專利名稱：含有皂苷和固醇的疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的疫苗配方及其制備方法和在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。本發(fā)明特別涉及那些含有一種抗原，一種來(lái)源于Quillaja Saponaria Molina樹(shù)皮的免疫活性組分如QS21，以及一種固醇的疫苗。
背景技術(shù)：
來(lái)源于南美洲的Quillaja Saponaria Molina樹(shù)皮的免疫活性的皂苷組分具有佐劑的活性是本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的。比如QS21(也稱為QA21)，一種HPLC純化的來(lái)源于Quillaja Saponaria Molina樹(shù)的組分及其制備方法公開(kāi)于(作為QA21)美國(guó)專利5,057,540中。皂樹(shù)皮皂苷作為佐劑也已由Scott等人披露(Int.Archs.Allergy Appl.Immun.，1985，77，409)。然而，QS21用作佐劑卻伴隨著某些缺憾。例如，將QS21作為游離分子注射入哺乳動(dòng)物時(shí)，可以發(fā)現(xiàn)壞死，也就是說(shuō)在注射部位發(fā)生了局部組織壞死。
現(xiàn)已意外地發(fā)現(xiàn)，在注射部位的壞死可以通過(guò)使用含有QS21和固醇相組合的制劑而得以避免。優(yōu)選的固醇包括β-谷固醇，豆固醇，麥角固醇，麥角鈣化(固)醇和膽固醇。這些固醇是本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的，比如膽固醇作為一種天然的發(fā)現(xiàn)于動(dòng)物脂肪的固醇見(jiàn)于默克索引(Merck Index)，第11版，341頁(yè)。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的第一個(gè)方面是提供一種含有抗原，免疫活性的皂苷組分和固醇的疫苗組合物。本發(fā)明的組合物優(yōu)選地含有大體上純的免疫活性皂苷組分。本發(fā)明的組合物優(yōu)選地含有大體上純的QS21，也就是說(shuō)該QS21是至少90％純的，優(yōu)選地是95％純的而最優(yōu)選地是98％純的。其它在本發(fā)明的組合物中有用的免疫活性皂苷組分包括QA17/QS17。含有QS21和膽固醇的本發(fā)明組合物相比于無(wú)膽固醇的組合物表現(xiàn)出了降低的反應(yīng)原性，而其佐劑的效果卻不變。此外，已知該QS21在pH約為7或更高的堿性環(huán)境中降解。本發(fā)明還有一個(gè)優(yōu)越性是QS21在含有膽固醇的配方中對(duì)堿介導(dǎo)的水解的穩(wěn)定性增強(qiáng)。
本發(fā)明優(yōu)選的組合物是形成了脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)的那些。那些其中的固醇/免疫活性皂苷組分形成了ISCOM結(jié)構(gòu)的組合物也構(gòu)成了本發(fā)明的一個(gè)方面。
QS21∶固醇的比率通常為1∶100到1∶1的重量比(W/W)。優(yōu)選固醇過(guò)量存在，而QS21∶固醇的比率至少為1∶2W/W。用于對(duì)人類給藥的疫苗中，QS21和固醇通常是以每劑量大約1微克到100微克的范圍，優(yōu)選地為大約10微克到50微克的范圍存在。
該脂質(zhì)體優(yōu)選地含有中性脂，如磷脂酰膽堿，其優(yōu)選地在室溫下是非晶態(tài)的，如蛋黃磷脂酰膽堿，二油酰磷脂酰膽堿或二月桂酰磷脂酰膽堿。該脂質(zhì)體也可以含有帶電的脂質(zhì)，其能提高脂質(zhì)體-QS21結(jié)構(gòu)(其中的脂質(zhì)體是由飽和脂所構(gòu)成的)的穩(wěn)定性。在這些情況下，該帶電的脂質(zhì)的量?jī)?yōu)選地為1-20％W/W，最優(yōu)選地為5-10％。固醇對(duì)磷脂的比率為1-50％(mol/mol)，最優(yōu)選地為20-25％。
本發(fā)明的組合物優(yōu)選地含有MPL(3-脫酰單-磷酰類脂A，也稱作3D-MPL)。而作為3種脫-氧-?；膯瘟柞ｎ愔珹和4，5或6?；逆湹幕旌衔锏?D-MPL見(jiàn)于GB 2220211(Ribi)中并由蒙大拿的Ribi免疫化學(xué)公司制備。國(guó)際專利申請(qǐng)92/116556公開(kāi)了一個(gè)優(yōu)選的存在形式。
本發(fā)明的合適的組合物是那些其中的脂質(zhì)體最初是在無(wú)MPL下制備，然后，再加入，優(yōu)選地為100nm的顆粒的MPL。因此，該MPL沒(méi)有包含在囊泡膜內(nèi)(稱為MPL外)。而那些其中的MPL包含在囊泡膜內(nèi)的組合物(稱為MPL內(nèi))也構(gòu)成了本發(fā)明的一個(gè)方面。該抗原可以包含于囊泡膜內(nèi)或外。優(yōu)選地，可溶性抗原是包含于膜外的而疏水性的或者脂化的抗原則既可以包括于膜外又可以包括于膜內(nèi)。
本發(fā)明的疫苗通常無(wú)需任何特殊的載體而可以在水或者其它的藥物可接受的緩沖液中配制。在某些情況下可能有益的是本發(fā)明的疫苗還可以含有明礬或者存在于水包油的乳劑中，或者其它合適的賦形劑內(nèi)，如脂質(zhì)體，微球體或者微囊化的抗原顆粒。
該疫苗配方優(yōu)選地含有一種能夠誘發(fā)可以抵抗人類或者動(dòng)物病原體的免疫反應(yīng)的抗原或者抗原組合物。在本領(lǐng)域已知的抗原或者抗原組合物可以用于本發(fā)明的組合物中，其包括多糖類抗原，源于HIV-1的(如gP120或gP160)，任何貓科動(dòng)物免疫缺陷病毒，人或動(dòng)物瘡疹病毒，如gD或其衍生物或源于HSVI1或HSV2的直接早期蛋白如ICP27，巨細(xì)胞病毒(特別是人)(如gB或其衍生物)，水痘帶狀皰疹病毒(如gPI，II或III)的抗原或者抗原組合物，或者源于諸如乙肝病毒的肝炎病毒的抗原如乙肝表面抗原或其衍生的甲肝病毒，丙肝病毒和戊肝病毒的抗原或者抗原組合物，或者來(lái)源于其它病毒性致病原的抗原，如呼吸道合胞病素(如美國(guó)專利5,149,650中公開(kāi)的HSRV F和G蛋白或其免疫片段或者美國(guó)專利5,194,595中公開(kāi)的含有來(lái)源于HSRV蛋白F和G的免疫片段的嵌合多肽，如FG糖蛋白)，來(lái)源于腦膜炎菌株如甲，乙和丙型腦膜炎，肺炎鏈球菌，人乳頭瘤病毒，流感病毒，B型流感嗜血桿菌(Hib)，EB病毒(EBV)的抗原，或者來(lái)源于細(xì)菌性病原如沙門(mén)氏菌，疏螺旋體屬(例如OspA或OspB或其衍生物)，或者衣原體屬，或者博代桿菌屬如P.69，PT和FHA的抗原，或者來(lái)源于寄生蟲(chóng)如瘧原蟲(chóng)屬或弓形蟲(chóng)屬的抗原。
HSV糖白D(gD)或衍生物是優(yōu)選的疫苗抗原。其位于病毒膜上，并且也見(jiàn)于感染的細(xì)胞的胞質(zhì)中(Eisenberg R.J.等人；病毒學(xué)雜志1980 35 428-435)。其含有包括一個(gè)信號(hào)肽的393個(gè)氨基酸且分子量約為60KD。它可能是所有HSV被膜糖蛋白中特性最優(yōu)者(Cohen等人，病毒學(xué)雜志60 157-166)。已知其在體內(nèi)對(duì)病毒吸附于細(xì)胞膜起著重要的作用。此外，糖蛋白D在體內(nèi)已表現(xiàn)出能誘發(fā)中和抗體并防止動(dòng)物受致命的攻擊。平頭型的gD分子沒(méi)有C末端錨形區(qū)且能夠以可溶蛋白形式在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生，然后再分泌到該細(xì)胞培養(yǎng)的上清液中。該可溶型的gD是優(yōu)選的。平頭型的gD分子的生產(chǎn)見(jiàn)于EP 0139417中。該gD優(yōu)選地來(lái)源于HSV-2。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例是308個(gè)氨基酸平頭型HSV-2糖蛋白D，其含有天然糖蛋白中的氨基酸1-306，并在無(wú)膜錨形區(qū)的平頭型蛋白的C末端加入天冬酰胺和谷氨酰胺。此類蛋白包括信號(hào)肽，而信號(hào)肽裂解后便于該成熟的含有283氨基酸的可溶蛋白從宿主細(xì)胞中分泌出來(lái)。
在本發(fā)明的另一方面，乙肝表面抗原是優(yōu)選的疫苗抗原。
這里用的“乙肝表面抗原”或者‘HBsAg’一詞包括任何HBsAg抗原或其表現(xiàn)出HBV表面抗原的抗原性的片段。可以理解的是，除了該HBsAg抗原的226個(gè)氨基酸(見(jiàn)于Tiollais等人，自然，317,489(1985)及其中的參考文獻(xiàn))外，若需要，這里所述的HBsAg可以包括全部的或者部分的上述參考文獻(xiàn)及EP-A-0278940中所述的一種前-S序列。特別地，該HBsAg可以包括含有一種氨基酸序列的多肽，該氨基酸序列先后分別包括對(duì)應(yīng)于一種近血清型的乙肝病毒的開(kāi)放閱讀框的HBsAg的L-蛋白的12-52殘基、133-145殘基、175-400殘基(此多肽是指L*；見(jiàn)于EP 0414374)。在本發(fā)明的范圍內(nèi)的HBsAg還可以含有EP 0198474(Endotronics)中所述的前-S1-前S2-S多肽或者其嚴(yán)格的如EP 0304578(Mc Cormick和Jones)中所述的類似物。這里所述的HBsAg還能指突變體，比如WO 91/14703或歐洲專利申請(qǐng)0511855 A1中所述‘逃避突變體’，尤其指在其中的145位氨基酸處由精氨酸取代了甘氨酸的HBsAg。
該HBsAg一般是微粒型的。該微?？梢詥为?dú)含有諸如S蛋白或者是組合微粒，如(L*，S)，其中的L*如上文定義而S則指HBsAg的S-蛋白。該微粒最好是以在酵母中表達(dá)的形式。
乙肝表面抗原S-蛋白的制備是有充分的文獻(xiàn)報(bào)道的。例如見(jiàn)于Harford等人(1983)，發(fā)育生物學(xué)規(guī)范(Develop.Biol.Standard)54，125頁(yè)，Gregz等人(1987)，生物技術(shù)，5,479頁(yè)，EP 0226846，EP 0299108及其中的參考文獻(xiàn)。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)的配方還可以含有抗-腫瘤抗原并用于腫瘤的免疫治療。
通常，疫苗的制備見(jiàn)于Voller等人編輯的疫苗新趨勢(shì)和進(jìn)展(Park大學(xué)出版社，巴爾的摩，馬里蘭州，美國(guó)，1978)。在脂質(zhì)體中成囊見(jiàn)于諸如Fullerton，美國(guó)專利4,235,877中。和蛋白質(zhì)結(jié)合成大分子則公開(kāi)于諸如Lkhite，美國(guó)專利4,372,945和Armor等人的美國(guó)專利4,474,757。
將每個(gè)疫苗劑量中的蛋白量定為能在常規(guī)疫苗中誘發(fā)免疫保護(hù)反應(yīng)卻不引起明顯的副作用的量。此量的變化依賴于使用的具體免疫原以及其存在形式。一般地，所期望的是每個(gè)劑量中包含有1-1000微克蛋白，優(yōu)選地為2-100微克，最優(yōu)選地為4-40微克。微粒疫苗的最佳量可以通過(guò)包括檢測(cè)實(shí)驗(yàn)對(duì)象的合適的免疫反應(yīng)在內(nèi)的常規(guī)研究而確定。初次接種后，受試對(duì)象還可以在充分的時(shí)間間隔后再接受一次或者幾次加強(qiáng)接種。
本發(fā)明的配方既可用于預(yù)防，又可用于治療目的。
相應(yīng)地，本發(fā)明還有一個(gè)方面就是提供了本發(fā)明的疫苗的治療病人的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一個(gè)包括對(duì)病人給于有效劑量的本發(fā)明的疫苗的治療方法。本發(fā)明尤其是提供了一個(gè)包括對(duì)病人給于有效劑量的本發(fā)明的疫苗從而治療病毒性的，細(xì)菌性的，寄生蟲(chóng)性的感染或者腫瘤的方法。
下列實(shí)施例和數(shù)據(jù)闡明了本發(fā)明。


圖1用含有或者不含有膽固醇的脂質(zhì)體抑制QS21的比較圖2將20μg QS21在含膽固醇的SUV存在且pH9，37℃下培育16小時(shí)圖3(a)balb/c小鼠用有QS21存在的gD120足墊注射進(jìn)行免疫后，測(cè)定了脾細(xì)胞中胞毒T淋巴細(xì)胞的活性。
圖3(b)balb/c小鼠用有QS21+含有膽固醇的SUV存在的gD120足墊注射進(jìn)行免疫后，測(cè)定了脾細(xì)胞中胞毒T淋巴細(xì)胞的活性。
具體實(shí)施例方式
1.1制備脂質(zhì)體的方法將置于有機(jī)溶劑中的脂質(zhì)(如來(lái)源于蛋黃的或者合成的磷脂酰膽堿)和膽固醇的混合物在真空(或者惰性氣流)下干燥。然后，加入一種水溶液(如磷酸鹽緩沖液)，振蕩該容器直止脂質(zhì)全部進(jìn)入懸濁液中。然后，將該懸濁液微流化直至該脂質(zhì)體大小降至100nm，再通過(guò)0.2μm的濾器進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾。擠壓和聲處理可以代替該步驟。通常，膽固醇∶磷脂酰膽堿的比率是1∶4(W/W)，加入水溶液使膽固醇的終濃度為5-50mg/ml。如果將包含MPL的有機(jī)溶液加入溶于有機(jī)溶液的脂質(zhì)內(nèi)，那么最終的脂質(zhì)體在膜內(nèi)含有MPL(稱為MPL內(nèi))。
將該脂質(zhì)體的大小規(guī)定為100nm并且是指SUV(小單室囊泡)。如果反復(fù)凍融該溶液，那么囊泡融合成大小為500nm至15μm的大的多室結(jié)構(gòu)。該脂質(zhì)體本身是可以長(zhǎng)期穩(wěn)定的且沒(méi)有致融能力。
1.2配制步驟將QS21水溶液加入該脂質(zhì)體中。然后，將該混合物加入到抗原溶液中，并且若需要，還可以含有呈100nm微粒狀的MPL。
1.3含有膽固醇的脂質(zhì)體抑制QS21的溶解活性當(dāng)QS21加入到紅細(xì)胞中時(shí)可以溶解紅細(xì)胞使其釋放血紅蛋白。該溶解活性也可以使用含有存在于膜內(nèi)的膽固醇以及捕獲的熒光染料，羧熒光素的脂質(zhì)體進(jìn)行檢測(cè)-當(dāng)該脂質(zhì)體被溶解時(shí)便釋放染料，而該染料又可用熒光分光鏡進(jìn)行檢測(cè)。若在熒光脂質(zhì)體的膜內(nèi)不含膽固醇，那么不會(huì)觀察到溶解作用。
若在加入到紅細(xì)胞中之前，將該QS21和含有膽固醇的脂質(zhì)體共同培育，那么該紅細(xì)胞的溶解依賴于膽固醇對(duì)QS21的比率而降低。若使用的比率為1∶1，則沒(méi)有檢測(cè)到溶解活性。如果該脂質(zhì)體不含膽固醇，則抑制溶解需要比QS21過(guò)量1000倍的磷脂。
用熒光脂質(zhì)體檢測(cè)溶解活性有同樣的結(jié)果。在圖1中，通過(guò)熒光檢測(cè)了用無(wú)膽固醇(每mg/ml蛋黃磷脂酰膽堿)或含有膽固醇(每mg/ml磷脂酰膽堿，500μg膽固醇)的脂質(zhì)體處理的4μgQS21的溶解活性。
數(shù)據(jù)顯示QS21在膜內(nèi)以特定的方式和膽固醇結(jié)合，從而引起溶解(細(xì)胞的或者熒光脂質(zhì)體的)。如果QS21首先和脂質(zhì)體中的膽固醇結(jié)合，那么不再溶解細(xì)胞或其它脂質(zhì)體。這要求膽固醇∶QS21(W/W)的最低比率為0.5∶1。
膽固醇在水溶液中不溶且也不能形成穩(wěn)定的懸濁液。當(dāng)有磷脂存在時(shí)，該膽固醇存在于磷脂雙分子層中并能形成稱為脂質(zhì)體的穩(wěn)定的囊泡懸濁液。為了避免需要加入磷脂而試驗(yàn)了一個(gè)可溶的衍生物。聚氧乙烷膽固醇癸二酸鹽在水中的溶解能力達(dá)到60mg/ml，然而，既使使用超過(guò)QS21 2000倍的量，也沒(méi)有檢測(cè)到QS21溶解活性的降低。
1.4含有膽固醇的脂質(zhì)體增加了QS21的穩(wěn)定性QS21在pH約為7的環(huán)境中極易水解。該水解作用可以在反相HPLC上通過(guò)檢測(cè)對(duì)應(yīng)于QS21的峰的降低而測(cè)定。例如，圖2表明在pH9的37℃下，16小時(shí)內(nèi)有90％的QS21被水解。如果在該QS21中以2∶1的比率(膽固醇QS21 W/W)加入含有膽固醇的脂質(zhì)體，則在同樣的條件下沒(méi)有檢測(cè)到水解作用。若比率為1∶1，則有10％的QS21被降解。
可以得出結(jié)論的是，當(dāng)QS21和含有膽固醇的脂質(zhì)體結(jié)合時(shí)，其變得極不易受堿介導(dǎo)的水解作用。據(jù)報(bào)道，該水解產(chǎn)物經(jīng)注射給藥，無(wú)佐劑活性，因而，含有QS21的疫苗必需在酸性pH中配制并保藏在4℃以維持佐劑組合物。使用脂質(zhì)體可以避免該項(xiàng)要求。
1.5反應(yīng)原性研究在小鼠脛骨肌注射5μgQS21(或者洋地黃皂苷)和逐步增加量的脂質(zhì)體(以膽固醇的μg表示)。溶解活性表示為相當(dāng)于QS21量(μg)，其含義是要達(dá)到樣品中同樣的溶血作用所需的QS21的量。
處死動(dòng)物后，目測(cè)評(píng)分注射位點(diǎn)的肌肉的充血，壞死和毒性狀況。

數(shù)據(jù)顯示當(dāng)溶解活性由于含有膽固醇的脂質(zhì)體的加入而消除后，源于QS21的毒性也隨之消除。
1.6免肌內(nèi)反應(yīng)原性
U.I./L值





數(shù)據(jù)顯示在配方中加入含有膽固醇的脂質(zhì)體可以顯著地降低QS21所致的CPK(肌酸磷酸激酶)升高。由于CPK的升高是肌肉損傷的量度，所以其意味著肌肉損傷的降低且已經(jīng)組織病毒學(xué)證實(shí)。
1.7脂質(zhì)體-QS21的復(fù)合物和明礬相結(jié)合。
將QS21和含有過(guò)量的膽固醇以及放射性膽固醇的中性脂質(zhì)體一起培育，然后，再和溶于PBS中的明礬(Al(OH)3)一起培育。單獨(dú)的中性脂質(zhì)體和QS21都不能和溶于PBS的明礬相結(jié)合，而帶有負(fù)電荷的脂質(zhì)體也不能。然而，當(dāng)QS21和中性脂質(zhì)體一起都可以和明礬相結(jié)合。該上清液既不含QS21(苔黑酚試驗(yàn)檢測(cè))也不含放射性膽固醇。
這表明QS21已結(jié)合于脂質(zhì)體且允許該脂質(zhì)體-QS21結(jié)合物結(jié)合于明礬。這可能產(chǎn)生于由QS21加于該脂質(zhì)體的負(fù)電荷，或者脂質(zhì)體上的疏水區(qū)的暴露。該結(jié)果也意味著QS21不能從膜中抽提膽固醇。
這表明本發(fā)明的組合物可用于基于明礬的疫苗中。
1.8脂質(zhì)體樣QS21/MPL和游離QS21+MPL的抗體及CMI誘發(fā)的比較用擠壓技術(shù)制備SUV(EYPC∶膽固醇∶MPL 20∶5∶1)。
對(duì)MPL外而言，脂質(zhì)體在無(wú)MPL的條件下制備并再以100nm的微粒態(tài)加入MPL。
QS21先于抗原加入。膽固醇∶QS21＝5∶1(W/W)在抗原加入前，通過(guò)3次凍融SUV制備MLV。
對(duì)捕獲抗原而言，抗原在凍融前加入到SUV中并在凍融后加入QS21?？乖赡遥?％內(nèi)，95％外。在小鼠(gD用balb/c，RTSs用BIOBR)的足墊處注射兩次。gD是來(lái)源于單皰疹病毒的糖蛋白。RTSs是指經(jīng)過(guò)遺傳改良而含有一個(gè)來(lái)源于原生團(tuán)惡性子孢子的抗原表位的乙肝表面抗原(HBsAg)。


數(shù)據(jù)顯示SUV/QS+MPL(外)誘導(dǎo)出至少和QS21+MPL相當(dāng)?shù)母呖贵w滴度，以及誘導(dǎo)出作為細(xì)胞介導(dǎo)免疫標(biāo)記的IL-2，而抑制QS21的反應(yīng)原性。
另外，用HSV gD作抗原在balb/c小鼠中對(duì)比QS21和有膽固醇(SUV)存在的QS21第二個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如下

1.9比較分別加上脂質(zhì)體樣的MPL/QS21和游離的MPL/QS21的gD120脂質(zhì)體＝在膜內(nèi)含MPL的SUV膽固醇∶QS21＝6∶1在一次免疫接種后兩周檢測(cè)反應(yīng)

第二次免疫接種后

數(shù)據(jù)顯示QS21和含有膽固醇的脂質(zhì)體以及MPL相結(jié)合能誘發(fā)出相當(dāng)于MPL+QS21的Th1/Th0反應(yīng)。
在此膽固醇對(duì)QS21的比率下，QS21對(duì)兔子無(wú)毒性(用CPK作指標(biāo))在第二個(gè)試驗(yàn)中，balb/c小鼠用有QS21或者QS21+含有膽固醇的SUV存在的gD120足墊注射進(jìn)行免疫。測(cè)定了脾細(xì)胞中胞毒T淋巴細(xì)胞的活性，如圖3(a)和圖3(b)所示。
這表明單獨(dú)的QS21誘發(fā)CTL活性，而在有含膽固醇的脂質(zhì)體存在的情況下的QS21至少能誘發(fā)出和單獨(dú)的QS21相當(dāng)或者更好的CTL活性。
2.疫苗2.1 HBsAgL*，S顆粒的配制HBsAgL*，S顆?？扇缦屡渲茖?0μg HBsAg L*，S顆粒/劑在室溫下攪拌培育一小時(shí)。用注射用水和PBS溶液調(diào)節(jié)該體積并最終用QS21(10μg/劑)的水溶液將體積定為70μ1/劑。pH維持在7±0.5。
使用1和50μg HBsAg L*，S可制備類似的配方，并且還可以使用HBsAg S抗原。
這些配方可在旱獺替代治療模型中用旱獺HBV抗原作模型進(jìn)行檢測(cè)。
旱獺模型DQ QS21(即QS21/膽固醇或抑制的QS21)可在長(zhǎng)期注射病毒的旱獺的治療模型中進(jìn)行檢測(cè)。具體的旱獺乙肝病毒疫苗可以和如此的QS21或者DQ混和并且可以帶有或者不帶MPL，其每月均對(duì)動(dòng)物給藥，連續(xù)六個(gè)月。該疫苗的效應(yīng)可通過(guò)病毒DNA的清除率來(lái)評(píng)估。
2.2豚鼠模型(HSV)2.2.1預(yù)防模型將12只為一組的雌Harttey豚鼠用下述配方在零天和第28天肌內(nèi)注射第一次實(shí)驗(yàn)gD 5μg+QS21 50μg+含50μg膽固醇的SUVgD 5μg+QS21 100μg+含100μg膽固醇的SUVgD 5μg+QS21 50μg+含250μg膽固醇的SUVgD 5μg+QS21 50μg第二次實(shí)驗(yàn)gD 5μg+MPL12.5μg+QS21 12.5μg+含62.5μg膽固醇的SUV，或者不處理。
在第二次免疫接種的第14和28天對(duì)動(dòng)物進(jìn)行放血，測(cè)定血清中g(shù)D-特異的ELISA抗體滴度。
然后，用105空斑單位(pfu)的HSV-2MS株陰道注射攻擊動(dòng)物。在第4-12天每天對(duì)動(dòng)物進(jìn)行初期皰疹損傷評(píng)估。得分如下陰道損傷-流血＝0.5
-充血1或2天但沒(méi)有流血＝0.5-充血并流血1天＝1-充血但沒(méi)有流血且持續(xù)至少3天＝1外部皰疹水皰-＜4個(gè)小水皰＝2-＞＝4個(gè)小水皰或者一個(gè)大水皰4＞＝4個(gè)大瘤8融合瘤＝16-在全部外生殖區(qū)的融合大瘤＝32結(jié)果如下表所示
預(yù)防模型實(shí)驗(yàn)1(chol是指含有膽固醇的SUV)

實(shí)驗(yàn)2

*感染后4-12天內(nèi)損傷評(píng)分的和(無(wú)損傷的動(dòng)物不考慮)損傷評(píng)分無(wú)損傷(0)，陰道損傷(0.5或1)，外部皮膚水皰(2，4，8或16)**初期感染系數(shù)＝和數(shù)(最大得分i)×(發(fā)病率％)；而i＝0，0.5，1，2，4，8或16
該圖表顯示出在預(yù)防模型中，用gD/MPL/QS21/SUV免疫接種誘發(fā)了極高水平的對(duì)初期病變的預(yù)防保護(hù)效應(yīng)。無(wú)論是外部損傷發(fā)病率還是損傷的嚴(yán)重性在用gD/MPL/QS21/SUV免疫接種的動(dòng)物組中均有極大程度的降低。
2.2.2治療模型在該治療模型中，首先用105pfu HSV-2MS株攻擊雌性的Hartloy豚鼠。將帶有皰疹損傷的動(dòng)物再進(jìn)行隨機(jī)分組，每組16只。
在第21天和42天，用下列配方之一免疫動(dòng)物-gD+MPL50μg+QS21 50μg+含250μg膽固醇的SUV-gD+Al(OH)3+MPL50μg+QS21 50μg+含有250μg膽固醇的SUV或者不處理。
從第22-75天每天監(jiān)測(cè)動(dòng)物以評(píng)估疾病的復(fù)發(fā)狀況。評(píng)分如預(yù)防模型中所述。結(jié)果如下列圖表所示
治療模型

*感染后第22-75天的損傷得分的和**感染后第22-75天，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物復(fù)發(fā)損傷的總天數(shù)***感染后第22-75天的復(fù)發(fā)發(fā)作數(shù)例數(shù)。發(fā)作在先且在隨后的一天無(wú)損傷，其特征是至少有兩天的紅斑(得分＝0.5)或者一天的外部水皰(得分＞＝2)免疫治療在第21天和第42天進(jìn)行。
該結(jié)果表明在HSV-2感染的治療模型中也能誘導(dǎo)出良好的保護(hù)水平。用含或不含明礬的gD/MPL/QS21/SUV免疫對(duì)復(fù)發(fā)疾病的嚴(yán)重性的中位數(shù)產(chǎn)生了顯著的影響。它也略微降低了發(fā)作病例數(shù)和持續(xù)時(shí)間(見(jiàn)表)。
權(quán)利要求
1.使QS21在堿介導(dǎo)的水解中穩(wěn)定的方法，包括使QS21與含有固醇的脂質(zhì)體混合。
2.使QS21在堿介導(dǎo)的水解中穩(wěn)定的方法，包括使QS21與固醇以1∶1-1∶100重量比混合。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中固醇是膽固醇。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含有抗原，免疫活性的皂苷組分以及固醇的疫苗組合物。
文檔編號(hào)A61K39/00GK1515245SQ02152978
公開(kāi)日2004年7月28日 申請(qǐng)日期1996年4月1日 優(yōu)先權(quán)日1995年4月25日
發(fā)明者納撒利·M·－J·C·加肯, 馬丁·弗里德, 弗里德, 納撒利 M -J C 加肯 申請(qǐng)人:史密斯克萊·比奇曼生物公司, 史密斯克萊 比奇曼生物公司