專利名稱：一種篩選人組織相容性抗原(hla)的t細(xì)胞表面抗原肽的體系,及其在制備mhc-抗原肽多 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種篩選人組織相容性抗原(HLA)的T細(xì)胞表面抗原肽的方法，及其在制備MHC-抗原肽多聚體中的應(yīng)用，屬于生物制藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
同種組織、器官移植是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一種重要的治療技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用。腎臟、心臟、肝臟、骨髓的同種移植已成功地挽救了大量患者的生命。更為復(fù)雜和實(shí)用的同種移植(多臟器、胰島移植等)也在研究應(yīng)用中。同種移植失敗的主要原因是由于宿主T細(xì)胞對(duì)移植產(chǎn)生攻擊，導(dǎo)致移植物被排斥。早已知道T細(xì)胞識(shí)別的主要抗原是移植物上的HLA抗原，包括I類和II類抗原。移植物與宿主間相適的組織配型是減少移植排斥最有效的途徑。然而，由于找到HLA配型完全相符合的機(jī)會(huì)很低，大多數(shù)的器官移植采用的HLA配型的半相合或不相合的器官。宿主對(duì)于移植物的排斥反應(yīng)則通過(guò)給予有效的免疫抑制劑而被抑制。因而，器官移植患者將終身使用免疫抑制劑，而由于免疫抑制劑產(chǎn)生的非特異性免疫損害又對(duì)患者產(chǎn)生并發(fā)癥的危險(xiǎn)。降低患者生活質(zhì)量，同時(shí)也造成患者很大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。更為復(fù)雜的是當(dāng)患者出現(xiàn)臨床不良反應(yīng)時(shí)，有時(shí)很難判斷這種反應(yīng)是由于宿主的免疫排斥反應(yīng)引起的，還是免疫抑制劑的毒害造成的。而這兩種危害的臨床解決方案正好是相矛盾的即當(dāng)出現(xiàn)排斥反應(yīng)時(shí)要加大免疫抑制劑用量，而出現(xiàn)免疫抑制劑損害時(shí)要降低免疫抑制劑的用量。因而，發(fā)明一種可以精確鑒別上述2種臨床不良反應(yīng)病因的技術(shù)產(chǎn)生對(duì)于組織器官移植的患者的急救、個(gè)體用藥指導(dǎo)是極為重要和實(shí)用的。對(duì)于移植物特異性的T細(xì)胞可以作為這種檢測(cè)的目標(biāo)細(xì)胞當(dāng)這種細(xì)胞升高，提示可能出現(xiàn)排斥反應(yīng)。而這種細(xì)胞消失的情況下出現(xiàn)的臨床毒性反應(yīng)很可能是免疫抑制劑過(guò)量造成的。通過(guò)檢測(cè)這類T細(xì)胞，可以有效地進(jìn)行鑒別診斷，指導(dǎo)臨床使用合理的方案，同時(shí)也可以根據(jù)每一患者的個(gè)體差異指導(dǎo)其長(zhǎng)期合理的用藥，從而可在保證移植物長(zhǎng)期存活的前提下，提高患者生活質(zhì)量、減低經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
目前已可以用MHC-肽多聚體技術(shù)檢測(cè)特異性T細(xì)胞，并可將其分選、活化、擴(kuò)增。不但可為臨床提供診斷的依據(jù)，而且可利用這些T細(xì)胞進(jìn)行生物治療(增強(qiáng)或抑制免疫反應(yīng))。MHC-肽多聚體制備、應(yīng)用的要點(diǎn)是要采用相應(yīng)的T細(xì)胞識(shí)別表位肽，這些肽的大小一般在9-15個(gè)氨基酸殘基。然而，到目前為止雖然知道移植物上的HLA抗原是T細(xì)胞的主要識(shí)別對(duì)象。只有很少的HLA表位被解析出來(lái)，并用于檢測(cè)特異性T細(xì)胞。又由于HLA具有高度的多態(tài)性，按照現(xiàn)有的T細(xì)胞表位篩選技術(shù)篩選相應(yīng)表位肽是非常困難的。本發(fā)明是在我們另一項(xiàng)高效篩選T細(xì)胞表位肽用于MHC-肽多聚體篩選體系發(fā)明基礎(chǔ)上，采用T2樣細(xì)胞-噬菌體展示技術(shù)篩選的-組宿主T細(xì)胞識(shí)別的HLA抗原肽。這組肽可用于制備MHC-肽多聚體。從而發(fā)展出一種高效、特異的，檢測(cè)、分選、活化、擴(kuò)增宿主特異性抗同種移植物T細(xì)胞的方法，用于同種移植排斥反應(yīng)及免疫抑制劑個(gè)體化治療的檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
現(xiàn)有的篩選人組織相容性抗原肽的實(shí)驗(yàn)步驟繁復(fù)，而且要合成大量的人組織相容性抗原肽段，成本很高。
本發(fā)明的目的是提供一種篩選人組織相容性抗原肽的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用此體系篩選的人組織相容性抗原肽制備MHC-肽多聚體的應(yīng)用。
利用本發(fā)明的方法可以快速并且大量的篩選到目的肽段。
本發(fā)明一種高效篩選T細(xì)胞抗原表位肽，制備MHC-肽多聚體(MHC tetramer)的方法，其步驟如下(1)iRNA技術(shù)制備表達(dá)不同HLA抗原(包括I類和II類抗原)的、內(nèi)源性抗原肽提呈表達(dá)缺陷的T2樣細(xì)胞系；(2)制備人主要及次要組織相容性抗原的肽鏈基因庫(kù)；(3)利用步驟(2)制備的基因庫(kù)，制備噬菌體肽展示體系；(4)把步驟(1)制備的T2樣細(xì)胞系與步驟(3)制備的噬菌體混合；(5)洗滌去除不結(jié)合的噬菌體；(6)利用抗噬菌體衣殼蛋白抗體檢測(cè)噬菌體結(jié)合的情況和條件；(7)用洗脫液進(jìn)行梯度洗脫去除親和性不高的噬菌體；(8)加入噬菌體敏感宿主大腸桿菌使T2樣細(xì)胞上的噬菌體感染大腸桿菌，并得以擴(kuò)增；(9)由大腸桿菌中進(jìn)一步分離噬菌體質(zhì)粒，并對(duì)其中的cDNA克隆測(cè)序、篩選出與MHC分子結(jié)合的肽段序列；(10)合成所篩選的肽段，結(jié)合至T2樣細(xì)胞用該細(xì)胞刺激T細(xì)胞反應(yīng)，確認(rèn)肽段T細(xì)胞表位活性。
具體實(shí)施例實(shí)施例1制備內(nèi)源性抗體肽表達(dá)缺陷的T2樣細(xì)胞系制備T2細(xì)胞的TAP基因，使用Benitec公司的RNAi試劑盒，根據(jù)產(chǎn)品實(shí)驗(yàn)說(shuō)明的步驟，制備出TAP基因缺陷的T2樣細(xì)胞。
把上述T2樣細(xì)胞破碎，根據(jù)《分子克隆》的方法提取T2樣細(xì)胞的基因，再用PCR技術(shù)用TAP啟動(dòng)子和終止子進(jìn)行擴(kuò)增，再進(jìn)行凝膠電泳，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有TAP基因帶。
實(shí)施例2制備人組織相容性抗原肽鏈基因庫(kù)把T細(xì)胞在含有4.5g/L葡萄糖和15％FBS的DMEM中繁殖，用常規(guī)方法分離RNA，并用試劑盒把RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA(Indianapolis，Ind)。第一步制備出來(lái)的cDNA再用PCR方法擴(kuò)增。
把制備好的DNA用酶XhoI和SpeI同時(shí)進(jìn)行酶切，并把基因插入到噬菌體展示系統(tǒng)里(Dyax公司生產(chǎn))。得到含有各種肽段的噬菌體系統(tǒng)。
實(shí)施例3篩選親和性高的噬菌體用PBS洗滌細(xì)胞，把沒(méi)有結(jié)合的噬菌體洗去，再增加洗滌液的離子強(qiáng)度，繼續(xù)洗滌，把結(jié)合不緊密的噬菌體洗去，不斷增加洗滌液的離子強(qiáng)度，不斷進(jìn)行洗滌去除結(jié)合不緊密的噬菌體，最后篩選出和T2樣細(xì)胞親和力高的噬菌體。
實(shí)施例4擴(kuò)增篩選出來(lái)的和T2樣細(xì)胞親和力高的噬菌體加入噬菌體敏感宿主大腸桿菌使T2樣細(xì)胞上的噬菌體感染大腸桿菌，加入LB培養(yǎng)基，37℃下培養(yǎng)24-48小時(shí)，收集大腸桿菌，由大腸桿菌中進(jìn)一步分離噬菌體質(zhì)粒，并對(duì)其中的cDNA克隆測(cè)序、篩選出與MHC分子結(jié)合的肽段序列，為YIGEVLVSV、SPSVDKARAEL、SPAVDKAQAEL。
實(shí)施例5用人組織相容性抗原肽段合成MHC-肽抗體多聚體水浴或冰凍孵箱預(yù)冷1L折疊緩沖液(裝于有攪拌子的1L的燒杯中)，在折疊緩沖液加入還原型谷胱酐肽至5mM，氧化型谷胱酐肽至0.5mM，PMSF至0.2mM。計(jì)算加入1uM重鏈、2uM輕鏈和30mg/L肽的必需量，將重鏈和輕鏈加入5ml注射緩沖液中，于室溫抽入5ml注射器中。并根據(jù)人組織相容性抗原多肽的氨基酸序列(疏水性)于500ul雙蒸水或DMSO中稀釋人組織相容性抗原多肽。將1L重懸緩沖液放于攪拌器上高速攪拌(避免反應(yīng)液起泡)，用移液器逐滴加人組織相容性抗原多肽于攪拌的反應(yīng)液中。用26號(hào)針頭在盡可能接近攪拌子的位置猛烈將重鏈和輕鏈注射于攪拌的反應(yīng)液中。加入輕鏈后，折疊緩沖液應(yīng)變得輕微不透明。存放于10℃，過(guò)夜。將復(fù)性反應(yīng)物超濾濃縮至7ml。用Superdex75凝膠過(guò)濾純化MHC-人組織相容性抗原肽單聚體。用SDS-PAGE檢測(cè)，并用ELISA法鑒定其構(gòu)象，一抗為BB7.2。
將MHC-I單聚體與制備的熒光標(biāo)記的卵黃抗體按比例混合，37℃溫浴1h，用Superdex200凝膠過(guò)濾純化。FPLC檢測(cè)。
將MHC-I單聚體與制備的熒光標(biāo)記的單克隆抗體按比例混合，37℃溫浴1h，用Superdex200凝膠過(guò)濾純化。FPLC檢測(cè)。
實(shí)施例6MHC-HLA-A2.1肽多聚體在臨床上的應(yīng)用用上述制備出的MHC-HLA-A2.1肽四聚體或多聚體，并在四聚體或多聚體上結(jié)合一個(gè)顯色因子，把這個(gè)四聚體或多聚體與組織、器官移植患者的血清混合，分離并洗滌，洗去沒(méi)有結(jié)合的MHC-人組織相容性抗原肽四聚體或多聚體，用細(xì)胞計(jì)數(shù)器檢測(cè)T細(xì)胞的數(shù)量，得知T細(xì)胞的濃度變高，提示可能出現(xiàn)排斥反應(yīng)。從而可以指導(dǎo)臨床合理使用免疫抑制劑。
實(shí)施例7MHC-HLA-B7肽多聚體在臨床上的應(yīng)用用上述制備出的MHC-HLA-B7肽四聚體或多聚體，并在四聚體或多聚體上結(jié)合一個(gè)顯色因子，把這個(gè)四聚體或多聚體與組織、器官移植患者的血清混合，分離并洗滌，洗去沒(méi)有結(jié)合的MHC-人組織相容性抗原肽四聚體或多聚體，用細(xì)胞計(jì)數(shù)器檢測(cè)T細(xì)胞的數(shù)量，得知T細(xì)胞的濃度變高，提示可能出現(xiàn)排斥反應(yīng)。從而可以指導(dǎo)臨床合理使用免疫抑制劑。
權(quán)利要求
1.一種篩選人組織相容性抗原(HLA)的T細(xì)胞表面抗原肽的方法，其包括以下步驟(1)用iRNA技術(shù)制備表達(dá)不同HLA抗原(包括I類和II類抗原)的、內(nèi)源性抗原肽提呈表達(dá)缺陷的T2樣細(xì)胞系；(2)制備人主要及次要組織相容性抗原的肽鏈基因庫(kù)；(3)利用步驟(2)制備的基因庫(kù)，制備噬菌體肽展示體系；(4)把步驟(1)制備的T2樣細(xì)胞系與步驟(3)制備的噬菌體混合；(5)洗滌去除不結(jié)合的噬菌體；(6)利用抗噬菌體衣殼蛋白抗體檢測(cè)噬菌體結(jié)合的情況和條件；(7)用洗脫液進(jìn)行梯度洗脫去除親和性不高的噬菌體；(8)加入噬菌體敏感宿主大腸桿菌使T2樣細(xì)胞上的噬菌體感染大腸桿菌，并得以擴(kuò)增；(9)由大腸桿菌中進(jìn)一步分離噬菌體質(zhì)粒，并對(duì)其中的cDNA克隆測(cè)序、篩選出與MHC分子結(jié)合的肽段序列；(10)合成所篩選的肽段，結(jié)合至T2樣細(xì)胞用該細(xì)胞刺激T細(xì)胞反應(yīng)，確認(rèn)肽段T細(xì)胞表位活性。
2.權(quán)利要求1所述的一種高效篩選T細(xì)胞抗原表位肽，制備MHC-肽多聚體的方法，其步驟(7)所述的洗脫液為陽(yáng)離子洗脫劑。
3.權(quán)利要求1所述的一種篩選人組織相容性抗原(HLA)的T細(xì)胞表面抗原肽的方法，得到的肽鏈?zhǔn)谴嬖谌薍LA I類和I類分子上的，可以被T細(xì)胞受體(TCR)識(shí)別的T細(xì)胞抗原表位肽。
4.如權(quán)利要求3的一種篩選人組織相容性抗原(HLA)的T細(xì)胞表面抗原肽的方法，所述的可以被T細(xì)胞受體(TCR)識(shí)別的T細(xì)胞抗原表位肽為HLA-A2.1，序列為YIGEVLVSV。
5.如權(quán)利要求3的一種篩選人組織相容性抗原(HLA)的T細(xì)胞表面抗原肽的方法，所述的可以被T細(xì)胞受體(TCR)識(shí)別的T細(xì)胞抗原表位肽為HLA-B7，序列為SPSVDKARAEL。
6.如權(quán)利要求3的一種篩選人組織相容性抗原(HLA)的T細(xì)胞表面抗原肽的方法，所述的可以被T細(xì)胞受體(TCR)識(shí)別的T細(xì)胞抗原表位肽序列為SPAVDKAQAEL。
7.權(quán)利要求4、5或6中的HLA抗原上的T細(xì)胞抗原表位肽用于制備MHC四聚體或多聚體，并用于特異性檢測(cè)同種組織、器官移植患者體內(nèi)具排斥所移植組織、器官功能的T細(xì)胞，從而可用于檢測(cè)同種移植排斥、并指導(dǎo)臨床合理使用免疫抑制劑。
全文摘要
本發(fā)明屬生物醫(yī)藥領(lǐng)域，是關(guān)于一種篩選人組織相容性抗原(HLA)的T細(xì)胞表面抗原肽的體系，及其在制備MHC－抗原肽多聚體中的應(yīng)用。利用該組抗原肽制備的MHC－肽四聚體(MHC tetramer)可用于同種移植排斥反應(yīng)的監(jiān)測(cè)，并指導(dǎo)臨床合理使用免疫抑制劑。
文檔編號(hào)A61K38/17GK1511958SQ0215997
公開(kāi)日2004年7月14日 申請(qǐng)日期2002年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月31日
發(fā)明者徐小寧, 王小寧 申請(qǐng)人:王小寧