新型抗體的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及兼具高親和力與高效價的新型抗體，特別是針對新型表位的新型抗 體。
【背景技術(shù)】
[0002] 本發(fā)明涉及組合高親和力與高效價的新型抗CD3抗體，并且具體來說是特異性識 別新型CD3表位的新型抗體。
[0003] T細胞受體或TCR是一種見于T淋巴細胞（或T細胞）表面上的負責識別抗原遞 呈細胞（APC)表面上結(jié)合于主要組織相容性復合物（MHC)分子的抗原的分子。TCR與抗原 之間的結(jié)合具有相對較低親和力。當TCR與抗原和MHC嚙合時，T淋巴細胞通過一系列由相 關(guān)酶、共受體、專門化輔助分子以及活化或釋放的轉(zhuǎn)錄因子介導的生物化學事件而被活化。
[0004] TCR與如⑶3的其它分子締合，所述⑶3具有在哺乳動物中的三種不同鏈（γ、δ 和ε)以及ζ 2(⑶247)復合物或ζ/ri復合物。這些輔助分子具有跨膜區(qū)域，并且對將 信號從TCR傳送至細胞中至關(guān)重要；TCR的細胞質(zhì)尾部極短，從而使得它不可能參與信號傳 導。⑶3鏈和ζ鏈連同TCR-起形成稱為T細胞受體復合物的復合物。
[0005] ⑶3 ε是在某些T細胞的表面上表達的I型跨膜蛋白質(zhì)。它參與T細胞受體（TCR) 復合物，并且與這個復合物的其它結(jié)構(gòu)域相互作用。這些相互作用伴侶中的一個是⑶3 γ， 其以 1:1化學計量結(jié)合 CD3 ε (De la Hera 等，J.Exp. Med. 1991 ; 173:7-17)。圖 5顯示包括 ⑶3 ε /⑶3 γ的TCR復合物的示意圖。據(jù)信TCR結(jié)合抗原遞呈細胞（APC)表面上的MHC-肽 復合物以及隨后T細胞沿APC移動會導致TCR復合物發(fā)生某一旋轉(zhuǎn)，從而導致CD3 ε和 CD3 γ相對于彼此錯位，此為高效TCR信號傳導以及因此活化T細胞所需。針對CD3 ε的 某些抗體已被證明會誘導TCR信號傳導，而其它抗體不會。TCR活化性抗體通常結(jié)合⑶3 ε 上的暴露表位（參見圖5, "激動性表位"），而一些非刺激性抗體已被證明會結(jié)合⑶3 ε與 ⑶3 γ之間的界面，或相伴結(jié)合⑶3 ε和⑶3 γ (參見圖5, "拮抗性表位"），因此可能干擾 CD3 ε 和 CD3 γ 的相對位移（Kim 等，JBC. 2009 ; 284:31028-31037)。
[0006] 明確確定的是肽-MHC復合物以低親和力和快速解離速率結(jié)合TCR (Matsui 等，Science. 1991 ;254:1788-1791 ;Weber 等，Nature. 1992 ;356:793-796)。已表明 這個低親和力有助于允許少許肽-MHC復合物通過反復結(jié)合和解離來連續(xù)觸發(fā)許多 TCR(Valitutti等，Nature. 1995 ;375:148-151)。這個連續(xù)觸發(fā)對隨時間持續(xù)信號傳 導，從而允許T細胞最終達到活化閾值是關(guān)鍵的（Valitutti等，Immunol. Today. 1997 ; 18:299-304 ;Lanzavecchia等，Cell. 1999 ;96:1-4)。這個見解由以下研究結(jié)果支持：當 相較于肽-MHC復合物時，高親和力抗CD3抗體不高效刺激T細胞，因為它們以1:1化學計 量觸發(fā)TCR(Viola等，Science 1996 ;273:104-106)，從而表明低親和力抗體由于能夠反 復解離以及再結(jié)合⑶3 ε而可更有效通過TCR信號傳導來刺激T細胞。實際上，在直接比 較抗CD3 ε抗體TR66的三種全都以不同親和力進行結(jié)合的衍生物時，具有中等親和力的 野生型TR66在相較于它的具有較高或較低親和力的衍生物時，在T細胞活化方面顯示最 佳功效（Bortoletto 等，J. Immuno. 2002 ;32:3102-3107)。因此，處于 TR66 的 Kd附近的 Kd 對于刺激T細胞是理想的。已通過使用表面等離子體共振（SPR)技術(shù)以及通過流式細胞 計量術(shù)來測定TR66的親和力，分別得到平衡解離常數(shù)2. 6X 10 7M(Moore等，Blood. 2011 ; 117:4542-4551)和 1.0 X 10 7M(Amann 等，Cancer Res. 2008 ;68:143-151)。與此一致，已 推薦使用親和力小于10 8M的抗⑶3抗體（US 7, 112, 324)，并且已被公開供人治療使用的T 細胞刺激性抗體以在相同范圍內(nèi)的對人CD3 ε的親和力進行結(jié)合。因此，根據(jù)連續(xù)TCR觸 發(fā)的理論，并且與抗CD3 ε抗體的公開結(jié)果一致，親和力顯著優(yōu)于公開親和力的單克隆抗 體不被預期是更強力T細胞刺激劑，而是相反被預期是更弱活化劑。
[0007] 已通過用所謂雜交瘤程序，用T細胞制劑使動物免疫，以及隨后分離單克隆抗體 來產(chǎn)生一些針對CD3 ε的公開抗體。這個方法的弱點在于一方面動物中針對外來（人）T細 胞的各種抗原的不選擇性免疫應答以及另一方面雜交瘤程序的不良效率使鑒定具有T細 胞刺激性活性的單克隆抗體的概率降低，同時因為這些激動性抗體可能占抗CD3 ε抗體整 體中的少數(shù)。用跨越靶向表位的線性肽進行免疫使免疫應答的選擇性增加，然而，可產(chǎn)生不 識別天然全長CD3 ε或可施加非最優(yōu)TCR刺激的抗體。
[0008] 對于用其它I型跨膜蛋白質(zhì)使動物免疫，已特別適用的是使用純化細胞外結(jié)構(gòu)域 (ECD)。然而，CD3 ε的純化ECD傾向于聚集，并且聚集體相較于天然蛋白質(zhì)可具有改變的結(jié) 構(gòu)。此外，這個方法可優(yōu)先產(chǎn)生結(jié)合⑶3 ε與⑶3 γ之間的界面的抗體。相比之下，⑶3 ε 和CD3 γ的以單鏈蛋白質(zhì)形式產(chǎn)生，由可撓性肽連接體連接的復合物可以單體部分形式以 及以它的天然構(gòu)象加以純化（Kim等，JMB. 2000;302:899-916)。然而，用所述⑶3 ε/γ單 鏈蛋白質(zhì)使動物免疫可產(chǎn)生相伴結(jié)合CD3e和CD3y的抗體，此將導致拮抗作用。
[0009] 過去已開發(fā)針對人⑶3 ε的若干抗體。
[0010] 單克隆抗體SP34是一種與非人靈長類動物⑶3交叉反應，并且也能夠誘導人 和非人靈長類動物PBMC的細胞增殖的鼠類抗體（Pessano等，The Τ3/Τ cell receptor complex:antigenic distinction between the two 2〇-kD T3 (T3 δ and T3 ε) subunits. EMBO J 4(1985)337 - 344)。
[0011] 轉(zhuǎn)讓至 Micromet 的 WO 2007/042261 和 WO 2008/119567 兩件申請公開了針對 CD3 ε中的分別表位FSEXE和QDGNE的交叉反應性結(jié)合劑。在由反對所授予的歐洲專利EP 2 155783(基于WO 2008/119567的區(qū)域性時期）的若干異議者提交的異議程序中，提出 SP34也結(jié)合表位QDGNE。
[0012] 然而，盡管已進行許多嘗試來解決獲得具有特別有利性質(zhì)的抗CD3抗體或一般來 說結(jié)合分子的問題，但迄今為止這些嘗試已取得的成功是有限的。
[0013] 因此，對開發(fā)就獲得高效價不具有限制性的高親和力來說新型CD3結(jié)合分子，具 體來說新型抗CD3抗體仍然存在巨大未滿足的需要。另外，對開發(fā)就高親和力來說新型CD3 結(jié)合分子，具體來說新型抗 CD3抗體仍然存在巨大未滿足的需要，所述結(jié)合分子與其它物 種，具體來說與如食蟹獼猴的非人靈長類動物具有交叉反應性。
[0014] 迄今為止先前技術(shù)尚未實現(xiàn)或建議這個問題的已由本發(fā)明提供的解決方案，即 CD3結(jié)合分子，具體來說通過使兔遺傳免疫，以及篩選親和力成熟的記憶B細胞獲得的抗 CD3抗體，以及具體來說對新型激動性表位具有特異性的CD3結(jié)合分子，具體來說抗CD3抗 體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015] 本發(fā)明涉及新型分離的CD3結(jié)合分子，具體來說分離的抗體或其功能性片段，各 自包含結(jié)合區(qū)域，特別是抗原結(jié)合區(qū)域，其中所述結(jié)合分子，具體來說所述抗體或其功能性 片段對人CD3的表位，特別是對CD3 ε的新型激動性表位具有特異性，其中所述結(jié)合分子， 具體來說所述分離的抗體或其功能性片段比先前技術(shù)抗體，特別是0ΚΤ-3和/或TR66具有 更高親和力，同時展現(xiàn)較高效價。
[0016] 因此，在第一方面，本發(fā)明涉及一種包含對人⑶3 ε的表位具有特異性的結(jié)合區(qū) 域的分離的結(jié)合分子，具體來說涉及一種包含抗原結(jié)合區(qū)域的分離的抗體或其功能性片 段，其中所述表位包含氨基酸殘基M作為對結(jié)合關(guān)鍵的殘基。
[0017] 在第二方面，本發(fā)明涉及一種對人CD3的表位具有特異性的新型分離的CD3結(jié)合 分子，其中所述分離的CD3結(jié)合分子結(jié)合人CD3的單價結(jié)合解離常數(shù)小于3. 0 X 10 SM，具體 來說小于I. 5 X 10 SM，更具體來說小于I. 2 X 10 SM，并且最具體來說小于I. 0 X 10 SM，具體來 說涉及一種包含對人CD3的表位具有特異性的抗原結(jié)合區(qū)域的分離的抗體或其功能性片 段，其中所述抗體或其功能性片段結(jié)合人CD3的單價結(jié)合解離常數(shù)小于3. 0 X 10 SM，具體來 說小于I. 5 X 10 SM，更具體來說小于I. 2 X 10 SM，并且最具體來說小于I. 0 X 10 SM。
[0018] 在第三方面，本發(fā)明涉及一種包含對人CD3的表位具有特異性的抗原結(jié)合區(qū)域的 分離的抗體或其功能性片段，其中所述抗體或其功能性片段在以IgG形式測試時，在交聯(lián) 后，在IgG濃度1. 25 μ g/ml下刺激24小時之后，誘導的T細胞活化比抗體0KT-3或TR66 強烈至少為其1.5倍。
[0019] 在第四方面，本發(fā)明涉及一種包含對人CD3的表位具有特異性的抗原結(jié)合區(qū)域的 分離的抗體或其功能性片段，其中所述抗體或其功能性片段在以IgG形式測試時，在交聯(lián) 后，導致T細胞活化持續(xù)長于抗體0KT-3或TR66,如通過在IgG濃度1. 25 μ g/ml下刺激72 小時之后⑶69表達增加至少1. 5倍大所指示。
[0020] 在第五方面，本發(fā)明涉及一種包含對人CD3的表位具有特異性的抗原結(jié)合區(qū)域的 分離的抗體或其功能性片段，其中所述抗體或其功能性片段在以IgG形式測試時，在交聯(lián) 后，導致T細胞的劑量依賴性均質(zhì)活化狀態(tài)。
[0021] 在第六方面，本發(fā)明涉及一種包含對人CD3的表位具有特異性的抗原結(jié)合區(qū)域的 分離的抗體或其功能性片段，其中所述抗體或其功能性片段在以IgG形式測試時，（i)結(jié) 合人⑶3的單價結(jié)合解離常數(shù)小于3. 0 X 10 SM，具體來說小于I. 5 X 10 SM，更具體來說小于 I. 2 X 10 SM，并且最具體來說小于1.0 X 10 8M ;以及（iia)在交聯(lián)后，在IgG濃度1. 25 μ g/ml 下刺激24小時之后，誘導的T細胞活化比抗體0KT-3或TR66強烈至少I. 5倍；（iib)導致 T細胞活化持續(xù)長于抗體0KT-3或TR66,如通過在IgG濃度1. 25 μ g/ml下刺激72小時之 后CD69表達增加至少1. 5倍大所指示；（iic)導致T細胞的劑量依賴性均質(zhì)活化狀態(tài)；和 /或（iid)對人CD3 ε的表位具有特異性，其中所述表位包含氨基酸殘基M作為對結(jié)合關(guān) 鍵的殘基。
[0022] 在第七方面，本發(fā)明涉及一種與章節(jié)[0078]至[0080]、[0083]至[0085]以及 [0089]的分離的抗體或其功能性片段結(jié)合基本上相同表位的分離的結(jié)合分子，特別是分離 的抗體或其功能性片段。
[0023] 在第八方面，本發(fā)明涉及一種藥物組合物，其包含本發(fā)明的結(jié)合分子結(jié)合分子，具 體來說分離的抗體或其功能性片段，以及任選藥學上可接受的載體和/或賦形劑。
[0024] 在第九方面，本發(fā)明涉及編碼本發(fā)明的結(jié)合分子，具體來說分離的抗體或其功能 性片段的一種核酸序列或核酸序列的集合。
[0025] 在第十方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的核酸序列或核酸序列的集合的一種載體或 載體的集合。
[0026] 在第^^一方面，本發(fā)明涉及一種包含本發(fā)明的核酸序列或核酸序列的集合、或本 發(fā)明的載體或載體的集合的宿主細胞，特別是表達宿主細胞。
[0027] 在第十二方面，本發(fā)明涉及一種用于產(chǎn)生本發(fā)明的結(jié)合分子，具體來說分離的抗 體或其功能性片段的方法，其包括使以下表達的步驟：本發(fā)明的核酸序列或核酸序列的集 合、本發(fā)明的載體或載體的集合、或本發(fā)明的宿主細胞，特別是表達宿主細胞。
[0028] 在第十三方面，本發(fā)明涉及一種用于產(chǎn)生本發(fā)明的分離的抗體或功能性抗體片段 的方法，其包括以下步驟： a) 用⑶3 ε表達性質(zhì)粒使兔免疫以在宿主細胞的表面上呈現(xiàn)天然全長⑶3 ε ; b) 使用熒光激活的細胞分選來克隆分離與CD3 ε / γ單鏈相互作用的親和力成熟的記 憶B細胞； c) 在不需要分選克隆的永生化的共培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)單一分選的B細胞； d) 在細胞基ELISA中篩選B細胞培養(yǎng)物上清液以鑒定結(jié)合T細胞表面上包埋在TCR復 合物中的天然CD3 ε的抗體。
[0029] 在第十四方面，本發(fā)明涉及人⑶3 ε的一種特定表位，其僅包含⑶3 ε的不位于 ⑶3 ε與⑶3γ之間的界面中，并且仍然可在T細胞上表達的天然TCR的情形下由抗體結(jié)合 的氨基酸殘基，由本發(fā)明的交聯(lián)抗體對所述表位的結(jié)合在IgG濃度1. 25 μ g/ml下刺激24 小時之后，誘導的T細胞活化比抗體0KT-3或TR66強烈至少1. 5倍；（iib)導致T細胞活 化持續(xù)長于抗體0KT-3或TR66,如通過在IgG濃度1. 25 μ g/ml下刺激72小時之后⑶69表 達增加至少1. 5倍大所指示；和/或（iic)導致T細胞的劑量依賴性均質(zhì)活化狀態(tài)。
[0030] 在第十五方面，本發(fā)明涉及一種用于鑒定包含對人⑶3 ε的新型表位具有特異性 的結(jié)合區(qū)域的結(jié)合分子的方法，其包括以下步驟：(a)從一種或多種結(jié)合人CD3的分子選擇 至少一種包含對人CD3 ε的表位具有特異性的結(jié)合區(qū)域的結(jié)合分子，其中所述表位包含氨 基酸殘基M作為對結(jié)合關(guān)鍵的殘基。
【附圖說明】
[0031] 圖1顯示來自單克隆兔抗體的聯(lián)合VH和VL⑶R序列的系統(tǒng)發(fā)生簇聚；
[0032] 圖2顯示純化單克隆兔抗體與Jurkat T細胞的結(jié)合。
[0033] 圖3顯示由交聯(lián)抗⑶3 ε mAb對⑶69表達的刺激。通過測量⑶69表達來評估純 化單克隆兔抗CD3抗體和比較物抗體TR66和0KT-3誘導T細胞活化的潛力。三種不同濃 度的交聯(lián)抗體用于刺激Jurkat細胞，并且24小時后通過流式細胞計量術(shù)評估CD69表達。 抗體濃度是 1. 25 μ g/ml (a)、5. 0 μ g/ml (b)和 20 μ g/ml (c)。
[0034] 圖4顯示由交聯(lián)兔mAb隨時間對⑶69的刺激。通過測量⑶69表達來評估純化單克 隆兔抗CD3抗體誘導T細胞活化的潛力。交聯(lián)抗體在5. 0 μ g/ml的濃度下用于刺激Jurkat 細胞，并且O、4、15、24、48和72小時后通過流式細胞計量術(shù)評估⑶69表達。對于定性檢測 CD69表達，測量陰性對照以及測試抗體兩者的反映處于幾何平均值的信號強度的平均熒光 強度（MFI)。計算測試抗體與陰性對照之間的MFI差異（AMFI)作為⑶69表達量度。
[0035] 圖5顯示包括⑶3 ε /⑶3 γ的TCR復合物的簡化示意圖。
[0036] 圖6顯示先前技術(shù)抗體的表位定位實驗的結(jié)果：（a)抗體SP34(參見EP 2 155 788的文件歷史）的表位定位；（b)Micromet抗體（參見EP 2 155 788/W0 2008/119567) 的表位定位；圖6顯示單丙氨酸突變體的結(jié)合實驗的結(jié)果，其中給定突變體的結(jié)合降低指 示相應野生型氨基酸殘基用于抗體結(jié)合的相關(guān)性（即低棒條=高度結(jié)合相關(guān)）。
[0037] 圖7顯示本發(fā)明的抗體（克隆02、克隆03、克隆06)的通過ELISA進行的表位定 位實驗的結(jié)果；圖7顯示肽掃描分析中的結(jié)合實驗結(jié)果。用0. 1 μ g/ml各抗體探測源于人 CD3 ε殘基1 - 15的15聚體線性陣列以研究影響與表位結(jié)合的氨基酸特異性，其中各位置 被18種氨基酸（除半胱氨酸之外的所有天然氨基酸）取代。給出ELISA中結(jié)合信號降低， (a)對于各個別取代，以及（b)各位置歷經(jīng)18種不同取代加以平均化。圖7b中的棒條高度 指示相應野生型氨基酸殘基用于抗體結(jié)合的相關(guān)性（即大棒條=高度結(jié)合相關(guān)）。
[0038] 圖8顯示抗CD3 X抗IL5R scDb與Jurkat T細胞和CH0-IL5R細胞的結(jié)合。通過 流式細胞計量術(shù)來評估A)構(gòu)建體1、B)構(gòu)建體2和C)構(gòu)建體3與Jurkat T細胞和CD3陰 性Jurkat細胞的結(jié)合，以及D)構(gòu)建體1、E)構(gòu)建體2和F)構(gòu)建體3與IL5R-CH0細胞以及 野生型CHO細胞的結(jié)合。構(gòu)建體1、構(gòu)建體2和構(gòu)建體3具有相同抗IL5R部分，但3個不 同抗CD3部分以不同親和力（I. 15X 10 8M(對于構(gòu)建體I)、2. 96X 10 8M(對于構(gòu)建體2)和 I. 23X IO-7M(對于構(gòu)建體3))結(jié)合CD3 ;構(gòu)建體1 =包含克隆06的人源化可變結(jié)構(gòu)域；構(gòu) 建體2 =包含克隆02的人源化可變結(jié)構(gòu)域；構(gòu)建體3 =包含克隆03的人源化可變結(jié)構(gòu)域