專利名稱：1,3－丙二醇脫氫酶突變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種1，3-丙二醇脫氫酶突變體，其對于1，3-丙二醇的米氏常數(shù)有所改變。本發(fā)明提供了1，3-丙二醇脫氫酶突變體的核酸和氨基酸序列。本發(fā)明同時(shí)提供了1，3-丙二醇脫氫酶突變體的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。
在肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)中，編碼甘油脫水酶(dhaB)、1，3-丙二醇氧化還原酶(dhaT)、甘油脫氫酶(dhaD)和二羥基丙酮激酶(dhaK)功能性相關(guān)活性的基因都存在于dha調(diào)節(jié)子中。檸檬酸桿菌和克雷伯氏菌的dha調(diào)節(jié)子已經(jīng)在大腸桿菌(Escherichia coli)中進(jìn)行了表達(dá)，并顯示可以把甘油轉(zhuǎn)化成1，3-丙二醇。
一種1，3-丙二醇脫氫酶的核酸和氨基酸序列已經(jīng)在現(xiàn)有技術(shù)中被公布，包括肺炎克雷伯氏菌GenBank U30903號(Williard，1994，“肺炎克雷伯氏菌1，3-丙二醇途徑的研究甘油脫水酶和1，3-丙二醇氧化還原酶的性質(zhì)和表達(dá)”，化學(xué)工程學(xué)論點(diǎn)(Thesis ChemicalEngineering)，威斯康星大學(xué)曼狄遜)；弗氏檸檬酸桿菌GenBankU09771號(Daniel等，1995，從弗氏檸檬酸桿菌中純化1，3-丙二醇脫氫酶克隆、測序和在大腸桿菌中表達(dá)相關(guān)基因，細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriol.)，1772151-2156)巴氏梭菌(Clostridiumpasteurianum)GenBank AF006034號(Luers等，1997，巴氏梭菌把甘油轉(zhuǎn)化成1，3-丙二醇克隆和表達(dá)編碼1，3-丙二醇脫氫酶的基因，F(xiàn)EMS Microbiol Lett.154337-345)。
因此，本發(fā)明提供了一種突變PDD，和野生型相比，其對于1，3-丙二醇的米氏常數(shù)有所提高。在一個(gè)實(shí)施例中，突變PDD對1，3-丙二醇的米氏常數(shù)大約是野生型PDD的3倍。在另一個(gè)實(shí)施例中，突變PDD對于1，3-丙二醇的米氏常數(shù)大約是80mM。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，突變PDD可以從蟑螂埃希氏菌ATCC保藏號PTA-92得到。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，突變PDD在相當(dāng)于蟑螂埃希氏菌PDD第105位His處含有被Leu替換的突變，如圖3所示。在又一個(gè)實(shí)施例中，突變PDD含有如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，編碼的核酸序列如SEQ ID NO1所示。
本發(fā)明也提供了含有具SEQ ID NO1所示序列的分離核酸的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，宿主細(xì)胞包括檸檬酸桿菌(Citrobacter)、腸細(xì)菌(Enterobacter)、梭菌(Clostridium)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、氣桿菌(Aerobacter)、乳桿菌(Lactobacillus)、曲霉(Aspergillus)、酵母(Saccharomyces)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)、接合酵母(Zygosaccharomyces)、畢赤氏酵母(Pichia)、克魯維酵母(Kluyveromyces)、假絲酵母(Candida)、漢森酵母(Hansenula)、德巴利酵母(Debaryomyces)、毛霉(Mucor)、球擬酵母(Torulopsis)、甲基細(xì)菌(Methylobacter)、埃希氏桿菌(Escherichia)、沙門氏菌(Salmonella)、芽孢桿菌(Bacillus)、鏈霉菌(Streptomyces)和假單胞菌(Pseudomona)。
在一個(gè)增加的實(shí)施例中，本發(fā)明涉及使用含有突變PDD的微生物生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法。
圖2提供了突變1，3-丙二醇脫氫酶(PDD)的氨基酸序列(SEQ IDNO2)。
圖3提供了來自不同微生物的PDD的氨基酸序列的比對。Eb_GEBT代表ATCC保藏的蟑螂埃希氏菌突變PDD，Eb_429T和Eb907T是野生型蟑螂埃希氏菌(ATCC 33429號)；Kpn是肺炎克雷伯氏菌(GenBankU30903號)；Cfu是弗氏檸檬酸桿菌(Genbank U09771號)；Cpast是巴氏梭菌(Clostridium Pasteurianum)(Genbank AF006034號)。
根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏的微生物的描述申請人基于布達(dá)佩斯條約中國際承認(rèn)用于專利申請的程序進(jìn)行了下面的微生物保藏。
詳述定義術(shù)語“1，3-丙二醇脫氫酶”或“PDD”(本領(lǐng)域中也被稱為“氧化還原酶”)是指具備能夠催化3-羥基丙醛發(fā)生還原反應(yīng)，生成1，3-丙二醇的酶活性多肽。例如1，3-丙二醇脫氫酶就包括dhaT基因編碼的多肽。本發(fā)明包含任何來源的1，3-丙二醇脫氫酶，包括但不只限于蟑螂埃希氏菌、肺炎克雷伯氏菌、弗氏檸檬酸桿菌、巴氏梭菌。
這里所用到的術(shù)語“突變”或“突變體”是指微生物核酸上發(fā)生的任何遺傳性改變，而不一定反映微生物表型上的改變。突變可能包含一個(gè)堿基對的替換、刪除或插入；突變也可能包含一大片DNA區(qū)域的改變，比如重復(fù)或倒置。突變1，3-丙二醇脫氫酶的氨基酸序列可能是由1，3-丙二醇脫氫酶前體，經(jīng)過替換、刪除或插入天然1，3-丙二醇脫氫酶中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸得到的。基因突變方法在本領(lǐng)域中已有描述(比如定點(diǎn)寡核苷酸誘變)。
這里所用到的術(shù)語“相當(dāng)于”是指圖3所示1，3-丙二醇脫氫酶的氨基酸相關(guān)性。這里提到的特定殘基都帶有參照圖3中顯示的蟑螂埃希氏菌GEB PDD編號的氨基酸殘基號。His突變成Leu在圖3中顯示的是105位殘基。圖3顯示了可以采用CLUSTALW方法比對多種微生物來源的1，3-丙二醇脫氫酶序列。本發(fā)明并非只限制于


圖1和圖2所示的蟑螂埃希氏菌PDD突變，或者ATCC保藏的PTA-92號蟑螂埃希氏菌的突變，而是指所有在相當(dāng)于蟑螂埃希氏菌已鑒定殘基位點(diǎn)具有類似氨基酸PDD。如果殘基和蟑螂埃希氏菌PDD中特定殘基或殘基部分是同源的(例如，一級結(jié)構(gòu)或者三級結(jié)構(gòu)位置相似)或相似的(例如，有相同或相似的結(jié)合能力、反應(yīng)能力或者化學(xué)或結(jié)構(gòu)上相互作用能力)，那么該殘基就是相當(dāng)?shù)摹?br> 為了確定一級結(jié)構(gòu)的同源性，直接把PDD的氨基酸序列和蟑螂埃希氏菌PDD的一級序列進(jìn)行比較(如圖2所示)，尤其是與已知在所有PDD中均無變化的一系列殘基相比較(見圖3)。本發(fā)明包含所當(dāng)有來源的1，3-丙二醇脫氫酶的相當(dāng)殘基突變，條件是該突變形式能夠改變對1，3-丙二醇的活性的Km值。在一個(gè)優(yōu)先實(shí)施例中，突變體對于1，3-丙二醇的米氏常數(shù)有所增加。通過PCR技術(shù)得到了如SEQ IDNO1所示的核酸序列。PCR技術(shù)經(jīng)常會產(chǎn)生序列錯(cuò)誤。因此，本發(fā)明也包含了ATCC PTA-92號的蟑螂埃希氏菌的1，3-丙二醇脫氫酶，及其他微生物來源的1，3-丙二醇脫氫酶的相關(guān)突變。
術(shù)語“米氏常數(shù)”是指酶和底物的親和性。高米氏常數(shù)反應(yīng)了低親和性；低米氏常數(shù)反應(yīng)了高親和性。
術(shù)語“碳底物”或“碳源”是指能夠被本發(fā)明的宿主微生物代謝的含碳物質(zhì)，尤其指選自單糖、低聚糖、多糖和一碳底物或它們的混合物的碳源。
術(shù)語“宿主細(xì)胞”或“宿主生物”是指能夠接受外來或異源基因，并且能夠表達(dá)這些基因，產(chǎn)生有活性的基因產(chǎn)物的微生物。
這里用到的“核酸”是指核苷酸或者多核苷酸序列，序列的片斷或者一部分，基因組成合成來源的DNA或RNA，可以是雙鏈或單鏈，有義鏈或無義鏈。術(shù)語“天然”或“野生型”是指自然中發(fā)現(xiàn)的帶有自己調(diào)控序列的基因。這里用到的“氨基酸”是指肽或蛋白質(zhì)序列或者它們的部分。
術(shù)語“表達(dá)”是指由編碼基因產(chǎn)物序列的基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和翻譯，形成基因產(chǎn)物。
術(shù)語“質(zhì)?！薄ⅰ拜d體”和“盒”是指染色體外的元件，它們常常攜帶并非細(xì)胞重要代謝一部分的基因，而且常常為環(huán)狀雙鏈DNA分子形式。這些元件可能是自身復(fù)制序列、基因組整合序列、噬菌體或核苷酸序列、線性或環(huán)狀、單鏈或雙鏈的DNA或RNA，可以是任何來源，其中已經(jīng)將一些核苷酸序列連接或重組成獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，能夠把啟動(dòng)子片段和選定基因產(chǎn)物的編碼DNA序列與適當(dāng)?shù)?′非翻譯序列整合入細(xì)胞?！稗D(zhuǎn)化盒”是指特殊的含有外源基因及有助于轉(zhuǎn)化特定宿主細(xì)胞的元件的載體?！氨磉_(dá)盒”是指含有外源基因和能夠使該基因在外源宿主中大量表達(dá)的元件的載體。
這里用到的術(shù)語“分離”或“純化”是指已經(jīng)將其與天然相關(guān)的至少一種成分相分離的核酸或者氨基酸。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及特征在于對于1，3-丙二醇的米氏常數(shù)有所提高的突變1，3-丙二醇脫氫酶(PDD)。1，PDD序列如SEQ ID NO1所示的多核苷酸序列編碼在105位的His突變成Leu的1，3-丙二醇脫氫酶(SEQ ID NO2)，如圖3所示。本領(lǐng)域技術(shù)人員都知道，由于密碼子的簡并性，有多個(gè)多核苷酸能夠編碼SEQ IDNO2。本發(fā)明包含所有這些多核苷酸。本發(fā)明包含具有相當(dāng)于如圖3所示蟑螂埃希氏菌105位殘基His被Leu替換的突變的PDD的編碼核酸。肺炎克雷伯氏菌PDD的核酸和氨基酸序列見GenBank U30903號；弗氏檸檬酸桿菌PDD的核酸和氨基酸序列見GenBank U09771號；巴氏梭菌PDD的核酸和氨基酸序列見GenBank AF00034號。本發(fā)明也包含可從ATCC PTA-92號蟑螂埃希氏菌的獲得的突變PDD。
從微生物基因組中得到目的基因的方法是分子生物學(xué)領(lǐng)域中的常見方法。例如，如果已經(jīng)知道某一基因的序列，就可以用限制性內(nèi)切酶制作合適的基因組文庫，然后用互補(bǔ)于目的基因序列的探針來篩選該基因。一旦分離到基因序列，就可以通過諸如多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)等標(biāo)準(zhǔn)引物介導(dǎo)的擴(kuò)增方法擴(kuò)增DNA，得到適于用合適載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化的DNA量。
或者，采用粘粒載體轉(zhuǎn)化合適細(xì)菌宿主的方法詳述于Sambrook等，分子克隆，第二版(1989)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor NY。
進(jìn)行PDD基因突變的方法是熟練的技術(shù)人員所共知的，例如包括定點(diǎn)誘變，實(shí)驗(yàn)程序如1988年7月26日頒發(fā)的美國專利US4760025號所述。載體和表達(dá)盒本發(fā)明提供了多種適于在合適宿主細(xì)胞中克隆、整合和表達(dá)突變PDD的載體和轉(zhuǎn)化與表達(dá)盒，同時(shí)這些載體和盒也適用于其他1，3-丙二醇生產(chǎn)相關(guān)蛋白的表達(dá)。適合的載體可以是與所用細(xì)菌相容的那些。適合的載體可能衍生于例如細(xì)菌、病毒(比如噬菌體T7或M13衍生的噬菌體)、粘粒、酵母或植物。獲得和使用這種載體的方法是熟練的技術(shù)人員所共知的。(Sambrook等，分子克隆，第1、2、3卷，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor NY，1989)一般來說，載體或盒含有介導(dǎo)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列、篩選標(biāo)記、促使自主復(fù)制或染色體整合的序列。適合的載體在基因的5’端含有轉(zhuǎn)錄起始控制區(qū)域，3’端含有轉(zhuǎn)錄終止控制區(qū)域。雖然一般人們認(rèn)為這兩個(gè)控制區(qū)域并不需要來自選作生產(chǎn)宿主的具體物種的天然基因，但是本發(fā)明最優(yōu)選兩種控制區(qū)都來源于和轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞同源的基因。
起始控制區(qū)域或啟動(dòng)子，對于啟動(dòng)PDD在目的宿主細(xì)胞中的表達(dá)是非常重要的。熟練的技術(shù)人員知道大量的啟動(dòng)子，對它們都比較熟悉。事實(shí)上，能夠啟動(dòng)這些基因的任何啟動(dòng)子都可以用于本發(fā)明，包括但并不只局限于CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI(適用于酵母中的表達(dá))；AOX1(適用于在畢赤酵母中的表達(dá))、lac、trp、IPL、IPR、T7、tac、trc(適用于在大腸桿菌中的表達(dá))。
終止控制區(qū)域也可能來自優(yōu)選宿主天然的多個(gè)基因。任選地，終止位點(diǎn)可能不是必須的，然而，包括有則最為優(yōu)選。
為了使本發(fā)明酶能夠高效表達(dá)，編碼酶的DNA通過起始密碼子與選定的表達(dá)控制序列可操作連接，使得表達(dá)形成適當(dāng)?shù)膍RNA。PDD轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骱捅磉_(dá)一旦合適的盒構(gòu)建成功之后，就被轉(zhuǎn)化到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞。采用眾所周知的方法把只含有1，3-丙二醇脫氫酶突變體或含有突變體以及1，3-丙二醇生產(chǎn)中的其他必需蛋白的盒轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞，例如經(jīng)轉(zhuǎn)化(例如，用鈣透化細(xì)胞轉(zhuǎn)化或者電穿孔轉(zhuǎn)化)或用重組噬菌體病毒轉(zhuǎn)染。(Sambrook等，如上)宿主細(xì)胞合適用于1，3-丙二醇重組生產(chǎn)的宿主細(xì)胞可能是原核生物或者真核生物，具體的選擇取決于宿主細(xì)胞表達(dá)有活性酶的能力。優(yōu)先選用的宿主通常是可用于生產(chǎn)甘油或1，3-丙二醇的宿主，比如檸檬酸桿菌、腸桿菌、梭菌、克雷伯氏菌、氣桿菌、乳桿菌、曲霉、酵母、裂殖酵母、接合酵母、畢赤氏酵母、克魯維酵母、假絲酵母、漢森酵母、德巴利酵母、毛霉、球擬酵母、甲基細(xì)菌、埃希氏桿菌、沙門氏菌、芽孢桿菌、鏈霉菌和假單胞菌。本發(fā)明最優(yōu)選采用的是大腸桿菌、克雷伯氏菌屬和酵母屬的種。培養(yǎng)基和碳源本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基必須含有合適的碳底物。合適的底物可能包括但并不局限于以下幾種單糖比如葡萄糖和果糖、寡糖比如乳糖和蔗糖、多糖比如淀粉和纖維素，或者上面幾種的混合物，或可再生原料的粗制混合物比如奶酪乳清浸取物、玉米漿、甜菜糖蜜或大麥芽。另外，碳底物也可能是一碳底物，比如二氧化碳或可以代謝轉(zhuǎn)化成關(guān)鍵生化中間體的甲醇。
首選的碳源是單糖、寡糖、多糖和一碳化合物。更優(yōu)選的是糖類比如葡萄糖、果糖、蔗糖和一碳底物比如甲醇和二氧化碳。最優(yōu)選的是葡萄糖。
除了合適的碳源，發(fā)酵培養(yǎng)基必須含有合適的礦物質(zhì)、鹽、輔助因子、緩沖液和其他成分，這些是熟練技術(shù)人員都知道的，適于培養(yǎng)物生長和促進(jìn)甘油生產(chǎn)必需酶促途徑。還要注意加入Co(II)鹽和/或維生素B12或它的前體。培養(yǎng)條件一般，細(xì)胞用合適培養(yǎng)基在30℃培養(yǎng)。本發(fā)明中首選的生長培養(yǎng)基是常見的市售培養(yǎng)基如LB培養(yǎng)基、SD(Sabouraud Dextrose)培養(yǎng)基或YM(Yeast Malt Extract)培養(yǎng)基。其他已知成分或合成的生長培養(yǎng)基可能也會用到。熟悉微生物或發(fā)酵生物學(xué)的人知道適于某種微生物生長的合適培養(yǎng)基。反應(yīng)介質(zhì)中可以摻入可能會直接或間接調(diào)節(jié)代謝的物質(zhì)，比如2’-3’cAMP(環(huán)腺苷一磷酸)或2’-5’cAMP。同樣，可以單獨(dú)或與遺傳操作一起使用可調(diào)節(jié)酶活性的物質(zhì)(例如亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽和堿)，增強(qiáng)甘油的生成。
發(fā)酵的合適pH從5.0到9.0，發(fā)酵早期pH一般為6.0到8.0。
反應(yīng)可以在有氧或者無氧的環(huán)境下進(jìn)行，其中優(yōu)選厭氧或微好氧條件。
通過參考下面的實(shí)施例，熟練技術(shù)人員就很容易理解本發(fā)明中所采用的方式和方法。下面的實(shí)施例并沒有限制本發(fā)明范圍以及后面的權(quán)利要求述及的范圍。
這里提到的所有參考文獻(xiàn)，包括專利、專利申請、序列和出版物都全部引入本文作為參考。
權(quán)利要求
1.一種突變1，3-丙二醇脫氫酶，與相應(yīng)的野生型1，3-丙二醇脫氫酶相比，其對1，3-丙二醇的米氏常數(shù)有了提高。
2.權(quán)利要求1的突變1，3-丙二醇脫氫酶，其米氏常數(shù)大約是野生型的3倍。
3.權(quán)利要求1的突變1，3-丙二醇脫氫酶，其對1，3-丙二醇的米氏常數(shù)大約是80mM。
4.權(quán)利要求1的突變1，3-丙二醇脫氫酶，其可從ATCC編號PTA-92的蟑螂埃希氏菌獲得。
5.權(quán)利要求1的突變1，3-丙二醇脫氫酶，其具有相當(dāng)于蟑螂埃希氏菌中如圖3所示的105位殘基從His到Leu的突變。
6.權(quán)利要求1的突變1，3-丙二醇脫氫酶，其包含如SEQ ID NO2所示序列的氨基酸。
7.編碼具有如SEQ ID NO2所示序列的突變1，3-丙二醇脫氫酶的分離的核酸。
8.權(quán)利要求7的分離的核酸，其具有如SEQ ID NO1所示的序列。
9.表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求7的分離的核酸。
10.宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求9的表達(dá)載體。
11.權(quán)利要求10的宿主細(xì)胞，其包括檸檬酸桿菌屬、腸桿菌屬、梭菌屬、克雷伯氏菌屬、氣桿菌屬、乳桿菌屬、曲霉屬、酵母屬、裂殖酵母屬、接合酵母屬、畢赤氏酵母屬、克魯維酵母屬、假絲酵母屬、漢森酵母屬、德巴利酵母屬、毛霉屬、球擬酵母屬、甲基細(xì)菌屬、埃希氏桿菌屬、沙門氏菌屬、芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬和假單胞菌屬。
12.權(quán)利要求10的宿主細(xì)胞，其中所述突變1，3-丙二醇脫氫酶包含相當(dāng)于蟑螂埃希氏菌中如圖3所示105位殘基從His到Leu的突變。
13.權(quán)利要求12的宿主細(xì)胞，其中所述的突變1，3-丙二醇脫氫酶具有SEQ ID NO2的氨基酸序列。
14.在微生物中生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法，包括以下步驟I，得到含有和相應(yīng)野生型PDD相比其對1，3-丙二醇的米氏常數(shù)有所提高的突變1，3-丙二醇脫氫酶(PDD)的微生物，該微生物含有至少一種能表達(dá)脫水酶活性的基因，和II，將該微生物和碳底物一起培養(yǎng)。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述突變1，3-丙二醇脫氫酶包含相當(dāng)于蟑螂埃希氏菌中如圖3所示的105位殘基從His到Leu的突變。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述突變1，3-丙二醇脫氫酶包含如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
17.權(quán)利要求14的方法，其中所述突變1，3-丙二醇脫氫酶可以從ATCC保藏號為PTA-92的蟑螂埃希氏菌獲得。
18.權(quán)利要求14的方法，其中所述微生物包括檸檬酸桿菌屬、腸桿菌屬、梭菌屬、克雷伯氏菌屬、氣桿菌屬、乳桿菌屬、曲霉屬、酵母屬、裂殖酵母屬、接合酵母屬、畢赤氏酵母屬、克魯維酵母屬、假絲酵母屬、漢森酵母屬、德巴利酵母屬、毛霉屬、球擬酵母屬、甲基細(xì)菌屬、埃希氏桿菌屬、沙門氏菌屬、芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬和假單胞菌屬。
19.ATCC保藏號為PTA-92的分離的微生物。
全文摘要
本發(fā)明涉及突變1,3－丙二醇脫氫酶和能夠在濃度至少為105克/升的1,3－丙二醇存在下生長的新型微生物,其中這個(gè)濃度對于野生型微生物來說通常是致死的。本發(fā)明也提供了包含突變1,3－丙二醇脫氫酶基因的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞,以及生產(chǎn)1,3－丙二醇的方法,包括使用含有突變1,3－丙二醇脫氫酶的細(xì)胞。
文檔編號C12N1/15GK1352688SQ00807743
公開日2002年6月5日 申請日期2000年5月16日 優(yōu)先權(quán)日1999年5月19日
發(fā)明者D·E·特林伯, G·M·威蒂德, O·V·塞里弗諾瓦 申請人:金克克國際有限公司