)及最高為60℃的浴溫下，使用旋轉式汽化器蒸發(fā)溶劑；(iii)層析意指硅膠快速層析；其中Biotage柱意指裝有KP-SILTM硅膠(60，粒徑32-63mM)的柱，由Biotage，Dyax公司的分公司，1500AvonStreet Extended，Charlottesville，VA 22902，USA供應；(iv)一般來說，反應過程通過TLC跟蹤，反應時間僅為說明的目的而給出；
(v)收率僅為說明的目的而給出，并不必是經(jīng)努力地處理過程才能獲得的收率；如果需要更多的產(chǎn)物，可重復制備；(vi)NMR數(shù)據(jù)在給出時，為主要鑒定質子以相對于作為內(nèi)標的四甲基硅烷(TMS)的每百萬分之幾(ppm)的δ值的形式，其采用全氘化的二甲亞砜(DMSO-δ6)作為溶劑于300MHz(除非另外指明)下測定；峰的多重性表示如下s，單峰；d，雙重峰；dd，兩個雙重峰；t，三重峰；tt，三個三重峰；q，四重峰；tq，三個四重峰；m，多重峰；br，寬峰；(vii)化學符號具有其通常的意義；采用SI單位和符號；(viii)溶劑比例以體積∶體積(v/v)術語給出；(ix)質譜(MS)采用直接暴露探針，以化學電離(CI)模式，用70電子伏的電子能量進行；其中所指的電離通過電子撞碰(EI)、快速原子轟擊(FAB)或電霧化(ESP)完成；給出的是m/z值；一般來說，只報導表明母體質量的離子，除非另外指明，否則所給出的值為(M-H)-；(x)使用下列縮寫NMP 1-甲基-2-吡咯烷酮；DMF N，N-二甲基甲酰胺；THF 四氫呋喃；DCM 二氯甲烷；和EtOAc酸乙酯；(xi)其中在名稱開始處給出的(R)或(S)立體化學，所表示的立體化學指如式(I)中所示的-NH-C(O)-C*(Me)(CF3)(OH)中心。
實施例1(R)-N-[2-氯-4-乙基磺酰基-3-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]-2-羥基-2-甲基-3，3，3-三氟丙酰胺將甲醛(0.77g)和三乙酰氧基硼氫化鈉(1.00g)加入到攪拌的(R)-N-(2-氯-4-乙基磺?；?3-哌嗪-1-基苯基)-2-羥基-2-甲基-3，3，3-三氟丙酰胺(0.467g；方法1)的1，2-二氯乙烷(9ml)溶液中。室溫下，將該反應混合物攪拌16小時，然后加入1M NaOH溶液(20ml)，將產(chǎn)物用DCM萃取(3×30ml)。將合并的有機萃取液干燥，經(jīng)蒸發(fā)除去揮發(fā)物質。將殘留物用乙酸乙酯/異己烷重結晶，得到固體的標題化合物(0.315g)。NMR1.11(3H，t)，1.60(3H，s)，2.10-2.18(2H，m)，2.21(3H，s)，2.70-2.82(4H，m)，3.53(2H，q)，3.55-3.62(2H，m)，7.91(1H，d)，8.07(1H，brs)，8.23(1H，d)，9.94(1H，brs)；m/z456。
實施例2(R)-N-[2-氯-4-乙基磺?；?3-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]-2-羥基-2-甲基-3，3，3-三氟丙酰胺(備選制備法)將1-甲基哌嗪(0.102g)加入到攪拌的(R)-N-(4-乙基磺?；?3-氟-2-氯苯基)-2-羥基-2-甲基-3，3，3-三氟丙酰胺(WO 01/17956的實施例15；0.096g)的NMP(1ml)溶液中。在130℃下，將該反應混合物加熱24小時。將反應混合液冷卻，然后加入氯化銨飽和溶液(100ml)。將產(chǎn)物用乙醚萃取(3×100ml)。將有機萃取液干燥，經(jīng)蒸發(fā)除去揮發(fā)物質。將殘留物經(jīng)Biotage柱(8g硅膠)層析純化，用5％甲醇/DCM洗脫，得到固體的標題化合物(0.086g)。NMR1.11(3H，t，1.60(3H，s)，2.10-2.18(2H，m)，2.21(3H，s)，2.70-2.82(4H，m)，3.53(2H，q)，3.55-3.62(2H，m)，7.91(1H，d)，8.07(1H，brs)，8.23(1H，d)，9.94(1H，brs)；m/z456。
實施例3(R)-N-[2-氯-4-乙基磺?；?3-(4-甲磺?；哙?1-基)苯基]-2-羥基-2-甲基-3，3，3-三氟丙酰胺將三乙胺(0.091g)和甲磺酰氯(0.124g)加入到攪拌的(R)-N-(2-氯-4-乙基磺酰基-3-哌嗪-1-基苯基)-2-羥基-2-甲基-3，3，3-三氟丙酰胺(0.401g；方法1)的DCM(10ml)懸浮液中。在室溫下，將該反應混合物攪拌2小時，然后加入氯化銨飽和溶液(20ml)。將產(chǎn)物用DCM萃取(3×30ml)。將有機萃取液干燥，經(jīng)蒸發(fā)除去揮發(fā)物質。將殘留物經(jīng)Biotage柱(8g硅膠)層析純化，用50-70％乙酸乙酯/異己烷洗脫，得到固體的標題化合物(0.215g)。NMR(CDCl3)1.26(3H，t)，1.78(3H，s)，2.86(3H，s)，3.01-3.18(4H，m)，3.39(2H，q)，3.68(1H，s)，3.75-3.87(4H，m)，8.01(1H，d)，8.57(1H，d)，9.62(1H，brs)；m/z520。
實施例4(R)-N-[2-氯-4-乙基磺?；?3-(4-甲磺酰基哌嗪-1-基)苯基]-2-羥基-2-甲基-3，3，3-三氟丙酰胺(備選制備法)將1-甲磺?；哙?0.370g)加入到攪拌的(R)-N-(4-乙基磺酰基-3-氟-2-氯苯基)-2-羥基-2-甲基-3，3，3-三氟丙酰胺(WO 01/17956的實施例15；0.213g)的NMP(2ml)溶液中。在150℃下，將該反應混合物加熱48小時，冷卻，然后加入氯化銨飽和溶液(100ml)。將產(chǎn)物用乙醚萃取(3×100ml)。將有機萃取液干燥，經(jīng)蒸發(fā)除去揮發(fā)物質。將殘留物經(jīng)Biotage柱(8g硅膠)層析純化，用50-70％乙酸乙酯/異己烷洗脫。然后將產(chǎn)物用乙酸乙酯/異己烷重結晶，得到固體的標題化合物(0.167g)。NMR(CDCl3)1.26(3H，t)，1.78(3H，s)，2.86(3H，s)，3.01-3.18(4H，m)，3.39(2H，q)，3.68(1H，s)，3.75-3.87(4H，m)，8.01(1H，d)，8.57(1H，d)，9.62(1H，brs)；m/z520。
原料方法1(R)-N-(2-氯-4-乙基磺?；?3-哌嗪-1-基苯基)-2-羥基-2-甲基-3，3，3-三氟丙酰胺將1-哌嗪甲酸叔丁基酯(6.12g)加入到攪拌的(R)-N-(4-乙基磺?；?3-氟-2-氯苯基)-2-羥基-2-甲基-3，3，3-三氟丙酰胺(WO 01/17956的實施例15；4.14g)的NMP(15ml)溶液中。在150℃下，將該反應混合物加熱24小時，冷卻，然后加入氯化銨飽和溶液(300ml)。將產(chǎn)物用乙醚萃取(3×300ml)。將有機萃取液干燥，經(jīng)蒸發(fā)除去揮發(fā)物質。將殘留物經(jīng)Biotage柱(90g硅膠)層析純化，用70％乙酸乙酯/異己烷洗脫。將產(chǎn)物溶于三氟乙酸(12ml)中，然后于室溫下攪拌30分鐘。將反應混合液用乙酸乙酯(200ml)稀釋，然后用1M NaOH溶液(300ml)洗滌。將有機萃取液干燥，經(jīng)蒸發(fā)除去揮發(fā)物質，得到固體的標題化合物(3.52g)。NMR1.12(3H，t)，1.60(3H，s)，2.74-2.86(6H，m)，3.48-3.59(4H，m)，7.89(1H，d)，8.22(1H，d)；m/z442。
權利要求
1.一種式(I)的化合物或其藥學上可接受的鹽或體內(nèi)可水解的酯 其中R為甲基或甲磺?；?。
2.權利要求1的式(I)化合物或其藥學上可接受的鹽或體內(nèi)可水解的酯，其中R為甲基。
3.權利要求1的式(I)化合物或其藥學上可接受的鹽或體內(nèi)可水解的酯，其中R為甲磺?；?br> 4.制備權利要求1-3中任一項的式(I)化合物或其藥學上可接受的鹽或體內(nèi)可水解的酯的方法，該方法(除非特別指出，否則其中R如式(I)的定義)包括(a)將被保護的式(II)化合物脫保護 其中Pg為一種醇保護基；(b)將式(III)化合物氧化 其中a為0或1；(c)使式(IV)化合物 與式(V)的酸偶合 其中X為OH；(d)使式(IV)的苯胺與式(V)的活性酸衍生物偶合；(e)使式(VI)化合物與4-甲磺酰基哌嗪或4-甲基哌嗪反應 其中L為一種可取代的基團；(f)為制備其中R為甲基的式(I)化合物，將式(VII)化合物甲基化； (g)為制備其中R為甲磺酰基的式(I)化合物，將式(VII)化合物甲磺?；?；(h)將式(VIII)化合物氯化 (i)式(IX)化合物的官能團轉化為氯 其中Fg為官能團；(j)將有機金屬試劑加入到式(X)化合物中 (k)將有機金屬試劑加入到式(XI)化合物中 (l)將其中X為NH2的式(V)化合物加入到式(XII)化合物中 其中L為一種可取代基團；(m)式(XIII)化合物的Smiles重排 或(n)拆分式(I)化合物的(R)和(S)對映體混合物，得到(R)-對映體；隨后如果需要，可形成藥學上可接受的鹽或體內(nèi)可水解的酯。
5.一種藥用組合物，該組合物包含與藥學上可接受的賦形劑或載體相結合的權利要求1-3中任一項的式(I)化合物或其藥學上可接受的鹽或體內(nèi)可水解的酯。
6.用作藥物的權利要求1-3中任一項的式(I)化合物或其藥學上可接受的鹽或體內(nèi)可水解的酯。
7.權利要求1-3中任一項的式(I)化合物或其藥學上可接受的鹽或體內(nèi)可水解的酯在制備用于在溫血動物如人體內(nèi)產(chǎn)生升高的PDH活性的藥物中的用途。
8.權利要求1-3中任一項的式(I)化合物或其藥學上可接受的鹽或體內(nèi)可水解的酯在制備用于治療溫血動物如人的糖尿病的藥物中的用途。
9.一種在需此種治療的溫血動物體內(nèi)產(chǎn)生升高的PDH活性的方法，該方法包括給予所述動物有效量的權利要求1-3中任一項的式(I)化合物或其藥學上可接受的鹽或體內(nèi)可水解的酯。
10.一種治療需要此種治療的溫血動物如人的糖尿病的方法，該方法包括給予所述動物有效量的權利要求1-3中任一項的式(I)化合物或其藥學上可接受的鹽或體內(nèi)可水解的酯。
11.一種用于在溫血動物如人體內(nèi)產(chǎn)生升高的PDH活性的藥用組合物，該組合物包含與藥學上可接受的賦形劑或載體相結合的權利要求1-3中任一項的式(I)化合物或其藥學上可接受的鹽或體內(nèi)可水解的酯。
12.一種用于治療溫血動物如人的糖尿病的藥用組合物，該組合物包含與藥學上可接受的賦形劑或載體相結合的權利要求1-3中任一項的式(I)化合物或其藥學上可接受的鹽或體內(nèi)可水解的酯。
全文摘要
本發(fā)明描述了式(I)的化合物及其藥學上可接受的鹽和體內(nèi)可水解的酯，其中R為甲基或甲磺酰基。還描述了該類化合物的制備方法、含有該類化合物的藥用組合物以及它們在溫血動物體內(nèi)產(chǎn)生升高的PDH活性的用途。
文檔編號A61P43/00GK1571665SQ02820773
公開日2005年1月26日 申請日期2002年8月21日 優(yōu)先權日2001年8月23日
發(fā)明者R·J·布特林 申請人:阿斯特拉曾尼卡有限公司