專利名稱：低密度脂蛋白中或極低密度脂蛋白中的膽甾醇的定量法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在臨床診斷領(lǐng)域中在脂質(zhì)代謝方面具有重要意義的低密度脂蛋白(LDL)或極低密度脂蛋白(VLDL)中的膽甾醇(以下稱為L(zhǎng)DL膽甾醇和VLDL膽甾醇)的定量法。
LDL具有向末稍細(xì)胞供應(yīng)膽甾醇的作用，是引起以冠狀動(dòng)脈硬化癥為首的各種動(dòng)脈硬化癥的直接因素，LDL在血中的含量已知可作為動(dòng)脈硬化性疾病的指標(biāo)。另外，富含甘油三酸酯(TG)的VLDL也與動(dòng)脈硬化有關(guān)，這一點(diǎn)正引起人們注意。作為現(xiàn)有的LDL膽甾醇的定量法，有超離心法、電泳法、換算法等，而作為VLDL膽甾醇的定量法，有超離心法、電泳法等。超離心法可作為基本的定量法使用，它是使用一種分離用超離心機(jī)，根據(jù)比重的差別來(lái)分離LDL或VLDL，進(jìn)而測(cè)定其中膽甾醇的含量(Adr.Lipid Res.，第6卷，第1頁(yè)，1968年)。然而該方法在定量性、簡(jiǎn)便性、經(jīng)濟(jì)性等方面存在缺點(diǎn)。在使用電泳法的情況下，以乙酸纖維素膜或瓊脂膠等作為支持體進(jìn)行分離，通過(guò)酶反應(yīng)來(lái)定量膽甾醇(臨床檢查，第29卷，1344頁(yè)，1985年)。該方法在簡(jiǎn)便性、經(jīng)濟(jì)性等方面存在問(wèn)題。在換算法的情況下是根據(jù)以下的計(jì)算式來(lái)算出LDL膽甾醇含量(Clin.Chem.，第18卷，499頁(yè)，1972年)。
(LDL膽甾醇量)＝(總膽甾醇量)－(HDL膽甾醇量)－(甘油三酸酯)/5然而，該方法由于受到血清中的TG含量和高脂血癥的類型等的限制，因此在簡(jiǎn)便性、正確性、多個(gè)試樣處理等方面存在問(wèn)題。如上所述，現(xiàn)有的LDL膽甾醇或VLDL膽甾醇的定量法不適合于進(jìn)行多個(gè)試樣處理、迅速測(cè)定以及在臨床檢查領(lǐng)域中廣泛地使用的自動(dòng)分析裝置中使用。而且，按照現(xiàn)有的定量法容易產(chǎn)生諸如用定量移液管量取分離出來(lái)的LDL時(shí)那樣的人為誤差。然而，即使不將血清試樣分離成LDL或VLDL而是將其直接地添加到一種含有膽甾醇酯酶和膽甾醇氧化酶的試劑中，與用于定量總膽甾醇的體系也沒(méi)有差別，不能特異地定量LDL膽甾醇或VLDL膽甾醇。
本發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)，使用存在糖化合物和/或蛋白增溶劑的膽甾醇測(cè)定試劑體系，對(duì)以超離心法分離出的高密度脂蛋白(HDL)、LDL、VLDL和乳糜微粒(CM)的各種脂蛋白進(jìn)行測(cè)定時(shí)，由于糖化合物和/或蛋白增溶劑的組合，可使得與各種脂蛋白的反應(yīng)性產(chǎn)生差異，其結(jié)果是使HDL中的膽甾醇、LDL膽甾醇、VLDL膽甾醇、CM中的膽甾醇的反應(yīng)性產(chǎn)生差異，至此便完成了本發(fā)明。
本發(fā)明涉及LDL膽甾醇或VLDL膽甾醇的定量法，其特征在于，在糖化合物和/或蛋白增溶劑的存在下測(cè)定試樣中的LDL膽甾醇量或VLDL膽甾醇量。在進(jìn)行上述測(cè)定時(shí)，為了進(jìn)一步提高其特異性，還可以同時(shí)添加二價(jià)的金屬原子鹽。
另外，根據(jù)本發(fā)明，提供了一種以糖化合物和/或蛋白增溶劑作為成分的用于LDL或VLDL中膽甾醇的定量試劑，或者由糖化合物與蛋白增溶劑組合而成的用于LDL或VLDL中膽甾醇的定量試劑。
作為糖化合物，優(yōu)選使用葡萄糖衍生物，作為葡萄糖衍生物，例如可以舉出通式(I)和通式(II)表示的化合物，其中，通式(I)為 〔式中，R1、R2和R3可以相同或不同，表示氫原子、取代或非取代烷基、取代或非取代烷?；?、SO3M2(式中，M2表示氫原子或金屬原子)、-(葡糖基)p-H(式中，p表示1或2)或-(麥芽糖基)q-H(式中，q表示1或2)；R4和R5可以相同或不同，表示氫原子、金屬原子或SO3M3(式中，M3表示氫原子或金屬原子)；m表示6-8〕通式(II)為 〔式中，R6、R7和R8可以相同或不同，表示氫或SO3M4(式中，M4表示氫原子或金屬原子)；R9表示氫原子、OM5(式中，M5表示氫原子或金屬原子)或OSO3M6(式中，M6表示氫原子或金屬原子)；R10表示氫原子、金屬原子或SO3M7(式中，M7表示氫原子或金屬原子)；n表示4-8000的整數(shù)〕。
作為蛋白增溶劑，優(yōu)選使用由通式(III)、(IV)或(V)表示的化合物，其中，通式(III)為R11(C2H4O)a-(C3H6O)bR12(III)〔式中，a和b表示0-200的整數(shù)；R11表示R20-X-O-(式中，R20表示烷基或鏈烯基；X表示單鍵或CO)，或者H-(CH2CH2O)c-N(R21)-(式中，c表示1-200的整數(shù)；R21表示烷基或鍵烯基)；R12表示C2H4COOR22、C3H6COOR23、C2H4CH(COOR24)2或C2H4CH(COOR25)(COOR26)(式中，R22、R23、R24、R25及R26相同或不同，表示氫原子、金屬原子、烷基或鏈烯基)但是a和b不能同時(shí)為0，不過(guò)兩種成分可以任意的比例存在〕通式(IV)為 (式中，R13、R14、R15、R16、R17和R18相同或不同，表示烷酰基)通式V為R19-Y-SO3M1(V)〔式中，R19表示烷基、鏈烯基或者取代的或非取代的芳基；Y表示單鍵、 -O-、-CH(R27)-(式中，R27表示烷基或鏈烯基)、-CH2CH(OH)(CH2)d-(式中，d表示1-22的整數(shù))、-CH＝CH(CH2)e-(式中，e表示1-22的整數(shù))、-OCOCH(CH2COOR28)-(式中，R28表示烷基或鏈烯基)或者它們的混合物；M1表示氫或金屬原子〕。
以下對(duì)通式(I)-通式(V)表示的化合物分別稱為化合物(I)-化合物(V)。
在通式(I)-通式(V)中的各基團(tuán)的定義中，作為烷基和烷?；耐榛糠质侵辨溁蛑ф湢詈?-22個(gè)碳原子的烷基，例如可以舉出甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基、新戊基、己基、庚基、癸基、十五烷基、二十烷基、二十二烷基等；作為鏈烯基，指直鏈或支鏈含碳原子2-22的鏈烯基，例如可以舉出乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、癸烯基、十五碳烯基、二十碳烯基、二十二碳烯基等。所說(shuō)芳基表示苯基或萘基；作為金屬原子，可以舉出鋰、鈉、鉀等。
作為取代烷基和取代烷?；娜〈缈梢耘e出羥基、羧基、磺基等。作為取代芳基的取代基，例如可以舉出烷基等，所說(shuō)烷基表示與上述烷基具有同樣的定義。
作為糖化合物，優(yōu)選使用化合物(I)或化合物(II)中的環(huán)糊精衍生物，特別優(yōu)選甲基化的環(huán)糊精。例如可以舉出α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、γ-環(huán)糊精、二甲基-β-環(huán)糊精、三甲基-β-環(huán)糊精、羥乙基-β-環(huán)糊精、2-羥丙基-α-環(huán)糊精、2-羥丙基-β-環(huán)糊精、羧甲基-β-環(huán)糊精、糖基-β-環(huán)糊精、麥芽糖基-α-環(huán)糊精、麥芽糖基-β-環(huán)糊精、部分(パ-シヤリ)-甲基-β-環(huán)糊精、α-環(huán)糊精硫酸酯、β-環(huán)糊精硫酸酯等。
作為蛋白增溶劑，優(yōu)選使用化合物(III)、化合物(IV)或化合物(V)等表面活性劑，特別優(yōu)選非離子型表面活性劑、陰離子型表面活性劑。作為非離子型表面活性劑，例如可以舉出聚氧乙烯十二烷基醚、聚氧乙烯十六烷基醚、聚氧乙烯十八烷基醚、聚氧乙烯十八碳烯基醚、聚氧乙烯二十二烷基醚、聚氧乙烯單月桂酸酯、聚氧乙烯單硬脂酸酯、聚氧乙烯單油酸酯、聚氧乙烯月桂酰胺、聚氧乙烯硬脂酰胺、蔗糖脂肪酸酯等；作為陰離子型表面活性劑，例如可以舉出十十烷基苯磺酸鈉、正十二烷基苯磺酸鈉、月桂基硫酸鈉、高級(jí)醇硫酸酯鈉等。
作為二價(jià)金屬原子鹽，可以舉出0.01-20mM的鎂鹽、鈣鹽、錳鹽、鎳鹽、鈷鹽等，優(yōu)選使用0.01-20mM的鎂鹽。
本發(fā)明的特征在于使糖化合物和/或蛋白增溶劑與膽甾醇測(cè)定試劑體系共存，而膽甾醇測(cè)定試劑體系本身可根據(jù)下述的反應(yīng)原理，按照一般方法配制。其中，作為色素源和測(cè)定波長(zhǎng)沒(méi)有限定。
色素＋5H2O(λmax＝555nm)EMSEN-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-琥珀酰乙二胺
NAD(P)H＋H+(λmax＝340nm)例如，作為色素源，一般使用4-氨基安替比林與苯酚、4-氯苯酚、間甲酚、3-羥基-2，4，6-三碘苯甲酸(HTIB)等苯酚類的組合，除此之外，還可以使用4-氨基安替比林與已知可作為Trinder’s試劑(同仁化學(xué)研究所第19版總合目錄，1994年)使用的下列化合物組合使用，所說(shuō)化合物有N-磺丙基苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)間甲苯胺(TOOS)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺(MAOS)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(DAOS)、N-乙基-N-磺丙基間甲苯胺(TOPS)、N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(HDAOS)、N，N-二甲基間甲苯胺、N，N-二磺丙基-3，5-二甲氧基茉胺、N-乙基-N-磺丙基間甲苯胺、N-乙基-N-磺丙基苯胺、N-乙基-N-磺丙基-3，5-二甲氧基苯胺、N-磺丙基-3，5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-磺丙基-3，5-二甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)間茴香胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺等苯胺類或者N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-琥珀酰乙二胺(EMSE)、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-乙?；叶返?。另外，作為高靈敏度的色素源，也可以使用特公昭60-33479中所示的10-(N-甲基氨基甲?；?-3，7-雙(二甲基氨基)吩噻嗪(MCDP)、在特公開(kāi)4-27839中所示的雙〔3-雙(4-氯苯基)甲基-4-二甲基氨基苯基〕胺(BCMA)、特開(kāi)昭62-296中所示的色素源等，另外，4-氨基安替比林或者上述的Trinder’s試劑也可以組合使用。作為色素源的濃度，優(yōu)選為0.01-10mg/ml，這要受溶解度關(guān)系的限制。
作為膽甾醇酯水解酶、膽甾醇氧化酶或膽甾醇脫氫酶，可以舉出通常市售的，由一些對(duì)膽甾醇酯具有水解能力的微生物或動(dòng)物得來(lái)的膽甾醇酯酶或脂蛋白脂肪酶、由一些能將膽甾醇氧化而生成過(guò)氧化氫的微生物得來(lái)的膽甾醇氧化酶、由微生物或動(dòng)物得來(lái)的膽甾醇脫氫酶等，但是，為了進(jìn)一步提高這些酶的特異性和穩(wěn)定性，可以使用通過(guò)以聚乙二醇為主成分的基團(tuán)、水溶性的低聚糖殘基、磺丙基等對(duì)上述的酶進(jìn)行化學(xué)修飾而獲得的酶。另外，按照基因工程的操作從這些酶中提取基因并將其導(dǎo)入別的微生物中而產(chǎn)生的酶或?qū)@些酶進(jìn)行化學(xué)修飾而獲得的修飾體，或者將這些基因改變而產(chǎn)生的酶，或?qū)@些酶進(jìn)行化學(xué)修飾而獲得的修飾體等也適合使用。
作為用于修飾所說(shuō)酶的試劑(化學(xué)修飾劑)，例如可以舉出在聚乙二醇上鍵合一種能夠與氨基鍵合的基團(tuán)而生成的化合物{例如在聚乙二醇上鍵合一種能夠與N-羥基琥珀酰亞氨基等氨基鍵合的基團(tuán)而生成的Sunbright VFM 4101〔日本油脂(株)制〕等}、具有聚乙二醇結(jié)構(gòu)和酸酐結(jié)構(gòu)的Sunbright AKM系列、同樣的ADM系列、同樣的ACM系列〔每一種皆為日本油脂(株)制化學(xué)工學(xué)論文集，第20卷，第3號(hào)，459頁(yè)，1994年〕、在聚乙二醇與聚丙二醇的共聚物上鍵合一種能夠與氨基鍵合的基團(tuán)而生成的化合物、聚乙二醇單甲基丙烯基單甲醚與馬來(lái)酸酐的共聚物等。另外，作為聚氨酯化學(xué)修飾劑的聚氨酯P4000activated.(ベ-リニガ-マンハイム社制Enzyme modification set能書)、作為葡聚糖化學(xué)修飾劑的葡聚糖T40，TCT-activated(同)、1，3-丙烷磺內(nèi)酯等也可以使用。
下面例示出使上述化學(xué)修飾劑與酶反應(yīng)的方法，但本發(fā)明不受這些例子的制約。首先，將所說(shuō)的酶溶解于pH8以上的磷酸緩沖液等緩沖液中，在0-50℃下添加例如0.01-500倍摩爾量的Sunbright，攪拌5分鐘-24小時(shí)?？梢詫⒃摲磻?yīng)液直接使用或者根據(jù)需要通過(guò)限外過(guò)濾膜除去低分子物質(zhì)后使用。膽甾醇酯水解酶、膽甾醇氧化酶和膽甾醇脫氫酶的用量?jī)?yōu)選為0.1-100μ/ml。
本發(fā)明的方法可以適用于血液、尿等含有LDL或VLDL的體液。
下面舉例說(shuō)明本發(fā)明的定量法。
方法1在實(shí)施本發(fā)明時(shí)，首先配制糖化合物溶液和/或蛋白增溶劑溶液。糖化合物溶液的配制是將糖化合物溶解于適當(dāng)?shù)木彌_液中，例如溶解于50mM的Tris-HCl緩沖液(pH7.4)中，使其在反應(yīng)時(shí)的濃度例如為100mM以下，優(yōu)選為3-80mM?？梢灶A(yù)先使糖化合物共存于膽甾醇測(cè)定試劑中。蛋白增溶劑溶液的配制是將蛋白增溶劑溶解于適當(dāng)?shù)木彌_液中，例如溶解于50mM的Tris-HCl緩沖液(pH7.4)中，使其與膽甾醇測(cè)定試劑共存，使其在反應(yīng)時(shí)的濃度例如在50g/l以下，優(yōu)選在0.1-20g/l以下。所說(shuō)試劑由與糖化合物溶液和/或膽甾醇測(cè)定試劑共存的蛋白增溶劑溶液來(lái)調(diào)制(在不使用蛋白增溶劑溶液的情況下，使糖化合物預(yù)先共存于膽甾醇測(cè)定試劑中)，在20-50℃，優(yōu)選在30-40℃保溫約5分鐘。然后將試樣直接地加入，或者根據(jù)需要用水或食鹽水稀釋后再加入上述的試劑中，使其反應(yīng)5-30分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，以340-900nm，例如，在單波長(zhǎng)的情況下，以555nm；在雙波長(zhǎng)的情況下，以主波長(zhǎng)600nm，副波長(zhǎng)700nm來(lái)測(cè)定該反應(yīng)液的吸光度，據(jù)此算出膽甾醇含量(在雙波長(zhǎng)的情況下，由按該兩波長(zhǎng)所獲吸光度的差值算出)。
使用按超離心法由血清分離出的HDL、LDL、VLDL和CM的各部分為樣品，用上述試劑測(cè)定其中的膽甾醇含量。其結(jié)果，通過(guò)糖化合物與蛋白增溶劑的組合，使得HDL膽甾醇、LDL膽甾醇、VLDL膽甾醇、CM膽甾醇的反應(yīng)性發(fā)生差異，由此可以確認(rèn)，通過(guò)糖化合物與蛋白增溶劑的組合，可使其與各種脂蛋白的反應(yīng)性產(chǎn)生差異。
當(dāng)使糖化合物50mM與蛋白增溶劑聚氧乙烯單月桂酸酯5g/l組合并共存于膽甾醇測(cè)定試劑(未修飾)中時(shí)，各種脂蛋白反應(yīng)性的差異示于表1中。
表1
-、+、++、+++分別表示反應(yīng)性強(qiáng)度，其順序?yàn)?＜+＜++＜+++。
當(dāng)使糖化合物三甲基-β-環(huán)糊精5mM與蛋白增溶劑5g/l組合并共存于膽甾醇測(cè)定試劑(未修飾)中時(shí)，各種脂蛋白反應(yīng)性的差異示于表2中。
表2
-、+、++、+++分別表示反應(yīng)強(qiáng)度，其順序?yàn)?＜+＜++＜+++。
方法2糖化合物溶液的配制是將糖化合物溶解于適當(dāng)?shù)木彌_液中，例如溶解于50mM的Tris-HCl緩沖液(pH7.4)中，使其在反應(yīng)時(shí)的濃度例如在100mM以下，優(yōu)選為3-80mM。蛋白增溶劑溶液的配制是將蛋白增溶劑溶解于適當(dāng)?shù)木彌_液中，例如溶解于50mM Tris-HCl緩沖液(pH7.4)中，使其在反應(yīng)時(shí)的濃度例如在50g/l以下，優(yōu)選為0.1-20g/l。將試樣直接地加入，或者根據(jù)需要用水或生理食鹽水稀釋后的試樣加入預(yù)先加熱至20-50℃，優(yōu)選30-40℃，例如37℃的糖化合物溶液和/或蛋白增溶劑溶液中，例如在37℃下加熱5分鐘，5分鐘后測(cè)定所獲得溶液在555nm處的吸光度(E1)。然后添加入預(yù)先加熱至20-50℃，優(yōu)選30-40℃，例如37℃的膽甾醇測(cè)定試劑，攪拌，5分鐘后在相同波長(zhǎng)處測(cè)這吸光度〔E2(濃度補(bǔ)正后的值)〕。使用含有已知濃度膽甾醇的標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行同樣的操作，根據(jù)對(duì)(E2-E1)值的比較算出膽甾醇的含量。
下面根據(jù)實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明的方案。
用于實(shí)施本發(fā)明的最佳方案實(shí)施例1用于直接定量LDL膽甾醇的本方法與瓊脂糖電泳法(臨床檢查，第29卷，1344頁(yè)，1985年)的比較。
本方法的試劑組成第一試劑三甲基-β-環(huán)糊精 5mM聚氧乙烯單月桂酸酯 5g/lEMSE 1.1mMTris緩沖液(pH7.0) 30mM第二試劑膽甾醇酯酶(未修飾) 1.0U/ml
膽甾醇氧化酶(未修飾) 5.0U/ml過(guò)氧化物酶25U/ml4-氯基安替比林2.2mMTris緩沖液(pH7.0) 30mM按照本方法，首先將血清樣品50μl添加到預(yù)先加熱至37℃的第一試劑2.25ml中，在37℃下加熱5分鐘，5分鐘后測(cè)定所獲溶液在555nm處的吸光度(E1)。然后加入預(yù)先加熱至37℃的第二試劑0.75ml，5分鐘后測(cè)定在相同波長(zhǎng)處的吸光度〔E2(濃度補(bǔ)正后的值)〕。使用一種膽甾醇濃度為200mg/dl的標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行同樣的操作，通過(guò)比較(E2-E1)的數(shù)值算出LDL膽甾醇的含量。
按照瓊脂糖電泳法，對(duì)電泳后在支持體上的脂蛋白部分進(jìn)行膽甾醇的酶染色，用光密度計(jì)(クリニスキヤン株式會(huì)社研究所)定量測(cè)定LDL膽甾醇的含量。
所獲結(jié)果示于表3中。
表3
如表3所示，顯示出按本發(fā)明方法獲得的結(jié)果與按電泳法獲得的結(jié)果具有良好的相關(guān)性。
實(shí)施例2
除了將第一試劑中所用的糖化合物與蛋白增溶劑組合改變之外，其余按與實(shí)施例1的本發(fā)明方法同樣的步驟進(jìn)行，對(duì)血清樣品的20個(gè)試樣進(jìn)行測(cè)定，獲得了與瓊脂糖電泳法相關(guān)的相關(guān)系數(shù)。
第一試劑的組成A.三甲基-β-環(huán)糊精 5mM聚氧乙烯單月桂酸酯 5g/lEMSE 1.1mMTris緩沖液(pH7.0)30mMB.三甲基-β-環(huán)糊精 5mM十二烷基苯磺酸鈉 5g/lEMSE 1.1mMTris緩沖液(pH7.0)30mMC.二甲基-β-環(huán)糊精 5mM聚氧乙烯單月桂酸酯 5g/lEMSE 1.1mMTris緩沖液(pH7.0)30mMD.二甲基-β-環(huán)糊精 5mM十二烷基苯磺酸鈉 5g/lEMSE 1.1mMTris緩沖液(pH7.0)30mM按照本方法，使用日立7070自動(dòng)分析裝置分別進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定條件如下所示。
樣品量 4μl第一試劑300μl第二試劑100μl測(cè)定波長(zhǎng) 主波長(zhǎng)600nm；副波長(zhǎng)700nm所獲結(jié)果示于表4中。表4
如表4所示，顯示出按本發(fā)明方法獲得的結(jié)果與按電泳法獲得的結(jié)果有良好的相關(guān)性。
實(shí)施例3除了向?qū)嵤├?的B和D中添加金屬原子鹽之外，其余按照與實(shí)施例2同樣的步驟進(jìn)行，對(duì)血清樣品的20個(gè)試樣進(jìn)行測(cè)定，獲得了與瓊脂糖電泳法相關(guān)的相關(guān)系數(shù)。
第一試劑的組成E.三甲基-β-環(huán)糊精 5mM十二烷基苯磺酸鈉 5g/lMgCl2·6H2O6mg/mlEMSE 1.1mMTris緩沖液(pH7.0)30mMF.二甲基-β-環(huán)糊精 5mM十二烷基苯磺酸鈉 5g/lMgCl2·6H2O6mg/lEMSE 1.1mMTris緩沖液(PH7.0)30mM結(jié)果示于表5中。
表5
如表5所示，顯示出按本發(fā)明方法獲得的結(jié)果與按電泳法所獲結(jié)果具有良好的相關(guān)性。
實(shí)施例4對(duì)用于直接定量VLDL膽甾醇的本方法與瓊脂糖電泳法(臨床檢查，第29卷，1344頁(yè)，1985年)，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1同樣的操作來(lái)作比較。
本方法的試劑組成第一試劑2-羥丙基-β-環(huán)糊精 5mM聚氧乙烯十二烷基醚 5g/lEMSE 1.1mMTris緩沖液(pH7.0) 30mM第二試劑修飾的膽甾醇酯酶 1.0U/ml修飾的膽甾醇氧化酶 5.0U/ml過(guò)氧化物酶 25U/ml4-氨基安替比林 2.2mMTris緩沖液(pH7.0) 30mM應(yīng)說(shuō)明，所說(shuō)修飾的膽甾醇酯酶和修飾的膽甾醇氧化酶的制備是將膽甾醇酯酶或膽甾醇氧化酶溶解于20mM的磷酸緩沖液(pH8)中(10mg/ml)，在5℃下冷卻后，向其中加20倍摩爾量的Sunbright4001(日本油脂)，使其溶解，在5℃下反應(yīng)4小時(shí)，用聚乙二醇進(jìn)行修飾，所獲反應(yīng)液即可直接使用(聚乙二醇部分的分子量6000)。
結(jié)果示于表6中。
表6
如表6所示，顯示出按本發(fā)明方法獲得的結(jié)果與按電泳法獲得的結(jié)果具有良好的相關(guān)性。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性按照本發(fā)明，可以提供一種不需要煩雜的分級(jí)分離操作的簡(jiǎn)便而且適用于自動(dòng)分析裝置的LDL膽甾醇或VLDL膽甾醇的定量法。
權(quán)利要求
1.低密度脂蛋白(LDL)或極低密度脂蛋白(VLDL)中的膽甾醇的定量法，其特征在于，在糖化合物和/或蛋白增溶劑的存在下測(cè)定試樣中的LDL或VLDL中的膽甾醇含量。
2.LDL中的膽甾醇的定量法，其特征在于，在糖化合物和/或蛋白增溶劑的存在下測(cè)定試樣中的LDL中的膽甾醇含量。
3.VLDL中的膽甾醇的定量法，其特征在于，在糖化合物和/或蛋白增溶劑的存在下測(cè)定試樣中的VLDL中的膽甾醇含量。
4.如權(quán)利要求1-3所述的定量法，其中所說(shuō)的糖化合物是葡萄糖衍生物。
5.如權(quán)利要求4所述的定量法，其中所說(shuō)的糖化合物是由下列通式(I)或通式(II)表示的化合物，所說(shuō)通式(I)為 〔式中，R1、R2和R3可以相同或不同，表示氫原子、取代或非取代烷基、取代或非取代烷?；?、SO3M2(式中，M2表示氫原子或金屬原子)、-(葡糖基)p-H(式中，p表示1或2)或-(麥芽糖基)q-H(式中，q表示1或2)；R4和R5可以相同或不同，表示氫原子、金屬原子或SO3M3(式中，M3表示氫原子或金屬原子)；m表示6-8〕〔以下稱為化合物(I)，對(duì)于其他通式編號(hào)的化合物同樣類推〕；所說(shuō)通式(II)為 〔式中，R6、R7和R8可以相同或不同，表示氫或SO3M4(式中，M4表示氫原子或金屬原子)；R9表示氫原子、OM5(式中，M5表示氫原子或金屬原子)或OSO3M6(式中，M6表示氫原子或金屬原子)；R10表示氫原子、金屬原子或SO3M7(式中，M7表示氫原子或金屬原子)；n表示4-8000的整數(shù)〕。
6.如權(quán)利要求5所述的定量法，其中所說(shuō)的糖化合物是環(huán)糊精衍生物。
7.如權(quán)利要求1-6所述的定量法，其中所說(shuō)的蛋白增溶劑為通式(III)、(IV)或(V)表示的化合物，其中，通式(III)為R11(C2H4O)a-(C3H6O)bR12(III)〔式中，a和b表0-200的整數(shù)；R11表示R20-X-O-(式中，R20表示烷基或鏈烯基；X表示單鍵或CO)，或者H-(CH2CH2O)c-N(R21)-(式中，c表示1-200的整數(shù)；R21表示烷基或鍵烯基)；R12表示C2H4COOR22、C3H6COOR23、C2H4CH(COOR24)2或C2H4CH(COOR25)(COOR26)(式中，R22、R23、R24、R25及R26相同或不同，表示氫原子、金屬原子、烷基或鏈烯基)但是a和b不能同時(shí)為0，不過(guò)兩種成分可以任意的比例存在〕通式(IV)為 (式中，R13、R14、R15、R16和R18相同或不同，表示烷?；?通式V為R19-Y-SO3M1(V)〔式中，R19表示烷基、鏈烯基或者取代的或非取代的芳基；Y表示單鍵、 -O-、-CH(R27)-(式中，R27表示烷基或鏈烯基)、-CH2CH(OH)(CH2)d-(式中，d表示1-22的整數(shù))、-CH＝CH(CH2)e-(式中，e表示1-22的整數(shù))、-OCOCH(CH2COOR28)-(式中，R28表示烷基或鏈烯基)或者它們的混合物；M1表示氫原子或金屬原子〕。
8.如權(quán)利要求7所述的定量法，其中所說(shuō)的蛋白增溶劑為非離子型表面活性劑或陰離子型表面活性劑。
9.如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的定量法，其中，在測(cè)定膽甾醇含量時(shí)存在二價(jià)金屬原子鹽。
10.如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的定量法，其中，使膽甾醇酯水解酶和膽甾醇氧化酶或膽甾醇脫氫酶在試樣中發(fā)生反應(yīng)，通過(guò)定量分析由于這種反應(yīng)而生成的過(guò)氧化氫或還原型輔酶來(lái)測(cè)定膽甾醇的含量，在該測(cè)定方法中所用的膽甾醇酯水解酶、膽甾醇氧化酶或膽甾醇脫氫酶是經(jīng)化學(xué)修飾或未修飾的膽甾醇酯酶、經(jīng)化學(xué)修飾或未修飾的膽甾醇氧化酶或經(jīng)化學(xué)修飾或未修飾的膽甾醇脫氫酶。
11.一種用于LDL或VLDL中的膽甾醇的定量試劑，該試劑以糖化合物和/或蛋白增溶劑作為成分。
12.一種用于LDL中的膽甾醇的定量試劑，該試劑以糖化合物和/或蛋白增溶劑作為成分。
13.一種用于VLDL中的膽甾醇的定量試劑，該試劑以糖化合物和/或蛋白增溶劑作為成分。
14.一種用于LDL或VLDL中的膽甾醇的定量試劑，該試劑由糖化合物與蛋白增溶劑組成。
15.一種用于LDL中的膽甾醇的定量試劑，該試劑由糖化合物與蛋白增溶劑組成。
16.一種用于VLDL中的膽甾醇的定量試劑，該試劑由糖化合物與蛋白增溶劑組成。
17.如權(quán)利要求11-16中任一項(xiàng)所述的定量試劑，其中所說(shuō)的糖化合物是葡萄糖衍生物。
18.如權(quán)利要求17所述的定量試劑，其中所說(shuō)的糖化合物是化合物(I)或化合物(II)。
19.如權(quán)利要求18所述的定量試劑，其中所說(shuō)的糖化合物是環(huán)糊精衍生物。
20.如權(quán)利要求11-19中任一項(xiàng)所述的定量試劑，其中所說(shuō)的蛋白增溶劑是化合物(III)、化合物(IV)或化合物(V)。
21.如權(quán)利要求20所述的定量試劑，其中所說(shuō)的蛋白增溶劑是非離子型表面活性劑或陰離子型表面活性劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及低密度脂蛋白(LDL)中的膽甾醇或極低密度脂蛋白(VLDL)中的膽甾醇的定量法，其特征在于在糖化合物和/或蛋白增溶劑的存在下測(cè)定試樣中LDL中的膽甾醇含量或VLDL中的膽甾醇含量。
文檔編號(hào)C12Q1/32GK1148891SQ96190206
公開(kāi)日1997年4月30日 申請(qǐng)日期1996年3月15日 優(yōu)先權(quán)日1995年3月20日
發(fā)明者柏原典彥, 多多納俊雄, 首藤榮子, 杉內(nèi)博幸, 入江徹美, 上釜兼人 申請(qǐng)人:協(xié)和梅迪克斯株式會(huì)社