專利名稱：支鏈聚乙二醇-集成干擾素復(fù)合物及制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用支鏈PEG對(duì)集成干擾素及其突變體進(jìn)行化學(xué)修飾以制備支鏈PEG-干擾素復(fù)合物，以及這種復(fù)合物的凍干制劑和水針劑。
背景技術(shù)：
各種天然和重組蛋白質(zhì)具有治療作用，一旦將他們純化、分離并制備成藥物，就可以將它們經(jīng)非腸道途徑進(jìn)行給藥，而用于不同的醫(yī)療適應(yīng)癥。然而，非腸道途徑給藥的蛋白質(zhì)具有免疫原性，且血漿半衰期較短，因此，難以使藥用蛋白質(zhì)在患者體內(nèi)達(dá)到有治療作用的血藥濃度。
通過(guò)將蛋白質(zhì)與高分子聚合物結(jié)合成復(fù)合物，可以有效的克服這些難題。Davis等在美國(guó)專利4,179,337中公開(kāi)了將聚乙二醇(PEG)與蛋白質(zhì)諸如酶和胰島素結(jié)合以獲得具有生理活性的復(fù)合物的技術(shù)方案。Veronese等(《實(shí)用生物化學(xué)和生物技術(shù)》(Applied Biochemand Biotech)11141-152，1985)公開(kāi)了用氯甲酸苯酯使聚乙二醇活化以修飾核糖核酸酶和超氧化物歧化酶的技術(shù)方案。Katre等在美國(guó)專利4,766,106和4,917,888中還公開(kāi)了通過(guò)聚合物結(jié)合重組蛋白質(zhì)使蛋白質(zhì)增溶的技術(shù)方案。同樣，可以將PEG和其他聚合物與重組蛋白質(zhì)結(jié)合以便降低免疫原性并延長(zhǎng)半衰期，參見(jiàn)Nitecki等在美國(guó)專利4,902,502，；Enzon在國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/US 990/02133；Nishimur等在歐洲專利申請(qǐng)154,316和Tomasi在國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/US85/02572中所述。眾所周知的α干擾素可有效的治療急性和慢性乙型肝炎，卡波西肉瘤，黑色素瘤等疾病，提高α干擾素的血漿半衰期可以提高對(duì)這些疾病的治療作用。
以往公開(kāi)的PEG-干擾素復(fù)合物存在幾個(gè)問(wèn)題，其一是PEG的結(jié)合使干擾素的生物活性降低，在使用中必須提高干擾素的劑量。另外，在形成PEG-干擾素結(jié)合物時(shí)所用的某些連接鍵可能在體內(nèi)水解斷裂，使復(fù)合物失去了由PEG帶來(lái)的優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
支鏈PEG-干擾素復(fù)合物是以共價(jià)鍵方式與PEG分子連接的干擾素分子。集成干擾素是通過(guò)測(cè)定天然干擾素分子的共有序列而確定的重組干擾素分子，又稱復(fù)合干擾素；consensus IFN；IFN-con。集成干擾素的突變體包括第6位氨基酸突變?yōu)楣劝彼?；?1為氨基酸突變?yōu)樘於彼?；?62位氨基酸突變?yōu)榻z氨酸；第165位氨基酸突變?yōu)榻z氨酸以及上述4個(gè)突變位點(diǎn)的組合突變情況。
支鏈PEG是帶有兩條聚乙二醇長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu)的分子，由于聚合物是以帶有鏈長(zhǎng)分布的混合物的形式制備的，因此，通常不能得到有精確和均勻分子量的聚合物，對(duì)其分子量的描述一般是指其平均分子量。這種聚合物的制備方法在本研究領(lǐng)域內(nèi)是眾所周知的。
按照本發(fā)明，PEG-IFN可按如下方法制備用末端活化的支鏈PEG與集成干擾素中的一個(gè)或多個(gè)自由氨基反應(yīng)，形成一個(gè)共價(jià)鍵連接，使集成干擾素至少保持部分生物活性而免疫原性降低，且這種共價(jià)連接使PEG干擾素復(fù)合物在體內(nèi)不易水解斷裂。當(dāng)支鏈PEG與集成干擾素反應(yīng)時(shí)，可能得到的是不同產(chǎn)物的混合物。這些產(chǎn)物是由于PEG可以與一個(gè)或多個(gè)自由氨基反應(yīng)形成的。這些產(chǎn)物可以用如下通式表示 由于混合物中不同的產(chǎn)物具有不同的分子量及等電點(diǎn)，這些產(chǎn)物可用傳統(tǒng)的分離方法如色譜法進(jìn)行分離。M＝1時(shí)，同一個(gè)自由氨基結(jié)合形成的單PEG化的復(fù)合物是本發(fā)明的優(yōu)選方案。盡管集成干擾素有多個(gè)自由氨基，可以通過(guò)控制試劑濃度和反應(yīng)條件得到單PEG化的產(chǎn)物。
當(dāng)將單一集成干擾素分子與單一支鏈PEG結(jié)合時(shí)，所得的復(fù)合物可以是位點(diǎn)異構(gòu)物得混合物形式?！拔稽c(diǎn)異構(gòu)物的混合物”是指可以在不同集成干擾素分子的不同氨基酸位點(diǎn)連接的各個(gè)支鏈PEG-干擾素的混合物。例如在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，PEG-干擾素混合物含有至少一種在干擾素分子的組氨酸殘基上連接的PEG-干擾素復(fù)合物，同時(shí)另一種PEG-干擾素復(fù)合物中，支鏈PEG被連接在干擾素分子的另一個(gè)位點(diǎn)(如賴氨酸殘基)凍干法是一種對(duì)蛋白質(zhì)類藥物冷凍干燥的方法，將冷凍的含水混合物進(jìn)行處理以處去水分。一般說(shuō)來(lái)，凍干過(guò)程包括通常在減壓條件下使水分升華的步驟。凍干后，可以將蛋白質(zhì)類藥物長(zhǎng)期保存。然而，PEG-集成干擾素復(fù)合物在凍干過(guò)程中會(huì)受到破壞，如蛋白質(zhì)的損耗，生物活性的喪失和復(fù)合物的降解。
按照本發(fā)明，將PEG-干擾素復(fù)合物加入適當(dāng)?shù)闹苿┲校梢允蛊湓趦龈蛇^(guò)程中免受破壞，本發(fā)明不限定于特定的制劑，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，除PEG-干擾素復(fù)合物外，還使用了緩沖體系，等滲劑，穩(wěn)定劑，凍干保護(hù)劑。
緩沖體系適合于將所述制劑的pH維持在5.5～6.5的范圍，優(yōu)選的緩沖體系為醋酸鈉-醋酸緩沖系統(tǒng)，其pH值為6.0，濃度為0.005～0.1M。等滲劑用于調(diào)節(jié)注射劑的滲透壓和血液的滲透壓相同或接近，優(yōu)選的等滲劑為0.7％的氯化鈉。
穩(wěn)定劑可以避免PEG-干擾素復(fù)合物吸附于用來(lái)儲(chǔ)存的玻璃表面上，本發(fā)明將聚(氧-1，2-乙二基)衍生物作為穩(wěn)定劑。聚(氧-1，2-乙二基)單-9-十八烯酸酯衍生物是一種優(yōu)選的穩(wěn)定劑，優(yōu)選濃度為0.01～1mg/ml。
凍干保護(hù)劑是保護(hù)化合物，細(xì)胞或組織免受凍干過(guò)程中有害影響的試劑，就PEG-集成干擾素而言，凍干保護(hù)劑可以保護(hù)他們免受來(lái)自凍干過(guò)程中的真空條件的破壞、吸附和損耗。本發(fā)明的凍干保護(hù)劑包括但不限于碳水化合物、糖醇、表面活性劑及蛋白質(zhì)。優(yōu)選的凍干保護(hù)劑是白蛋白。
根據(jù)本發(fā)明，將PEG-干擾素加入適當(dāng)?shù)闹苿┲?，可以使其可以長(zhǎng)期在水溶液中保存而不失去其生物活性。本發(fā)明不限于特定制劑，在優(yōu)選實(shí)施方案中PEG-干擾素水針劑包括緩沖體系，等滲劑，穩(wěn)定劑和溶劑。優(yōu)選的緩沖體系為醋酸鈉-醋酸緩沖系統(tǒng)，其pH值為6.0，濃度為0.005～0.1M。等滲劑用于調(diào)節(jié)注射劑的滲透壓和血液的滲透壓相同或接近，優(yōu)選的等滲劑為0.7％的氯化鈉。溶劑為注射用水。
實(shí)施例1取6mg/ml集成干擾素，以5mM醋酸鈉緩沖液(pH5.0)，0.12M氯化鈉透析。按蛋白質(zhì)PEG為1∶3的摩爾比加入活化的支鏈PEG試劑，加入0.5M氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH到9.0，在4℃條件下反應(yīng)2小時(shí)，加入5％的pH7.5的1M甘氨酸終止反應(yīng)。3～5分鐘后，加入10倍體積50mM的醋酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)pH到4.5。將樣品上羧甲基纖維素柱(Waterman CM-52，)，以5倍體積pH4.5的醋酸鈉緩沖液洗滌柱子后，PEG-集成干擾素和未結(jié)合PEG的干擾素分別用含0.2M氯化鈉和0.4M氯化鈉的醋酸鈉緩沖液洗脫。280nm處紫外吸收檢測(cè)，收集含PEG-集成干擾素的洗脫峰，以SDS-PAGE檢測(cè)。
以Sephacryl S-200分子排阻色譜對(duì)PEG-集成干擾素進(jìn)一步純化，并更換緩沖體系，280nm處紫外吸收檢測(cè)，收集含PEG-集成干擾素的洗脫峰，以SDS-PAGE檢測(cè)。加入凍干保護(hù)劑和穩(wěn)定劑，凍干后儲(chǔ)存。最終凍干粉中的成分如下成分 mg/小瓶PEG-集成干擾素 0.1醋酸鈉 0.75多乙氧基醚 0.05氯化鈉 0.007白蛋白 0.01
實(shí)施例2取6mg/ml集成干擾素，以5mM醋酸鈉緩沖液(pH5.0)，0.12M氯化鈉透析。按蛋白質(zhì)PEG為1∶3的摩爾比加入活化的支鏈PEG試劑，加入0.5M氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH到9.0，在4℃條件下反應(yīng)2小時(shí)，加入5％的pH7.5的1M甘氨酸終止反應(yīng)。3～5分鐘后，加入10倍體積50mM的醋酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)pH到4.5。將樣品上羧甲基纖維素柱(Waterman CM-52，)，以5倍體積pH4.5的醋酸鈉緩沖液洗滌柱子后，PEG-集成干擾素和未結(jié)合PEG的干擾素分別用含0.2M氯化鈉和0.4M氯化鈉的醋酸鈉緩沖液洗脫。280nm處紫外吸收檢測(cè)，收集含PEG-集成干擾素的洗脫峰，以SDS-PAGE檢測(cè)。
以Sephacryl S-200分子排阻色譜對(duì)PEG-集成干擾素進(jìn)一步純化，并更換緩沖體系，280nm處紫外吸收檢測(cè)，收集含PEG-集成干擾素的洗脫峰，以SDS-PAGE檢測(cè)。最終水針劑中的成分如下成分 比例PEG-集成干擾素 0.1mg/ml醋酸鈉 0.05mM苯乙醇 0.05％氯化鈉 0.7％
權(quán)利要求
1.一種支鏈PEG-干擾素復(fù)合物。
2.權(quán)利要求1的復(fù)合物，其中所述的支鏈PEG具有以下結(jié)構(gòu)
3.權(quán)利要求2的復(fù)合物，其中所述的支鏈PEG分子量為10000，20000或40000
4.權(quán)利要求3的復(fù)合物，其中所述的干擾素分子選自下列物質(zhì)組成集成干擾素及其突變體。集成干擾素的突變體包括第6位氨基酸突變?yōu)楣劝彼?；?1為氨基酸突變?yōu)樘於彼?；?62位氨基酸突變?yōu)榻z氨酸；第165位氨基酸突變?yōu)榻z氨酸以及上述4個(gè)突變位點(diǎn)的組合突變情況。
5.權(quán)利要求4的復(fù)合物，其中所述的支鏈PEG-干擾素復(fù)合物包括與單一干擾素分子結(jié)合的單一支鏈PEG分子。
6.權(quán)利要求5的制劑，其中所述的支鏈PEG-干擾素復(fù)合物包括位置異構(gòu)的混合物。
7.一種含水制劑，包括支鏈PEG-干擾素復(fù)合物，緩沖體系，等滲劑，穩(wěn)定劑，凍干保護(hù)劑和溶劑。
8.權(quán)利要求7的制劑，其中所述的緩沖體系是醋酸鈉，等滲劑是氯化鈉，穩(wěn)定劑是聚(O-1，2-乙二基)衍生物，凍干保護(hù)劑是白蛋白且溶劑是注射用水。
9.權(quán)利要求8的制劑，其中所述的支鏈PEG-集成干擾素復(fù)合物的濃度為0.01～lmg/ml；所述的醋酸鈉的濃度為0.005～0.1M；氯化鈉濃度為0.6％～0.8％；所述白蛋白濃度為0.1％～5％；
10.一種凍干方法，該方法包括凍干權(quán)利要求9的制劑以便生成凍干粉的步驟
11.一種凍干粉，通過(guò)凍干權(quán)利要求10的制劑生產(chǎn)。
12.一種含水制劑，包括支鏈PEG-干擾素復(fù)合物，緩沖體系，等滲劑，穩(wěn)定劑和溶劑。
13.權(quán)利要求12的制劑，其中所述的緩沖劑是醋酸鈉，等滲劑是氯化鈉，穩(wěn)定劑是苯乙醇且溶劑是注射用水。
14.權(quán)利要求13的制劑，其中所述的支鏈PEG-干擾素復(fù)合物的濃度為0.1～1mg/ml；所述的醋酸鈉的濃度為0.005～0.1M；氯化鈉濃度為0.6％～0.8％；苯乙醇濃度為0.1％；
全文摘要
本發(fā)明涉及用支鏈PEG對(duì)干擾素進(jìn)行化學(xué)修飾以制備支鏈PEG－干擾素復(fù)合物，以及這種復(fù)合物的凍干劑和水針劑。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1511848SQ0215995
公開(kāi)日2004年7月14日 申請(qǐng)日期2002年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月30日
發(fā)明者田浤, 張然, 劉金毅, 孫儉波, 程永慶, 田 申請(qǐng)人:北京三元基因工程有限公司