專利名稱：一種駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白基因及重組表達和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種來自駱駝蓬中的脂轉(zhuǎn)移蛋白基因WiLTP，以及制備獲得重組駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白的方法及其在抑菌和抗腫瘤方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物體在受到病原菌的侵害時，首先產(chǎn)生的防御機制便是抗菌蛋白，其作用范圍較廣，包括革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、霉菌、原蟲、寄生蟲及含有外套膜的病毒，而且也有研究報告指出抗菌蛋白能夠抑制腫瘤細胞的生長。抗菌蛋白廣泛存在于自然界許多生物體中，是一道天然的防御系統(tǒng)，其中，病程相關(guān)蛋白(pathogenesis-related proteins, PRs)、防御素(defensins)、核糖體失活蛋白(ribosome. inactivating proteins,RIPs)和脂轉(zhuǎn)移蛋白(lipid transfer protein, LTP)等都起著非常重要的作用。脂轉(zhuǎn)移蛋白是一類分子量相對較小的堿性蛋白質(zhì)，在植物、動物、酵母、真菌和一些細菌中均有發(fā)現(xiàn)。在動物中有特異脂轉(zhuǎn)移蛋白(lipid transfer proteins, LTPs)和非特異性脂轉(zhuǎn)移蛋白(non-specific lipid transfer protein，nsLTP)，在植物中因其脂轉(zhuǎn)移活性具有廣泛性和不確定性，植物中至今只發(fā)現(xiàn)有nsLTP。植物中nsLTP能夠轉(zhuǎn)移磷脂酰肌醇、磷脂酰膽堿和磷脂酰絲氨酸，并能夠促進微體和線粒體之間的磷脂交換?，F(xiàn)在已從多種植物中分離得到nsLIPs，如玉米、水稻、大麥、谷子、洋蔥、豇豆、白菜、菠菜、甜桔、蘿卜、桃和擬南芥等。在植物中非特異脂轉(zhuǎn)移蛋白都是可溶性蛋白，可以達到可溶蛋白總量的4%。 由于植物nsLIPs具有很強的抗真菌和細菌的活性，所以被列為植物防御蛋白系列。然而目前一些研究還發(fā)現(xiàn)植物nsLTPs還具有較強的抗腫瘤活性。近年來，從傳統(tǒng)中草藥中繼續(xù)挖掘具有應(yīng)用價值的蛋白質(zhì)或多肽，已經(jīng)成為一個重要的研究熱點。駱駝蓬(Peganum harmala L.)是蒺藜科(Zygophyllaceae)駱駝蓬屬(Peganum) 多年生藥用草本植物，已列入維吾爾藥衛(wèi)生部藥品標準。多分布于干旱草地、鹽堿化荒漠地帶。駱駝蓬富含多種生物堿，具有抗癌、消炎、抗病毒等多種藥理及殺蟲抑菌活性，這些生物活性引起了人們對野生駱駝蓬資源的關(guān)注。本發(fā)明首次從駱駝蓬幼葉中克隆出脂轉(zhuǎn)移蛋白基因并構(gòu)建表達載體進行重組表達，該重組表達蛋白具有抑菌和抗腫瘤活性的作用，未見現(xiàn)有文獻報道。本發(fā)明為科學(xué)認識駱駝蓬中活性蛋白的功能提供依據(jù)，對脂轉(zhuǎn)移蛋白以及其他類型抗菌蛋白的研究不僅具有重要的理論意義，在抗微生物感染和抗腫瘤藥物的治療方面也具有廣泛的應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白基因，并提供重組駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白WiLTP在大腸桿菌中高效表達的方法，證明該重組表達蛋白的用途，以擴大藥用植物駱駝蓬的應(yīng)用范圍。本發(fā)明所述駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白基因，具有序列表SEQ ID NO. 1中所示的堿基序列， 全長為348bp，其編碼一種駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白，具有序列表SEQ ID N0. 2中所示的由115個氨基酸組成的氨基酸序列，其中含有8個半胱氨酸殘基，分別在序列表SEQ ID NO. 2中所示的氨基酸序列中第29、39、54、55、75、77、100和114的位置上。本發(fā)明提供了一種駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白基因在大腸桿菌中高效重組表達的方法和應(yīng)用，包括如下步驟(1)駱駝蓬總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 將駱駝蓬種子萌發(fā)6天后，取幼葉放入無RNA酶的研缽中液氮研磨，使用Trizol試劑提取總RNA ；用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法檢測其總RNA質(zhì)量，A260/280約2. O為純度較好；以總RNA為模板，Oligo dT為引物，使用反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV (RNase H-)，合成cDNA ；O) PCR擴增駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白基因(PhLTP)根據(jù)登錄在國際檢索數(shù)據(jù)庫NCBI上的其他植物脂轉(zhuǎn)移蛋白的cDNA序列，設(shè)計并合成一對簡并引物，以步驟⑴合成的cDNA為模板，經(jīng)聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增出348bp的DNA片段，回收PCR產(chǎn)物并純化后，克隆到T 載體pCR2. 1上，對陽性轉(zhuǎn)化子進行菌落PCR檢測，酶切鑒定重組質(zhì)粒插入片段的大小正確后，進行測序分析，鑒定獲得正確的駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白基因WiLTP ；(3)構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a_PhLTP及相應(yīng)的重組基因工程菌設(shè)計特異性引物用于擴增獲得WiLTP基因核酸序列，經(jīng)雙酶切將WiLTP亞克隆至經(jīng)同樣雙酶切的pET30a載體中，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET30a-PhLTP ；轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Ε. coli BL21(DE3)中獲得基因工程菌，簡稱 E. coli BL21/pET30a-PhLTP ；(4)重組質(zhì)粒pET30a_PhLTP的高效表達及純化以LB為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將基因工程菌E. coli BL21/pET-30a-PhLTP經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得可溶性的重組表達蛋白，其中培養(yǎng)溫度是觀°0，pH 7.0;離心收集菌體，采用超聲波破碎法裂解細胞，離心獲得上清可溶性蛋白，通過金屬鎳螯合柱層析方法純化，獲得純度達97%以上的重組駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白，經(jīng) SDS-PAGE電泳檢測證明得到了可溶性、高效表達的重組駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白WiLTP。(5)重組駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白的功能活性和應(yīng)用上述步驟(4)得到的純化的重組駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白WiLTP具有抑菌和抑制腫瘤活性，在病原微生物感染和在腫瘤的藥物治療方面具有良好的應(yīng)用前景。本發(fā)明得到的一種重組表達的駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白PhLTP具有明顯的抑菌活性，對三種病原細菌，如肺炎克雷伯氏菌(klesiella peneumoniae)，大腸埃希菌(Escherichia coliAtc25922)，類產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)均具有抑制效果，且隨樣品濃度升高抑制效果增強。當重組蛋白濃度在0. 3mg/mL時，對三種菌的抑菌圈直徑范圍在16. 0-18. Omm，所述重組蛋白可以用于制備抗微生物感染藥物制劑。本發(fā)明所得到的重組駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白還具有明顯的抗癌活性，在體外對多種腫瘤細胞均具有高抑制作用，但對正常細胞毒性較小。實驗證實，使用MTT法測定重組脂轉(zhuǎn)移蛋白對常見癌細胞如人宮頸癌細胞HeLa、食管癌細胞Eca-109和鼠黑色素瘤細胞B16具有顯著的抑制生長作用，其中對B16細胞抑制作用較強，作用24h時對黑色素瘤細胞的半數(shù)抑制濃度(IC5tl)僅為12. 5 μ g/mL，而對正常細胞Vero抑制作用較弱。這些實驗表明重組駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白PhLTP在抗病原細菌感染的生物制劑及在腫瘤疾病的藥物治療方面具有良好的應(yīng)用前景。關(guān)于重組駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白WiLTP的制備和活性等未見報道。本發(fā)明進一步詳細提供了駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白基因WiLTP在大腸桿菌中高效表達的方法，具體步驟如下(1)駱駝蓬總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄合成cDNA將駱駝蓬種子萌發(fā)6天后，稱取0. Ig駱駝蓬葉片放入無RNA酶的研缽中液氮研磨成粉末，將粉末倒入含有Iml Trizol的EP管中，劇烈振蕩以裂解細胞，加0. 2ml氯仿，震蕩 I5秒，在室溫下(15°C 30°C )放置2 ;3min后，l2000g(2°C 8°C )離心Ιδπ η。取上層水相置于新EP管中，加0. 5ml異丙醇，在室溫下(15°C 30°C)放置lOmin，12000gQ°C 8V )離心lOmin，棄上清，加Iml 75%乙醇進行洗滌，7500g 8°C )離心5min，棄上清，RNA沉淀在室溫下自然干燥后，用foiase-free water溶解RNA，用1 %瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法檢測其總RNA質(zhì)量，A^0/280約2. O為純度較好；以總RNA為模板，按照 TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒(全式金公司)操作方法進行第一鏈cDNA的合成；Q)PCR擴增駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白基因(PhLTP)根據(jù)登錄在國際檢索數(shù)據(jù)庫NCBI上的其他植物脂轉(zhuǎn)移蛋白的cDNA序列，設(shè)計并合成一對簡并引物，以步驟⑴合成的cDNA為模板，經(jīng)聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增出 348bp 的 DNA 片段；所述一對簡并引物為Pl :5’ -ATGGCWRSCMTSAAGSTTGYWT-3，，P2 5，-TCACYTSACSKTRGMGCAGTTGGTG-3，；PCR 體系為1 μ L 駱駝蓬葉 cDNA, 1 μ L 10 μ M 弓丨物 Pl, 1 μ L 10μΜ3|*Ρ2，2μ dNTPs Mixture (2. 5mM), 2 μ L IOXEx Taq Buffer,0. 5μ L ExTaq DNAPolymerase (5U/μ L)以及 12. 5 μ L Sterilized dH20，總反應(yīng)體系為 20 μ L ；聚合酶鏈式反應(yīng)采用熱啟動，具體條件是94°C IOmin ；94°C Imin, 59°C 30sec,72°C 45sec，循環(huán)數(shù)30 -JTC IOmin ；PCR片段純化后，克隆到pCR2. 1載體上，陽性轉(zhuǎn)化子用Pl和P2引物進行菌落PCR檢測，酶切鑒定重組質(zhì)粒PCR2. I-PhLTP插入片段的大小正確，表明WiLTP基因陽性克隆重組子已獲得。將含有完整外源片段的陽性克隆菌株送北京華大基因中心測序， 進行測序分析，鑒定獲得了正確的駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白基因WiLTP ；(3)構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a_PhLTP及相應(yīng)的重組基因工程菌設(shè)計特異性引物(引入酶切位點)，經(jīng)PCR擴增獲得WiLTP基因核酸序列，所述一對特異性引物為P3 5' -GGAATTCGCCATAGCATGCGGTACGGTG-3‘(下劃線為酶切位點EcoR I), P4 5' -CCGCTCGAGTCACTTCACCGTAGAGCAGTT-3 ‘(下劃線為酶切位點 Xho I) ;PCR 反應(yīng)體系為1 μ g PCR2. I-PhLTP 質(zhì)粒，1 μ L 10 μ M 弓丨物 Ρ3，1 μ L 10 μ M 弓丨物 Ρ4，2 μ L dNTPs Mixture (2. 5mM), 2 μ L IOXEx Taq Buffer,0. 5μ L Ex Taq DNA Polymerase (5U/μ L)以及12. 5 μ LSterilized dH20,總反應(yīng)體系為20 μ L ；輕輕混勻后按以下條件進行PCR反應(yīng)， 具體條件是 94°C 5min ；94°C lmin，58°C lmin，72°C lmin，循環(huán)數(shù) 30 ；72°C 7min ；PCR 擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測。取IOOyL PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后，將目的DNA片段切出。純化步驟參考上海生工公司DNA回收試劑盒說明書；將PCR產(chǎn)物和載體進行EcoR I與 Xho I雙酶切，采用TIANGEN生物公司的PCR產(chǎn)物回收試劑盒，對雙酶切的WiLTP和pET30a
進行回收，然后進行連接反應(yīng)；在一微量離心管中依次加入下列試劑無菌水6 “L IOx連接緩沖液
pET30a 載體(53ng/pL)7 μι
PCR 產(chǎn)物(PhLTP)40 μ
Τ4 DNA連接酶1 μ ^
Total Volume60 μ充分混勻上述連接成分，短暫離心后，16°C水浴過夜。參考分子克隆實驗指導(dǎo)(第三版)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5 α中，將過夜長出的陽性克隆挑取到 6mL的LB培養(yǎng)基(含卡那霉素)中培養(yǎng)12-1他。菌液PCR方法鑒定重組質(zhì)粒正確。按照堿裂解法小量提取質(zhì)粒，用雙酶切進行鑒定，瓊脂糖凝膠電泳檢測。得到的具有工程菌為 E.coliBL21/pET30a-PhLTP。(4)重組質(zhì)粒pET30a_PhLTP的高效表達及純化將鑒定正確的含有駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白基因的重組質(zhì)粒的培養(yǎng)物分別按1 100轉(zhuǎn)接到含卡那霉素(50mg/L)的LB液體培養(yǎng)基中，菌液培養(yǎng)至OD6tltl = 0. 6-0. 8時，加入IPTG 至終濃度為0. 3mM，在誘導(dǎo)培養(yǎng)4h。親和層析誘導(dǎo)表達后，4°C，8000g離心lOmin，收集菌體；用預(yù)冷的PBS重懸菌體，8000g離心lOmin，收集菌體；用適量的PBS再次重懸菌體，冰浴30min，4°C超聲破菌，超聲波超聲破菌的條件400W，每kec間隔kec共50次。4°C，12000g離心20min，收集上清，上清經(jīng)金屬螯合柱Ni-NTA親和純化，獲得較純的重組駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白，透析除去咪唑，Bradford法測濃度后，過濾除菌。將純化的重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定正確，真空冷凍干燥后于-20°C保存?zhèn)溆?。親和層析的條件如下結(jié)合緩沖液20mM磷酸緩沖液，0. 5M NaCl, 0. 02M咪唑，pH7. 4 ；洗脫緩沖液:20mM磷酸緩沖液，0. 5M NaCl, 0. IM咪唑，pH7. 4(棄去)20mM 磷酸緩沖液，0. 5M NaCl, 0. 2M 咪唑，ρΗ7· 4 (收集)本發(fā)明具有以下優(yōu)點(1)本發(fā)明首次從新疆傳統(tǒng)維吾爾族藥材駱駝蓬中克隆得到駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白基因，獲得該基因348bp的開放閱讀框，將該基因成功構(gòu)建到表達載體pET30a表達載體上并于原核表達系統(tǒng)大腸桿菌BL21中獲得表達。(2)本發(fā)明利用表達載體自身的特點，采用超聲波破碎法和金屬鎳螯合柱層析相結(jié)合的方法，獲得純度為97%以上，有活性的重組駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，達到電泳純，大大簡化了一般蛋白質(zhì)分離純化的繁瑣步驟。(3)本發(fā)明重組駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白對幾種常見的致病菌有明顯的抑制作用，同時還具有抑制腫瘤細胞增殖的作用，不僅擴大了駱駝蓬的應(yīng)用范圍，而且為駱駝蓬應(yīng)用于防治有害細菌和腫瘤的治療提供技術(shù)支持。


圖1是pET30a_PhLTP重組表達質(zhì)粒構(gòu)建示意圖；圖2是pET30a_PhLTP重組表達質(zhì)粒的雙酶切鑒定圖，圖中，M為DNA標準分子量 DL2000 ；1為EcoR I與Β ο I雙酶切鑒定；
圖3是SDS-PAGE電泳顯示重組蛋白的誘導(dǎo)表達和純化，圖中，M為蛋白分子量標準；1為未誘導(dǎo)含有重組質(zhì)粒的BL21轉(zhuǎn)化菌全蛋白；2為誘導(dǎo)含有重組質(zhì)粒的BL21轉(zhuǎn)化菌全蛋白；3為超聲波破碎細胞后的上清；4為純化后的融合蛋白；圖4是重組表達蛋白體外抑菌活性檢測圖，圖中，(A)肺炎克雷伯氏菌(klesiella peneumoniae) ； (B)大腸埃希菌(Escherichia coli Atc25922) ； (C)類產(chǎn)堿假單胞菌 (Pseudomonas pseudoalcaligenes)。重組蛋白 PhLTP 樣品溶于 0. 02M PBS 緩沖液(pH7. 4) 中，用牛津杯法進行抑菌活性的測定，以滅菌的PBS作為對照。置37°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 12h。在圖中(1)為對照含 0.02M PBS (pH 7.4) ； (2)為含 0. 0375mg/ml PhLTP 的 0. 02M PBS buffer (pH 7. 4) ； (3)為含 0. 075mg/ml PhLTP 的 0. 02M PBS buffer (pH 7. 4) ； (4)為含 0. 15mg/ml PhLTP 的 0. 02M PBS buffer (pH 7. 4) ； (5)為含 0. 3mg/ml PhLTP 的 0. 02M PBS buffer (pH 7.4)。結(jié)果表明該重組蛋白對3種病原細菌菌均有生長抑制作用；圖5是重組蛋白PhLTP對癌細胞增殖抑制的MTT檢測圖。取不同濃度的 PhLTPd. 25,2. 5,12. 5、25、50、62. 5,125 和 250 μ g/mL)分別檢測其對 HeLa(人宮頸癌細胞)，B16 (鼠黑色素瘤細胞)，ECa-109 (人食管癌細胞)和Vero (非洲綠猴腎細胞)的增殖抑制作用。MTT實驗結(jié)果表明WiLTP對HeLa，B16和ECa-109細胞均有抑制生長作用，其中對B16細胞抑制作用較強，其作用24h的IC5tl值約為12. 5 μ g/mL。但其對正常細胞Vero 抑制作用較弱。
具體實施例方式下面采用具體實施例的方式解釋本發(fā)明，但本發(fā)明不局限于實施例。實施例1 一種駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白基因的克隆1.材料植物材料駱駝蓬種子采自烏魯木齊市紅雁池水庫。將種子放入帶有濕紗布的平皿中，待長出葉片后備用。菌株大腸桿菌(Escherichia coli) jToplO (購自 invitrogen 公司)。質(zhì)粒載體pCR2. 1載體購自hvitrogen。主要試劑Trizol、DNA Marker,Taq DNA聚合酶購自天根生化科技、T4DNA連接酶、 限制性內(nèi)切酶購TaKaRa，DNA片段回收試劑盒購自上海生工。培養(yǎng)基LB液體培養(yǎng)基蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，NaCl 5g/L，NaOH 0. 334g/ L，調(diào)pH至7. 0，高壓滅菌。LB固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加2. 4g/L瓊脂粉，高壓滅菌。1. 2 方法1.2. 1引物設(shè)計根據(jù)登錄在國際檢索數(shù)據(jù)庫NCBI上的其他植物脂轉(zhuǎn)移蛋白的cDNA序列，設(shè)計一對簡并引物，引物序列如下Pl :5’ -ATGGCWRSCMTSAAGSTTGYWT-3‘P2 :5’ -TCACYTSACSKTRGMGCAGTTGGTG-3’1. 2. 2駱駝蓬總RNA的提取及質(zhì)量檢測(采用Trizol法提取)駱駝蓬總RNA的提取(采用Trizol法提取)將駱駝蓬種子萌發(fā)6天后，稱取0. Ig駱駝蓬葉片放入無RNA酶的研缽中液氮研磨成粉末，將粉末倒入含有Iml Trizol的EP管中，劇烈振蕩以裂解細胞，加0. 2ml氯仿，震蕩15秒，在室溫下(15°C 30°C )放置2 ^iin 后，12000g 8°C )離心15min。取上層水相置于新EP管中，加0. 5ml異丙醇，在室溫下 (15°C 30°C )放置10min，12000gQ°C 8°C )離心lOmin，棄上清，加Iml 75%乙醇進行洗滌，7500gQ°C 8°C )離心5min，棄上清，RNA沉淀在室溫下自然干燥后，用foiase-free water 溶解 RNA。駱駝蓬總RNA的質(zhì)量檢測將提取的總RNA在1 %的瓊脂糖凝膠中電泳，18S和 28SrRNA在真核生物中占總RNA的90%以上，因此呈特征條帶。18S和^S rRNA特征譜帶清晰，無拖尾，亮度比接近1 2，說明RNA是完整的，沒有被降解。再用紫外分光光度法檢測，分別在波長260nm和280nm處測RNA樣品OD值，OD260/OD280約2. O較好，進而確定是否需要重新提取RNA。1. 2. 3RNA 的反轉(zhuǎn)錄取高質(zhì)量的RNA，按照全式金公司 TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix操作方法進行第一鏈cDNA的合成。在EP管中配制下列模板RNA/引物混合液 50ng-5y g^RNA, 1 μ 1 Anchored Oligo (dT) 18 (0· 5 μ g/μ 1)弓|_，10 μ 1 2XTS Reaction Mix反應(yīng)混合液，Ιμ TransScript RT/RI Enzyme Mix反轉(zhuǎn)錄酶混合液，加無foiase的水至總體積為20μ 1，42°C保溫lh，70°C保溫IOmin后，迅速在冰上急冷^iin以上，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。1.2.4PCR 擴增聚合酶鏈式反應(yīng)PCR體系為1 μ g駱駝蓬葉cDNA，IyL 10 μ MP1，1 μ L 10 μ ΜΡ2，2 μ LdNTPs Mixture (2. 5mM) , 2 μ L IOXEx Taq Buffer, 0. 5μ L Ex Taq DNAPolymerase (5U/ μ L)以及 12. 5 μ L Sterilized dH20,總反應(yīng)體系為 20 μ L。聚合酶鏈式反應(yīng)采用熱啟動，具體條件是94°C IOmin ；94°C lmin, 59°C 30sec，72°C 45sec，循環(huán)數(shù)30 ； 72°C IOmin0反應(yīng)在PCR熱循環(huán)儀(Promega公司，北京)上進行，PCR擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳后，用Sanft^p柱式DNA膠回收試劑盒(生工生物工程上海有限公司，實驗步驟按照該公司的柱式DNA回收試劑盒說明書進行)進行純化。1. 2. 5大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞的制備大腸桿菌感受態(tài)的制備，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞參考分子克隆實驗指導(dǎo)(第三版)。1. 2. 6PCR擴增產(chǎn)物與pCR2. 1載體的連接與轉(zhuǎn)化鏈接反應(yīng)體系為
權(quán)利要求
1.一種駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白基因，其特征在于具有序列表SEQ ID NO. 1中所示的堿基序列，全長為348bp，其編碼一種駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白，具有序列表SEQ ID NO. 2中所示的由 115個氨基酸組成的氨基酸序列，其中含有8個半胱氨酸殘基，分別在序列表SEQID NO. 2中所示的氨基酸序列中的第四、3954、55、75、77、100和114的位置上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白的獲得方法和應(yīng)用，包括如下步驟(1)駱駝蓬總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 將駱駝蓬種子萌發(fā)6天后，取幼葉放入無RNA酶的研缽中液氮研磨，使用Trizol試劑提取總RNA ；用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法檢測其總RNA質(zhì)量，A260/280約2. O為純度較好；以總RNA為模板，Oligo dT為引物，使用反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV (RNase H-)，合成cDNA ；PCR擴增駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白基因(PhLTP)根據(jù)登錄在國際檢索數(shù)據(jù)庫NCBI上的其他植物脂轉(zhuǎn)移蛋白的cDNA序列，設(shè)計并合成一對簡并引物，以步驟(1)合成的cDNA為模板，經(jīng)聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增出348bp的DNA片段，回收PCR產(chǎn)物并純化后，克隆到 PCR2. 1載體上，對陽性轉(zhuǎn)化子進行菌落PCR檢測，酶切鑒定重組質(zhì)粒插入片段的大小正確后，進行測序分析，鑒定獲得了正確的駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白基因WiLTP ；(3)構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a-PhLTP及相應(yīng)的重組基因工程菌設(shè)計特異性引物用于擴增獲得WiLTP基因核酸序列，經(jīng)雙酶切將WiLTP亞克隆至經(jīng)同樣雙酶切的pET30a載體中，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET30a-PhLTP;轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E. coli BL21(DE3)中獲得基因工程菌，簡稱 E.coli BL21/pET30a-PhLTP ；(4)重組質(zhì)粒pET30a-PhLTP的高效表達及純化以LB為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將基因工程菌 E. coli BL21/pET-30a-PhLTP經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得可溶性的重組表達蛋白，其中培養(yǎng)溫度是^°C，pH 7. O ；離心收集菌體，采用超聲波破碎法裂解細胞，離心獲得上清可溶性蛋白，通過金屬鎳螯合柱層析方法純化，獲得重組駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測證明得到了可溶性、高效表達的重組駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白WiLTP。(5)重組駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白的功能活性和應(yīng)用上述步驟(4)得到的純化的重組駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白WiLTP具有抑菌和抑制腫瘤活性， 在病原微生物感染和在腫瘤的藥物治療方面具有良好的應(yīng)用前景。
3.權(quán)利要求1 2任一一項所述的重組駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白，其特征是所述重組蛋白具有抑菌作用，在制備治療病原微生物感染的抗菌藥物中的用途。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征是所述細菌是肺炎克雷伯氏菌(klesiella peneumoniae)，大腸埃希菌(Escherichia coli Atc25922)，類產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)等3禾中病原細菌。
5.權(quán)利要求1 2任一一項所述的重組駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白，其特征是所述重組蛋白具有抑制腫瘤細胞增殖的作用，在制備治療腫瘤藥物中的用途。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征是所述的腫瘤為宮頸癌、食管癌和黑色素瘤。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白基因(PhLTP)，以及制備獲得重組駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白的方法及其在抑菌和抗腫瘤方面的應(yīng)用。所述的駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白基因具有序列表SEQ ID NO.1中所示的堿基序列，其編碼由序列表SEQ ID NO.2中所示的氨基酸序列中由115個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。本發(fā)明經(jīng)基因克隆，構(gòu)建高表達質(zhì)粒，獲得重組菌，并利用此工程菌表達和分離純化生產(chǎn)出具有生物活性的重組駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白。本系統(tǒng)具有可溶性表達水平高、純化工藝簡單、產(chǎn)品純度高的特點。本發(fā)明通過實驗驗證了其生物學(xué)功能，證實該重組蛋白具有明顯的抑菌作用，對多種惡性腫瘤具有較強的腫瘤細胞殺傷作用，可在制備抗微生物感染和治療腫瘤的藥物中應(yīng)用。
文檔編號A61K38/16GK102533787SQ20121004286
公開日2012年7月4日 申請日期2012年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月24日
發(fā)明者劉東亮, 呂慧, 孫素榮, 張富春, 李婷婷 申請人:新疆大學(xué)