專利名稱：細(xì)胞增殖受體igfir基因靶標(biāo)的反義寡核苷酸結(jié)構(gòu)和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及反義寡核苷酸的結(jié)構(gòu)及其用途，具體地說涉及細(xì)胞增殖受體IGF1R基因為靶標(biāo)的反義寡核苷酸的結(jié)構(gòu)和用途。
腫瘤分子生物學(xué)研究表明，腫瘤是由于基因異常引起的疾病。致病機理包括癌基因的激活和抑癌基因的失活以及細(xì)胞周期的異常。腫瘤發(fā)病分子機理的進一步闡明為腫瘤的基因治療提供了可靠的理論依據(jù)。近年來腫瘤研究的熱點是腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞周期，細(xì)胞增殖，細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系。反義技術(shù)是近十幾年興起的生物高技術(shù)，用反義技術(shù)封閉和抑制特定基因的表達(dá)是基因治療的重要組成部分。1978年Stephenson和Zamenick用互補寡聚核苷酸特異性抑制Rous肉瘤病毒的復(fù)制，首次提出了反義寡聚脫氧核糖核苷酸(ASODN)抑制基因表達(dá)的概念。ASODN是根據(jù)Watson-Crick堿基配對原理能夠與mRNA的堿基對互補阻止其翻譯成蛋白質(zhì)的DNA。反義寡核苷酸具有定向合理設(shè)計，體內(nèi)外作用高效和能人工大規(guī)模合成等藥用特性，因而近年來成為治療病毒感染，腫瘤，及其它由于基因表達(dá)異常引起的疾病的一類潛在型藥物，其中腫瘤相關(guān)基因可作為反義藥物作用的靶標(biāo)。
本發(fā)明的目的是根據(jù)一種腫瘤相關(guān)基因細(xì)胞增殖受體IGF1R基因設(shè)計12條寡核苷酸序列(見表1)，采用PE公司產(chǎn)391A型DNA合成儀合成并采用硫代修飾，經(jīng)MicroPureII反向柱(Solid Phase Science)純化后，以此產(chǎn)物作為腫瘤的治療藥物。
表1 反義寡核苷酸序列及性質(zhì)序號 靶位(nt) 長度(nt) 特性序列(5’-3’)11543-1562 20ATTCATTCCTTTTATTTGGGA21559-1578 20ATCCTCCGGAGCCAGACTTCA31567-1584 18AGGACCCTCCTCCGGAGCC41584-1603 20AGCCCCCACAGCGAGGTCGGG51595-1614 20AGAGAAACAGGAGCCCCCACA61552-1571 20AGAGCCAGACTTCATTCCTTT722-41 20AGCGCGGCTGGAAAGCGCGTT835-54 20AGAAAACAACAACAGCGCGGC952-71 20AGCTGGGAGAGGTTCATTGAA10 1555-1574 20ACCGGAGCCAGACTTCATTCC11 1561-1577 17ACCTCCGGAGCCAGACTT12 1561-1580 20ACCTCCTCCGGAGCCAGACTT本發(fā)明的主要內(nèi)容是選取了IGF1R基因作為靶標(biāo)進行抗腫瘤反義寡核苷酸的篩選和評價，IGF1R是調(diào)節(jié)哺乳動物細(xì)胞增殖的一種受體，在有絲分裂細(xì)胞生存，運動，粘附中起重要作用。在人類大多數(shù)腫瘤中IGF1R表達(dá)增加，干擾IGF1R的功能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞大量凋亡，抑制其生長，防止其轉(zhuǎn)移，存活的腫瘤細(xì)胞被宿主的免疫反應(yīng)清除而對正常細(xì)胞影響較少。
在針對IGF1R的12條反義寡核苷酸中，2#的體外細(xì)胞抑制作用最強且具有持續(xù)性。在用藥后的4天內(nèi)細(xì)胞增殖抑制率持續(xù)上升，第四天抑制率達(dá)到90％的峰值，至第5天開始緩慢下降，第六天降至74.5％。2#的二級結(jié)構(gòu)由內(nèi)環(huán)(2個堿基)-莖(6個堿基)-多分支連接部(3個堿基)-莖(8個堿基)-連接部(1個堿基)組成(A＝4，T＝4，C＝8，G＝4)。
2#藥物對荷HepG2人肝細(xì)胞癌(接種的細(xì)胞數(shù)為3×106個/只)裸鼠的腫瘤生長具有明顯的抑制作用，成瘤率100％.抑瘤率是72.4％；這種藥物對裸鼠的體重及生長狀態(tài)無明顯影響，無肉眼可見的毒性。瘤組織的病理切片表明，用藥組瘤組織大片壞死，組織間有纖維化，瘤周多為淋巴細(xì)胞浸潤，而對照組以彌漫性點狀，片狀壞死為主，瘤周炎細(xì)胞浸潤以中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞為主。
根據(jù)發(fā)明，發(fā)明中所涉及的寡核苷酸或其修飾物可用于治療肝癌。
根據(jù)發(fā)明，發(fā)明中針對絲氨酸/蘇氨酸激酶AIM-1基因治療腫瘤的優(yōu)選序列為2#序列。下面結(jié)合附圖，對本發(fā)明的具體實施作詳細(xì)說明

圖1為反義寡核苷酸在細(xì)胞水平上的增殖抑制率；圖2為反義寡核苷酸序列的優(yōu)化；圖3為反義寡核苷酸在細(xì)胞水平上作用時間的持續(xù)性；圖4為反義寡核苷酸對于荷肝細(xì)胞癌裸鼠腫瘤體積的抑制情況；圖5為反義寡核苷酸對于荷肝細(xì)胞癌裸鼠體重的抑制情況；圖6為反義寡核苷酸對于荷肝細(xì)胞癌裸鼠腫瘤重量的影響。
實施例一體外抗腫瘤活性ASODN篩選和評價1材料和方法1.1反義寡核苷酸的設(shè)計和合成本研究選取了IGF1R基因作為靶標(biāo)進行抗腫瘤反義寡核苷酸的篩選和評價，基因序列由Genbank獲得，通過國際互聯(lián)網(wǎng)引入RNAStructure 3.2分析軟件，選擇RNA二級結(jié)構(gòu)中膨脹環(huán)，內(nèi)環(huán)，發(fā)夾，多分支連接部等結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的區(qū)域作為反義藥物作用的靶點，針對IGF1RmRNA的二級結(jié)構(gòu)設(shè)計了6條針對3’非編碼區(qū)的序列和3條針對5’非編碼區(qū)的序列1-9(具體序列見表1)。反義硫代寡聚核苷酸為無色粉末狀，合成后濃氨水55℃脫保護15小時，然后用反相柱(購自solid phase sciense公司)層析純化。體外實驗用無雙抗的DMEM培養(yǎng)基配制，體內(nèi)實驗用生理鹽水配制，保存于-20℃。1.2細(xì)胞培養(yǎng)、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染及細(xì)胞增殖抑制活性測定人肝癌(HepG2)細(xì)胞株由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供。將其用含10％小牛血清及100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，置37℃ ，5％CO2孵箱培養(yǎng)。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種5×103細(xì)胞/0.2ml。待50-60％細(xì)胞融合后，在無血清狀態(tài)下，采用lipofectin(GIBCO，1mg/ml)試劑并參照說明書操作進行硫代反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染。每條硫代反義寡核苷酸設(shè)置3個濃度，分別為0.2μmol/L、0.4μmol/L和0.8μmol/L.每個濃度3孔，每孔總體積為100μl，并設(shè)置細(xì)胞和脂質(zhì)體對照。轉(zhuǎn)染5小時后，換含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)19小時，于培養(yǎng)48小時后，每孔加20μl MTS(Promega)，并繼續(xù)培養(yǎng)90分鐘，于492nm測定光吸收，計算抑制率。1.3 2#作用持續(xù)時間測定HepG2細(xì)胞接種于96孔板(3000/孔)，待50-60％細(xì)胞融合后，轉(zhuǎn)染2#一次，終濃度為0.2μmol/L。分別于轉(zhuǎn)染后第1-6天，各取3孔細(xì)胞測定細(xì)胞增殖抑制情況，觀察其作用持續(xù)時間。2實驗結(jié)果2.1 反義寡核苷酸作用靶位的選擇針對IGF1RmRNA的二級結(jié)構(gòu)設(shè)計了6條針對3’非編碼區(qū)的序列和3條針對5’非編碼區(qū)的序列1-9。圖1所示，針對3’非編碼區(qū)的2#序列在0.2μM時抑制率是49.6％，0.4μM時抑制率是73.1％，0.8μM時抑制率是89.6％。它的細(xì)胞增殖抑制作用最強。2.2 反義寡核苷酸序列的優(yōu)化在反義寡核苷酸設(shè)計中發(fā)現(xiàn)一個有效的序列后，往往對其進行優(yōu)化。觀察堿基的移動對其作用的影響。因此我們以2#序列為中心進行優(yōu)化，向其5’端，3’端移動幾個堿基設(shè)計了3條反義寡核苷酸，在96孔板上評價體外對HepG2細(xì)胞生長的抑制，目的是篩選出更加有效的藥物。2#序列的抑制率高于其它3條序列。因此選擇2#序列為體內(nèi)動物實驗的藥物，從12條序列中篩選出了一條序列。2#的IC50是0.039μM。2#的二級結(jié)構(gòu)由內(nèi)環(huán)(2個堿基)-莖(6個堿基)-多分支連接部(3個堿基)-莖(8個堿基)-連接部(1個堿基)組成。A＝4，T＝4，C＝8，G＝4。2.3 反義寡核苷酸作用的持續(xù)時間作用的持續(xù)時間不僅是評價反義核酸藥物的一個重要指標(biāo)，同時對于給藥方案具有重要的參考價值。圖3可以看出在肝癌細(xì)胞(HepG2)中，終濃度0.2μmol/L的2#脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染給藥1次后，1-4天抑制活性逐漸增加，第4天達(dá)到90％的峰值，然后緩慢下降，到第6天抑制率分別為74.5％。實施例二動物體內(nèi)抗腫瘤活性ASODN的評價1材料和方法1.1裸鼠的飼養(yǎng)，移植瘤的接種和藥物處理Balb/c(nu/nu)裸鼠18-22克，雌性由北京醫(yī)科大學(xué)動物中心提供。將Balb/c(nu/nu)裸鼠飼養(yǎng)于二級動物房的層流柜中，自由攝取食物和水，大量擴增HepG2腫瘤細(xì)胞，用0.2％胰酶溶液消化和收集細(xì)胞，用PBS清洗兩次后，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1.5×107個細(xì)胞/毫升，于每個裸鼠左后肢腋窩皮下接種0.2毫升。接種細(xì)胞后第5日，確認(rèn)腫瘤細(xì)胞生長并可觸及后，給裸鼠分為兩組，給藥組每日腹腔注射藥物一次0.1毫升的2#，(25mg/kg)，對照組給予相應(yīng)量的生理鹽水，每周測量兩次腫瘤的重量觀察記錄腫瘤的大小(用游標(biāo)卡尺)，按下列公式計算腫瘤的相對體積V＝L×W2×1/2，式中V為腫瘤體積(mm3)；L、W分別為瘤體最長和最短的兩個徑(mm)。待裸鼠行動困難時，處死。用藥共28天，稱量瘤重量制備病理切片。1.2光鏡病理檢查標(biāo)本的制備標(biāo)本在10％福爾馬林溶液固定72小時，經(jīng)石蠟包埋切片，H-E染色，在光鏡下閱片。2實驗結(jié)果2.1反義寡核苷酸對于荷肝細(xì)胞癌裸鼠腫瘤生長的抑制情況荷瘤裸鼠在接種腫瘤的第三天即可見其生長，第五天可觸及腫瘤并開始用藥，在用藥的四天內(nèi)用藥組與對照組相比，腫瘤體積無差異，第八天時出現(xiàn)差別，第15天后兩者差別顯著，從圖4中可見對照組體積增長迅速而用藥組體積增長緩慢。2#藥物使瘤體積倍增7.82倍，而對照組瘤體積倍增了81.55倍。從用藥期間裸鼠體重的變化曲線看，所有裸鼠體重均呈增長趨勢，作方差分析表明2#組與對照組相比有顯著性差異，2#組抑制率達(dá)72.4％。腫瘤的病理切片顯示兩組腫瘤均有變性和壞死，程度以用藥組嚴(yán)重，2#組腫瘤中心部有囊腔形成，炎細(xì)胞浸潤用藥組以淋巴細(xì)胞漿細(xì)胞為主，對照組以中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞為主，兩組均有部分裸鼠呈現(xiàn)纖維組織增生。
權(quán)利要求
1.與細(xì)胞增殖受體IGF1R基因5’和3’非編碼區(qū)及翻譯起始區(qū)互補、長度為10-30個堿基并包含下列序列的寡核苷酸(序列為5’到3’)1〕TTCATTCCTTTTATTTGGGA；2〕TCCTCCGGAGCCAGACTTCA；3〕GGACCCTCCTCCGGAGCC；4〕GCCCCCACAGCGAGGTCGGG；5〕GAGAAACAGGAGCCCCCACA；6〕GAGCCAGACTTCATTCCTTT；7〕GCGCGGCTGGAAAGCGCGTT；8〕GAAAACAACAACAGCGCGGC；9〕GCTGGGAGAGGTTCATTGAA；10〕CCGGAGCCAGACTTCATTCC；11〕CCTCCGGAGCCAGACTT或12〕CCTCCTCCGGAGCCAGACTT。
2.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的反義寡核苷酸，其特征在于含下列序列2〕TCCTCCGGAGCCAGACTTCA；6〕GAGCCAGACTTCATTCCTTT；10〕CCGGAGCCAGACTTCATTCC或11〕CCTCCGGAGCCAGACTT。
3.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的反義寡核苷酸，經(jīng)化學(xué)修飾后在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及反義寡核苷酸的結(jié)構(gòu)及用途,具體地說是根據(jù)細(xì)胞增殖受體IGFlR基因設(shè)計并制備的反義寡核苷酸。采用人肝癌(HepG2)細(xì)胞株及Balb/c(nu/nu)裸鼠接種肝癌細(xì)胞為模型,對所設(shè)計、制備的12條反義寡核苷酸進行篩選及評價。體外實驗可有效地抑制人肝癌細(xì)胞生長,且呈劑量依賴性關(guān)系;在荷瘤裸鼠模型中亦有效地抑制了腫瘤的生長。故本發(fā)明是針對腫瘤的反義寡核苷酸結(jié)構(gòu)及其作為治療腫瘤、減少腫瘤及其相關(guān)性疾病危害性的新型藥物。
文檔編號A61P35/00GK1358859SQ0013453
公開日2002年7月17日 申請日期2000年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月11日
發(fā)明者王升啟, 林莉, 管偉, 王小紅 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所