專利名稱：分析活檢樣品中干擾素調(diào)節(jié)因子-1特異性核糖核酸以診斷癌癥，癌變前狀態(tài)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用一種分子標(biāo)記，干擾素調(diào)節(jié)因子-1(IRF-1)診斷癌癥，癌變前狀態(tài)以及對(duì)其它形式疾病的易感性的方法。
惡性細(xì)胞的轉(zhuǎn)化是一個(gè)多步驟過程，該過程是由于在參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)的多個(gè)遺傳位點(diǎn)處進(jìn)行性地獲得結(jié)構(gòu)變化引起的。已經(jīng)有文獻(xiàn)完整地記載，在人類惡性細(xì)胞中，起顯性作用的原癌基因中發(fā)現(xiàn)的功能增加的突變常常伴隨有腫瘤抑制基因中功能損失的突變的發(fā)生。已經(jīng)鑒別出了幾種腫瘤抑制基因，這些基因的突變或缺失似乎是人類癌癥發(fā)生的關(guān)鍵，在這些基因中，p53，RB和WT1的基因產(chǎn)物存在于核中，并且作為基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)子起作用(參見Kaelin，Jr.，et al.，1991；Lewin，1991；Marshall，1991；Weinberg，1991；Haber and Housman，1992；Vogelstein and Kinzler，1992；Levine，1993的評(píng)論)。
最初鑒別出的兩個(gè)結(jié)構(gòu)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，IRF-1和IRF-2是作為干擾素(IFN)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)子(Miyamoto et al.，1988；Harada etal.，1989；Tanaka and Taniguchi，1992)。還有其他人在不同文章中記載了鑒定出IRF-1(Pine et al.，1990；Yu-Lee et al.，1990；Abdollahi et al.，1991；Stark and Kerr，1992)。IRF-1作為一種轉(zhuǎn)錄激活子起作用，而IRF-2通過與IRF-1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合到相同的DNA序列成分(IRF-Es)上而抑制IRF-1的作用(Harada et al.，1989；Tanaka et al.，1993)。IRF-Es既存在于IFN-α啟動(dòng)子也存在于IFN-β啟動(dòng)子中，還在存在于IFN-誘導(dǎo)性基因啟動(dòng)子中的IFN-受激應(yīng)答因子(ISREs)中(Friedman and Stark，1985；Shirayoshiet al.，1987；Levy et al.，1988)。已經(jīng)證實(shí)對(duì)于I型IFN基因和某些IFN誘導(dǎo)性基因IRF-1起著激活子的作用(Fujita et al.，1989；Harada et al.，1990；Au et al.，1992；Pine et al.，1992；Reis et al.，1992；Matsuyama et al.，1993；Ruffner et al.，1993；Kamijo et al.，1994)。
還有人提供了證實(shí)IRF-1具有腫瘤抑制劑作用的證據(jù)；(i)IRF-1顯示抗增殖活性(Yamada et al.，1990；Kirchhoff et al.，1993；T.Tamura，M.S.L.，and T.Kawakami，結(jié)果未出版)(ii)在NIH3T3細(xì)胞中，阻遏物IRF-2的過量表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化并且通過激活劑IRF-1的伴隨過量表達(dá)而抑制這種細(xì)胞轉(zhuǎn)化(Harada et al.，1993)以及(iii)帶有IRF-1基因中的無(wú)效突變的一級(jí)胚胎成纖維細(xì)胞(EFs)(IRF-1-/-小鼠)對(duì)激活形式的c-Ha-ras的轉(zhuǎn)化敏感，這種轉(zhuǎn)化特性也可以在來自p53-/-小鼠的EFs中看到，但不存在于野生型EFs中(Tanaka et al.，1994)。這些結(jié)果共同暗示著IRF-1功能的損失歸因于人類瘤的形成發(fā)育。
已將人類IRF-1基因定位到5q31.1(Itoh et al.，1991； Willmanet al.，1993；Harada et al.，1994)。以前曾測(cè)出在人白血病和間質(zhì)缺失染色體5q的MDS中染色體譜帶5q31是最普遍缺失的片段，稱之為“關(guān)鍵區(qū)”(Le Beau et al.，1986； Nimer and Golde，1987；Le Beau et al.，1989；Pederson and Jensen，1991)。Del(5q)也是具有頑固性貧血和異常巨核細(xì)胞的特定臨床脊髓發(fā)育紊亂的一個(gè)標(biāo)志，稱作為“5q-綜合癥”，其中所述的“紊亂”主要出現(xiàn)于老年婦女(Van den Berghe et al.，1985)。因此，人們認(rèn)為該染色體區(qū)包含了一個(gè)腫瘤抑制基因。但是，根據(jù)與del(5q)相關(guān)的骨髓疾病反復(fù)不定的臨床特征，這種腫瘤抑制基固的失活可能伴隨了變異的其它遺傳活動(dòng)的發(fā)生例如不同類型的骨髓紊亂癥中癌基因的激活(Carter et al.，1992)。
曾有人證實(shí)，在具有del(5q)或5q31易位的MDS和白血病的13例典型病例中每一病例都缺失了一個(gè)或兩個(gè)IRF-1等位基因。再者，在一例再發(fā)急性白血癥中發(fā)現(xiàn)伴隨有殘留等位基固的缺失的一個(gè)IRF-1等位基因的失活基因重排(Willman et al.，1993)。該結(jié)果支持了這樣的觀點(diǎn)，即IRF-1可能是del(5q)中缺失的關(guān)鍵的腫瘤抑制基因；因此，一個(gè)或兩個(gè)IRF-1等位基因的丟失可歸因于未抑制的細(xì)胞增殖，從而促進(jìn)了人白血癥和MDS的發(fā)生。另一方面，兩個(gè)IRF-1等位基因仍保留于某些顯示了5q缺失的MDS/白血癥患者(Bou-ltwood et al.，1993；Le Beau et al.，1993)。
本發(fā)明解決的問題是找到一種使用分子標(biāo)記診斷癌癥的新方法以及提供該方法的手段。
本發(fā)明提供的診斷癌癥，癌變前狀態(tài)或?qū)ζ渌问郊膊〉囊赘行缘男路椒ㄒ罁?jù)對(duì)血液或其它活檢樣品中IRF-1特異性RNA的分析。
本發(fā)明是基于意想不到地發(fā)現(xiàn)腫瘤抑制基因IRF-1的失活的新機(jī)理似乎在腫瘤和癌變前狀態(tài)，尤其是在造血系統(tǒng)疾病中起著決定性作用。該機(jī)理似乎并不依賴于以前描述的IRF-1的缺失或突變，因?yàn)樗l(fā)生于不可檢測(cè)到這種變化的病例中。失活作用是通過一種拼接方式經(jīng)改變的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本實(shí)現(xiàn)的，因而是在RNA水平上。更具體地講，在來自于健康的供體或患有白血病或脊髓發(fā)育不良綜合癥的患者的樣品中可以檢測(cè)到缺失了外顯子2或外顯子2和3的RNA分子。這些經(jīng)改變的轉(zhuǎn)錄本并不導(dǎo)致產(chǎn)生功能性IRF-1多肽。對(duì)這種不尋常的外顯子遺失的敏感性似乎是人類IRF-1基因的內(nèi)在特性。令人興奮的是，與健康供體相比，大量具有癌變前狀態(tài)或惡性造血系統(tǒng)的患者中，全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本與失去了外顯子2或外顯子2和3的轉(zhuǎn)錄本之間的比例顯著地發(fā)生變化。因此，拼接方式發(fā)生改變的IRF-1轉(zhuǎn)錄本可以作為惡性疾病，尤其是白血病，或癌變前的狀態(tài)，特別是脊髓發(fā)育不良綜合癥，或?qū)ζ渌问郊膊〉囊赘行苑肿訕?biāo)記。
由本發(fā)明提供的診斷癌癥，癌變前狀態(tài)，或?qū)ζ渌问叫图膊〉囊赘行缘男路椒ㄒ罁?jù)于對(duì)血液或其它活檢樣品中IRF-1特異性RNA分析。優(yōu)選的是，這種分析是通過使用IRF-1特異性引物的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，尤其是擴(kuò)增步驟前結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄(RT)步驟來實(shí)現(xiàn)。用于PCR的優(yōu)選的引物具有下列序列5′TTCCCTCTTCCACTCGGAGT3′(SEQ ID NO1)或5′GATATCTGGCAGGGAGTTCA3′(SEQ ID NO2)。能恰當(dāng)?shù)剡m用于逆轉(zhuǎn)錄的引物具有下列序列5′CTCTGGTCTTTCACCTCCTC3′(SEQ ID NO3).應(yīng)該注意到上面公開的特異引物僅是舉例，并且可由其它合適的寡聚核苷酸替代。
除RT/PCR外，也可以使用其它的分析RNA的方法，例如RT與連接酶鏈反應(yīng)(LCR)結(jié)合。
在另一方面，本發(fā)明包括IRF-1特異性寡聚核苷酸，優(yōu)選的是具有SEQ ID Nos.1，2或3的序列的這類核苷酸，及其它們?cè)谏鲜龇椒ㄖ械膽?yīng)用。
再者，為了診斷目的，可以采用合適的生物學(xué)或免疫學(xué)檢測(cè)法測(cè)出從血液或其它活檢物質(zhì)獲得的樣品中生物學(xué)活性IRF-1多肽的含量。
人類IRF-1基因中外顯子的缺失人類IRF-1基因由10個(gè)外顯子組成，其中在第二個(gè)外顯子內(nèi)定位了起始因子ATG序列(圖1A，Cha et al.，1993；Harada et al.，1994)。在利用S1定位法分析各種細(xì)胞系中IRF-1 mRNA表達(dá)期間，我們注意到不尋常的轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)。如圖1B所示，使用來自于健康供體(參見注1)的外周血單核(PBM)細(xì)胞的總RNA檢測(cè)到三條被保護(hù)的譜帶。最上部的譜帶(譜帶1,248個(gè)核苷酸)與完整的IRF-1mRNA相一致。從其大小判斷，其它兩條譜帶分別對(duì)應(yīng)于缺失外顯子2的RNA(譜帶2，180個(gè)核苷酸)，和缺失外顯子2和3的RNA(譜帶3，80個(gè)核苷酸)。但是，在兩種造血細(xì)胞系，HL-60和HEL中，由于mRNA表達(dá)水平低，這些結(jié)果不明顯。對(duì)于HL-60，這可以解釋為缺少一個(gè)IRT-1等位基因，因?yàn)樵摷?xì)胞已經(jīng)失去了一個(gè)染色體5(Gall-agher et al.，1979)。為了獲得更多的這些RNA的定量及定性分析結(jié)果，接著，我們進(jìn)行了一個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試驗(yàn)。在該試驗(yàn)中，mRNA的逆轉(zhuǎn)錄之后緊接著PCR擴(kuò)增(RT-PCR)，其中將PCR產(chǎn)物(擴(kuò)增子)標(biāo)記為高比活性(參見詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)程序)。如圖1C所示，再次用來自PBM細(xì)胞的RNA檢測(cè)三條譜帶，該RNA用于診斷由S1定位分析產(chǎn)生的譜帶1、2和3(圖1A)。對(duì)PCR擴(kuò)增的cDNAs進(jìn)行的核苷酸序列分析結(jié)果表明，事實(shí)上上部的、中間的以及下部的譜帶分別對(duì)應(yīng)于完整IRF-1 mRNA，缺失外顯子2的IRF-1 mRNA(△2 mRNA)，以及缺失外顯子2和3的IRF-1 mRNA(△23 mRNA)(結(jié)果未表示)。在HL-60以及HEL細(xì)胞中也表達(dá)△2和△23 mRNAs。另外，含有轉(zhuǎn)染得的19 kb人IRF-1基因的小鼠NIH 3T3衍生的R27-3細(xì)胞系(Harada etal.，1993)也顯示相同的外顯子缺失類型，表明這種外顯子缺失的發(fā)生不依賴于宿主細(xì)胞類型以及染色體的位置。相反，利用小鼠特性引物對(duì)小鼠IRF-1 mRNA進(jìn)行類似的RT-PCR分析時(shí)，在R27-3和鼠造血細(xì)胞系BAF/BO3中僅擴(kuò)增了代表完整mRNA的單一譜帶(圖1D)。因此所觀察到的外顯子缺失可能是人IRF-1基因的內(nèi)在特性。重要的是，在△2和△23 mRNAs中外顯子2的缺失應(yīng)該導(dǎo)致真正的起始因子AUG序列的缺失(圖1A，Harada et al.，1994)(見下文)。
(注1)檢測(cè)了來自健康供體的另外9個(gè)樣品，并且它們都基本上顯示有類似于該例中觀察到的表達(dá)方式。
在MDS/白血病中加速了IRF-1 mRNA外顯子缺失已經(jīng)證實(shí)IRF-1起著腫瘤抑制劑的作用(Harada et al.，1993；Tanaka et al.，1994)，并且一個(gè)或兩個(gè)IRF-1等位基因的缺失和/或重排是人MDS和白血病發(fā)展的關(guān)鍵(Willman et al.，1993)。另一方面，僅一定比例的這些造血紊亂癥伴隨有5q異常(Kerim etal.，1990； Pederson-Bjergaard et al.，1990；Willman et al.，1993)。上述發(fā)現(xiàn)促使我們檢查來自于MDS或繼發(fā)性MDS白血病患者的細(xì)胞中外顯子缺失的情形。從骨髓(BM)細(xì)胞或PBM細(xì)胞分離出總RNA并進(jìn)行RT-PCR分析。某些典型例子的結(jié)果示于圖2中。在來自健康供體的BM細(xì)胞和來自MDS/白血病患者的BM細(xì)胞之間明顯地存在顯著差異。事實(shí)上，這里提供的兩個(gè)樣本(Pts.228和356)中幾乎沒有可檢測(cè)到的代表完整IRF-1 mRNA的擴(kuò)增子，然而仍可檢測(cè)到代表△23 mRNA的擴(kuò)增子。相反，β-肌動(dòng)蛋白mRNA特異性擴(kuò)增子的量保持相對(duì)恒定(參見實(shí)驗(yàn)程序和表1)。
我們對(duì)來自MDS或繼發(fā)性MDS白血病患者的總共25個(gè)RNA樣本進(jìn)行類似的分析，結(jié)果概括于表1。首先通過圖像分析(Fujix Bas2000)定量地測(cè)定IRF特異性擴(kuò)增子的量，然后將其量標(biāo)準(zhǔn)化到來自相同樣本的-肌動(dòng)蛋白擴(kuò)增子的量；在該樣本RNAs中β-肌動(dòng)蛋白mRNA的表達(dá)相對(duì)地是恒定的(Makino et al.，1990；Foley et al.，1993)。進(jìn)一步將這些數(shù)目標(biāo)準(zhǔn)化到在來自健康供體的NBM.1細(xì)胞中存在的IRF-1和IRF-2擴(kuò)增子的水平(任意地規(guī)定到1.00)。因此，表1中顯示的數(shù)目表示與健康供體RNAs有關(guān)的完整的，△2、△23IRF-1 mRNAs和IRF-2 mRNA的表達(dá)，盡管表中數(shù)據(jù)沒有提供關(guān)于絕對(duì)mRNA拷貝數(shù)的信息。
顯然，代表完整IRF-1 mRNA的擴(kuò)增子并沒有在來自Pts.581和117細(xì)胞的RNA樣本中被檢測(cè)到，其中沒有任何一個(gè)樣本顯示在5q區(qū)發(fā)生細(xì)胞遺傳畸變(表1)(參見注2)。另外，從其它5個(gè)樣品(Pts.190，356，228，255，578)檢測(cè)到非常低水平的完整擴(kuò)增子，而△2和△23擴(kuò)增子，特別是△23擴(kuò)增子仍可檢測(cè)的。還采用RT-PCR/SSCP分析法分析這些患者樣本中的六個(gè)樣本的p53突變，并且除一個(gè)樣本(Pt.356)外所有樣本都沒有顯示發(fā)生這種突變的證據(jù)(表1；Sugi-moto et al.，1993)。盡管沒有象在上述樣品中觀察到的那樣深的程度，幾個(gè)其它樣本(例如Pts.570，716，194，199，707)也明顯地顯示了更低水平的完整IRF-1 mRNA擴(kuò)增子。我們還分析了來自不同類型造血惡性癥患者的RNA，并且發(fā)現(xiàn)在某些樣品，包括僅表達(dá)△23mRNA的4AML患者之中的兩個(gè)中有微量的或沒有完整IRF-1擴(kuò)增子(結(jié)果未顯示)。值得注意的是一些RNA樣本顯示出含量增加的IRF-2特異性擴(kuò)增子(例如Pts.581，199，534，715)。
(注2)就此范圍來說，對(duì)顯示有外顯子缺失加速的四個(gè)MDS或白血癥患者(Pts.255，356，707和716)進(jìn)行RT-PCR/SSCP分析既沒有顯示在IRF-1外顯子序列內(nèi)有任何DNA缺失或突變，DNA測(cè)序結(jié)果也沒有顯示已知影響拼接的內(nèi)含子序列的任何改變。另外，對(duì)這些患者的DNAs進(jìn)行Southern印跡分析也沒有顯示IRF-1基因有顯著重排的跡象(結(jié)果未顯示)。
△2和△23 mRNA產(chǎn)物的分析雖然△2和△23 mRNAs缺少IRF-1的真正的起始密碼子，但這些mRNA可能仍能指導(dǎo)新蛋白質(zhì)的合成。構(gòu)建與△2和△23 mRNAs相對(duì)應(yīng)的cDNAs，并用于指導(dǎo)體外轉(zhuǎn)錄-翻譯反應(yīng)。當(dāng)采用SDS-PAGE分析35S甲硫氨酸標(biāo)記的產(chǎn)物時(shí)，檢測(cè)到野生型的△2和△23 cDNA的特征譜帶(圖3A)。稱作為IRF-1 △2和IRF-1 △23的△2和△23cDNA產(chǎn)物的大小相當(dāng)于其合成分別在AUG密碼子32(在外顯子3中)和85(在外顯子4中)開始的被截短了的IRF-1蛋白質(zhì)。如圖3B所示，凝膠電泳移動(dòng)分析顯示IRF-1 △2和IRF-1 △23沒有結(jié)合到含有兩個(gè)高親合力IRF-Es的寡聚體(C1寡聚體；Tanaka et al.，1993)。每個(gè)cDNA與一個(gè)在其啟動(dòng)子含有IRF-Es的報(bào)道質(zhì)粒一起共轉(zhuǎn)染到IRF-陽(yáng)性細(xì)胞系(P19；Harada et al.，1990)結(jié)果顯示由完整IRF-1cDNA編碼的蛋白質(zhì)，但不是由△2或△23 cDNAs編碼的蛋白質(zhì)，能激活該報(bào)道質(zhì)粒(圖3c)?！?和△23 cDNAs與完整IRF-1 cDNA的共轉(zhuǎn)染并不影響IRF-1介導(dǎo)的基因的激活，這表明既不是IRF-1 △2也不是IRF-1 △23以顯性-陰性方式作用于IRF-1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活化(結(jié)果未顯示)。
完整的人類IRF-1但不是IRF-1 △23顯示腫瘤抑制劑活性在大多數(shù)完整IRF-1 mRNA的表達(dá)較低或不能檢測(cè)到的樣本中，△23 mRNA卻以相當(dāng)高的水平進(jìn)行表達(dá)(表1)。因此我們提出是否IRF-1 △23顯示了腫瘤抑制劑活性的論點(diǎn)。用含有為完整IRF-1或IRF-1 △23編碼的cDNA的表達(dá)載體，和潮霉素(hgr)抗性基因(pMiwhph；Kato et al.，1990)一起轉(zhuǎn)染能表達(dá)c-Ha-ras癌基因(Tanaka et al.，1994)的活性形式的IRF-1-/-EFs。將轉(zhuǎn)染子平鋪于甲基纖維素凝膠上培養(yǎng)。隨后計(jì)算hgr-抗性菌落數(shù)目。如表2所示，編碼IRF-1的cDNA的轉(zhuǎn)染導(dǎo)致深度地抑制菌落的形成，而對(duì)于編碼IRF-1 △23的cDNA沒有觀察到這樣的效果。這些結(jié)果表明，可能是由于失去了其DNA結(jié)合活性，IRF-1 △23缺少腫瘤抑制劑活性。
表1完整的IRF-1和交替拼接形式的IRF-1在來自MDS/白血病患者細(xì)胞中的表達(dá)年齡， ％原始a來源 性別 細(xì)胞 p53mut.b核型c[正常BM](NBM)NBM.1 BM 38，MN.D. N.D. N.D.
NBM.2 BM 65，MN.D. N.D. N.D.Pt.190 BM 38，F(xiàn)5.0％(-) N.D.
Pt.356 BM 74，M4.0％(+) 46，XY，-18.5q-，9q-，+marPt.441 BM 43，M4.0％(-) 46，XY，12p-，20q-，21p+/46，XY，12p-，20q-，21p+，21p+Pt.581 BM 65，M4.9％(-) 46，Xq-，Y，Bq+Pt.585 BM 45，F(xiàn)0.8％(-) 46，XX[RAEB]Pt.535 BM 54，M12.4％ (-) 46，XYPt.570 BM 61，M8.1％(+) 47，XY，-5，-7，-12，-18，+22，15p+，+4mar[RAEB-t]Pt.228 BM 72，M30.0％ (-) 46，XY[CMMol.]Pt.255 BM 34，M5.8％N.D. 46，XY，5q-，8p+，13q+，20q+Pt.492 PB 57，M9.0％N.D. 46，XYPt.519 BM 28，M0.5％N.D. 46，XYPt.711 PB 77，F(xiàn)0.0％N.D. N.D.
Pt.716 BM 52，M5.7％N.D. 46，XY，3q+，5p·q-，10p+，13q-[MDS/LEU.]Pt.117 PB 42.M-100％(-) 45，X，-YPt.194 BM 68，M43.6％ N.D. 46，XY/44，XY，-2，-5，-7，-9，-10，-17，-18，-20，19p+，+6marPt.199 BM 60，F(xiàn)68.0％ (-) 46，XXPt.231 BM 55，M77.6％ N.D. 46，XYPt.447 BM 44，F(xiàn)67.0％ (-) 46，XX，t(1119)Pt.534 BM 60，F(xiàn)50.0％ (-) 46，XXPt.543 BM 44，F(xiàn)35.3％ (-) 46，XX，t(1119)Pt.578 BM 55，F(xiàn)71.6％ (-) 46，XX，7p-，11q+Pt.706 PB 44，M30.0％ N.D. 46，XYPt.707 PB 56，M50.0％ N.D. 47，XY，+8Pt.713 BM 57，M43.6％ N.D. 44，X，-Y，-18，5qPt.715 BM 64，M70.6％ N.D. 46，XY細(xì)胞系Ht.60K562HELHelaGM637
表1(續(xù))IRF-1IRF-1△2IRF-1△23IRF-2d[正常BM](NBM)NBM1 1.00 0.160.831.00NBM2 0.97 0.070.460.76(RA)Pt.190 0.05 0.052.361.31Pt.356 0.08 0.121.310.91Pt.441 0.42 0.030.191.40Pt.581 0.00 0.000.153.24Pt.585 0.43 0.070.322.68Pt.535 0.89 0.160.731.26Pt.570 0.39 0.060.291.73(RAEB.t)Pt.228 0.08 0.020.200.73(CMMol.)Pt.255 0.09 0.645.392.49Pt.492 1.03 0.010.322.36Pt.519 0.86 0.190.750.75Pt.711 0.93 0.150.532.23Pt.716 0.37 0.010.462.59[MDS/LEU.]Pt.117 0.00 0.007.801.89Pt.194 0.37 0.150.520.49Pt.199 0.30 0.334.016.51Pt.231 0.77 0.141.191.20Pt.447 1.00 0.481.061.69Pt.534 0.63 0.130.383.76Pt.543 1.90.080.382.77Pt.578 0.15 0.000.151.83Pt.706 0.75 0.030.472.94Pt.707 0.39 0.020.421.09Pt.713 0.47 0.070.421.21Pt.715 0.67 0.040.213.21細(xì)胞系HL.600.34 0.030.080.44K562 1.01 0.030.291.91HEL 0.55 0.040.200.90Hela 0.51 0.170.490.081GM6370.29 0.120.220.81
注RA，頑固性貧血；RAEB，原始細(xì)胞過多性頑固性貧血；RAEB-t，轉(zhuǎn)化中的RAEB；CMMoL，慢性骨髓單核細(xì)胞性白血??；MDS/LEU，由骨髓增生異常綜合癥引起的明顯性白血??；BM，骨髓；PB，外周血；F，女性；M，男性；N.D.，未檢測(cè)；p53mut.，p53突變。
a.根據(jù)利用FAB分類法的形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)定。
b.(-)沒有檢測(cè)到突變。(+)檢測(cè)到突變。按Sugimoto etal.，(1993)描述通過RT-PCR/SSCP分析測(cè)定MDS/白血病患者的p53基因的突變。
c.根據(jù)人類細(xì)胞遺傳學(xué)術(shù)語(yǔ)的國(guó)際系統(tǒng)(ISCN，1991)對(duì)具有代表性的中期染色體擴(kuò)散進(jìn)行核型分析。
d.相對(duì)于β-肌動(dòng)蛋白信號(hào)將IRF-1和IRF-2值定到標(biāo)準(zhǔn)值。將具有代表性的正常骨髓NBM.1的IRF-1完整形式和IRF-2的值分別定為1.00。每個(gè)值都是三個(gè)重復(fù)檢測(cè)的平均值。
表2由完整的或交替拼接形式的IRF-1對(duì)菌落形成能力的抑制經(jīng)轉(zhuǎn)染的 菌落數(shù)目構(gòu)建體實(shí)驗(yàn)1 實(shí)驗(yàn)2實(shí)驗(yàn)3pAct-C 995 934 699pAct-H1 381 246 353pAct-H1△23 844 803 813注經(jīng)轉(zhuǎn)染的構(gòu)建體如下所示pAct-c，對(duì)照肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子載體；pAct-H1，完整IRF-1 cDNA表達(dá)的肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子；pAct-H1△23，缺失外顯子2和3的ITF-1 cDNA表達(dá)的肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。
實(shí)施例RNA分離，S1定位圖分析，以及RNA印跡分析采用硫氰酸胍方法分離總的細(xì)胞RNA。按照以前曾經(jīng)描述的方法進(jìn)行S1定位圖分析(Fujita et al.，1987)。為了制備探針DNA，將含有AIRF-1 cDNA FspI-KpnI片段有意義鏈的pBluescript IISK(+)噬菌體DNA作為模板，合成32p標(biāo)記的反意義DNA。然后采用BamHI消化該產(chǎn)物，分離含有核苷酸殘基217至464(Maruyama etal.，1989)的探針DNA。Harada et al.(1990)描述了RNA印跡分析的程序。為了制備探針DNA，采用隨機(jī)引物法(Amersham)標(biāo)記用于β-肌動(dòng)蛋白的1Ha-204的2.0 kb BamHI-PvuII片段(Miyamoto etal.，1988)。
合成的引物設(shè)計(jì)用于特異性地?cái)U(kuò)增cDNA的引物。人IRF-1基因的引物(Mar-uyama et al.，1989)是用于逆轉(zhuǎn)錄(RT)的反意義引物，核苷酸(nt)490到471；用于PCR的有意義引物，nt 92至111；用于PCR的反意義引物，nt 470到451。IRF-2基因的引物(Itoh et al.，1989)是用于RT的反意義引物，nt 391到372；用于PCR的有意義引物，nt 19至38；用于PCR的反意義引物，nt 367到348。β-肌動(dòng)蛋白的引物(Ponte et al.，1984)是用于RT的反意義引物，nt 470至451；用于PCR的有意義引物，nt 311至330；用于PCR的反意義引物，nt 448至429。小鼠IRF-1基因的引物(Miyamoto et al.，1988)是用于RT的反意義引物，nt 498至479；用于PCR的有意義引物，nt105至124，用于PCR的反意義引物，nt 478至459。
RT-PCR分析基本上按照以前描述的方法(Makino et al.，1990)進(jìn)行RT-PCR分析。由于在緊隨第一級(jí)指數(shù)動(dòng)力學(xué)的PCR反應(yīng)階段可以定量地檢測(cè)擴(kuò)增子(Wang et al.，1989；Makino et al.，1990；Foleyet al.，1993)，因而認(rèn)為高度特異性標(biāo)記和更少的擴(kuò)增循環(huán)提供了更高的靈敏度和更清晰的結(jié)果。在該檢測(cè)分析中，將來自相同RNA樣品的IRF-1，IRF-2和β-肌動(dòng)蛋cDNAs進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將β-肌動(dòng)蛋白擴(kuò)增子用作為mRNA定量分析的參考(Makino et al.，1990)。
采用Chomczynski和Sacchi(1987)中描述的單步驟方法分離總RNA。向含有1pmol RT引物，3.8ml 5×RT緩沖液(250mM Tris-HCl[pH8.3]，375mM KCl，15mM MgCl2)的12.5ml體積的反應(yīng)混合物中加入500毫微克的總RNA。將該混合物在95℃加熱2分鐘，置于冰上冷卻，并在37℃溫育30分鐘。在退火反應(yīng)之后，向該混合物中添加0.2ml 5×RT緩沖液，2ml的0.1M DTT，4.0ml 2.5 mM的各種dNTPs，20U的RNA酶抑制劑(Takara)，以及100U的莫洛尼氏鼠白血病病毒(MMLV)逆轉(zhuǎn)錄酶(GIBCO BRL)至體積為20ml，然后在37℃溫育60分鐘。然后將RT反應(yīng)產(chǎn)物在90℃溫育5分鐘，置冰上冷卻，并加入40ml蒸餾水。在體積為10ml含有10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，1.5mM MgCl2，0.01％(w/v)明膠，200ml dNTPs，各為1mM的5′和3′32p末端標(biāo)記的PCR引物，0.25U TaqDNA聚合酶(Perkin-Elmer Cetus)，以及3ml的RT反應(yīng)產(chǎn)物的反應(yīng)混合物中進(jìn)行PCR反應(yīng)。用Perkin-Elmer Cetus DNA熱循環(huán)儀按如下所示進(jìn)行擴(kuò)增在95℃反應(yīng)30秒，55℃反應(yīng)30秒，72℃反應(yīng)1分鐘。在擴(kuò)增的指數(shù)階段測(cè)定反應(yīng)的循環(huán)數(shù)；對(duì)于IRF-1和IRF-2為24個(gè)循環(huán)，對(duì)于β-肌動(dòng)蛋白為18個(gè)循環(huán)。將每種PCR反應(yīng)混合物各1ml在5％聚丙烯酰胺凝膠以及0.5×TBE緩沖液中進(jìn)行電泳。將凝膠干燥，采用Fujix Bas 2000成像分析儀定量檢測(cè)適當(dāng)譜帶的放射性。將IRF-1和IRF-2特異性擴(kuò)增子的量校正為相同樣品的β-肌動(dòng)蛋白擴(kuò)增子的量。針對(duì)在健康供體的NBM.1細(xì)胞中存在的IRF-1和IRF-2擴(kuò)增子的水平(任意地定為1.00)進(jìn)一步校正這些數(shù)據(jù)。對(duì)于IRF-1擴(kuò)增子，可以用Wang et al.(1989)描述的相同引物對(duì)多個(gè)不同mRNA種類進(jìn)行定量分析。
質(zhì)粒的構(gòu)建將每個(gè)含有完整的或交替拼接形式的IRF-1 cDNA的上述RT-PCR產(chǎn)物亞克隆到pCRTMII(Invitrogen)。為了構(gòu)建用于體外轉(zhuǎn)錄的質(zhì)粒(pBH1，pBH1△2和pBH1△23)，連接下面DNA片段；(i)來自pBlu-escript II SK(+)的EcoRI-BamHI主鏈片段(ii)來自含有IRF-1cDNA的pCRTMII衍生物的EcoRI-EcoRV片段(iii)來自pHIRF31的EcoRV-BamHI片段(Maruyama et al.，1989)。通過用pAct-C的HindIII-BamHI主鏈片段(Harada et al.，1990)取代pBluescript衍生物的HindIII-BamHI主鏈片段而構(gòu)建處于肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子控制下的IRF-1表達(dá)載體(pAct-H1，pAct-H1△2和pAct-H1△23)。
體外轉(zhuǎn)錄和翻譯在帽類似物和三磷酸核糖核苷酸存在下，使用含有完整的或突變的IRF-1 cDNAs的各種pBluescript II衍生物(pBH1，pBH1△2，或pBH1△23)的T7啟動(dòng)子以及T7 RNA聚合酶將加帽的合成mRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)按照制造者的方案(Stratagene)進(jìn)行。用苯酚-氯仿萃取該RNA并用乙醇沉淀。再將該RNA重新溶于水中，并將0.8mg的RNA加到利用兔網(wǎng)狀細(xì)胞溶解產(chǎn)物(Amersham)的體外翻譯反應(yīng)中，在30℃進(jìn)行60分鐘。
凝膠轉(zhuǎn)移試驗(yàn)基本上按照以前描述的方法(Harada et al.，1990)完成該試驗(yàn)。使用32p-標(biāo)記的C1寡聚體(含有兩個(gè)IRF結(jié)合基元；Tanaka etal.，1993)作為探針DNA。
DNA轉(zhuǎn)染和CAT檢測(cè)分析使用含有四個(gè)IRF結(jié)合基元的5mg p-55C1B報(bào)道基因(Fujitaet al.，1987；Tanaka et al.，1993)，以及5mg的IRF-1表達(dá)載體轉(zhuǎn)染P19胚胎癌細(xì)胞(2.5×105個(gè)細(xì)胞/6cm平皿)。按照所述(Harada et al.，1990)進(jìn)行CAT檢測(cè)分析。
在甲基纖維素凝膠上進(jìn)行的菌落形成檢測(cè)分析采用磷酸鈣方法(Harada et.al.，1990)用15mg的IRF-1表達(dá)載體和0.3mg的pMiwhph(Kato et al.，1988)共轉(zhuǎn)染活化形式的c-Ha-ras，rasEF11表達(dá)的IRF-1-/-胚成纖維細(xì)胞(Tanaka et al.，1994)(5×105個(gè)細(xì)胞/10cm/平皿)。轉(zhuǎn)染72小時(shí)后，用溶于含有200 mg/ml潮霉素的培養(yǎng)基中的1.3％甲基纖維素凝膠懸浮細(xì)胞，并平鋪于由0.53％瓊脂糖和培養(yǎng)基組成的瓊脂糖床層上。鋪平板3周后計(jì)算菌落數(shù)。


圖1(A)交替拼接方式的人IRF-1前mRNA。在上部的泳道中外顯子按如圖所述進(jìn)行編號(hào)，連接外顯子的線條表示拼接。該圖指出了位于外顯子2內(nèi)的起始因子ATG序列。在較低的泳道中，顯示完整的和交替拼接形式的IRF-1 mRNA。圖中標(biāo)出了被保護(hù)免受S1消化的探針的預(yù)期大小以及RT-PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物。
(B)通過S1定位圖譜分析檢則交替拼接形式的IRF-1前maNA。從健康志愿者(NPB.1)的外周血單核(PBM)細(xì)胞，HL-60細(xì)胞，以及HEL細(xì)胞中分離總RNA。較上部泳道；將15mg的RNAs進(jìn)行S1定位圖譜分析(參見實(shí)驗(yàn)程序)。1道，32p-標(biāo)記的HaeIII-消化的pBR322 DNA片段；2道，酵母tRNA，作為陰性對(duì)照；3道，來自健康供體(NPB.1)的PBM細(xì)胞；4道，HL-60；5道，HEL。箭頭指示如在(A)中描述的被保護(hù)的探針的位置。較低部的泳道；將2.5mg的RNAs進(jìn)行Northern印跡分析并且用β-肌動(dòng)蛋白探針與濾紙進(jìn)行雜交。
(C)對(duì)來自健康供體的PBM細(xì)胞，HL-60以及HEL中的IRF-1，IRF-2和β-肌動(dòng)蛋白mRNA進(jìn)行的RT-PCR分析。利用與IRF-1、IRF-2和β-肌動(dòng)蛋白的引物分別將500毫微克的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用標(biāo)記的引物將cDNA產(chǎn)物進(jìn)行PCR(參見實(shí)驗(yàn)程序)。1道，酵母tRNA作為陰性對(duì)照；2道，來自健康供體(NPB.1)的PBM細(xì)胞；3道，HL-60；4道，HEL；5道，32p標(biāo)記的HaeIII消化的pBR322 DNA片段。在上部泳道中，箭頭指示在(A)中描述的PCR產(chǎn)物的位置。在中間以及下部泳道中，分別表示IRF-2和β-肌動(dòng)蛋白特異性擴(kuò)增子。
(D)人以及鼠IRF-1 mRNA的RT-PCR分析比較。利用人或鼠IRF-1特異性引物將來自用人IRF-1基因組DNA轉(zhuǎn)染的NIH 3T3衍生的克隆的總RNA(R27-3；Harada et al.，1993)以及來自鼠BAF/B03的總RNA進(jìn)行RT-PCR分析(參見實(shí)驗(yàn)程序)。箭頭指示(A)中描述的PCR產(chǎn)物的位置。1道，32p-標(biāo)記的HaeIII消化的pBR322 DNA片段，2道，NIH 3T3衍生的克隆(R27-3)中人IRF-1擴(kuò)增子；3道，R27-3中鼠IRF-1擴(kuò)增子；4道，BAF/B03中鼠IRF-1擴(kuò)增子。
圖2來自具有代表性的MDS/白血病患者的mRNA的RT-PCR分析。
用來自健康供體的總RNA以及來自MDS/白血病患者的總RN進(jìn)行RT-PCR分析(參見實(shí)驗(yàn)程序)。在上部泳道中，箭頭指示如圖1A中描述的PCR產(chǎn)物的位置。1道，32p-標(biāo)記的HaeIII消化的pBR322 DNA片段；2道，來自健康供體的骨髓細(xì)胞(NBM.1)；3道，Pt.441；4道，Pt.228；5道，Pt.356；6道，Pt.231。在下部泳道中，顯示β-肌動(dòng)蛋白特異性擴(kuò)增子。
圖3(A)完整的以及交替拼接形式的IRF-1的體外翻譯產(chǎn)物。在12.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胺上分析每種翻譯反應(yīng)(10ml)的1ml溶液。
(B)IRF-1突變體的DNA結(jié)合活性。將(A)中顯示的體外翻譯蛋白質(zhì)進(jìn)行凝膠轉(zhuǎn)移分析。4道，沒有RNA的體外翻譯產(chǎn)物；5道，沒有提取物。箭頭指示IRF-1 DNA復(fù)合物的位置。
(C)由IRF-1突變體引起的轉(zhuǎn)錄激活。用5mg的CAT報(bào)道基因p-55ClB和5mg的效應(yīng)因子基因轉(zhuǎn)染P19細(xì)胞。經(jīng)轉(zhuǎn)染的效應(yīng)因子基因如下所示對(duì)照，5mg的pAct-C；IRF-1，2.5mg的pAct-H1和2.5mg的pAct-C；IRF-1△2，2.5mg的pAct-HI△2以及2.5mg的pAct-C；IRF-1△23，2.5mg的pAct-H1△23以及2.5mg的pAct-C。重復(fù)轉(zhuǎn)染并且將檢測(cè)分析重復(fù)三次，結(jié)果基本上可重復(fù)。
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權(quán)利要求
1.一種診斷癌癥，癌變前狀態(tài)，或?qū)ζ渌问郊膊〉囊赘行缘姆椒?，其特征在于在從血液或其它活檢材料獲得的樣品中分析IRF-1特異性RNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于測(cè)定該樣品是否含有與一種RNA分子相比，長(zhǎng)度縮短的IRF-1特異性RNA分子，其中所述的一種RNA分子為IRF-1基因的全長(zhǎng)氨基酸序列編碼。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征在于測(cè)定所說的IRF-1特異性RNA分子是否缺失IRF-1基因的外顯子2或外顯子2和3。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述方法，其特征在于測(cè)定全長(zhǎng)IRF-1-RNA，IRF-1△2-RNA和IRF-1△23-RNA的相對(duì)含量。
5.根據(jù)權(quán)利要求1～4任一項(xiàng)所述方法，其特征在于所述分析方法是通過逆轉(zhuǎn)錄/聚合酶鏈反應(yīng)并且隨后分析經(jīng)擴(kuò)增的cDNA來實(shí)現(xiàn)的。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述方法，其特征在于至少使用下列一種寡聚核苷酸作為引物。5′TTCCCTCTTCCACTCGGAGT3′(SEQ ID NO1)，5′GATATCTGGCAGGGAGTTCA3′(SEQ ID NO2)，或5′CTCTGGTCTTTCACCTCCTC3′(SEQ ID NO3)
7.根據(jù)權(quán)利要求1～6任一項(xiàng)所述方法，其特征在于所說癌癥，癌變前狀態(tài)，或其它形式疾病是造血系統(tǒng)疾病。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述方法，其特征在于所述造血系統(tǒng)疾病是脊髓發(fā)育不良或白血病。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述方法，其特征在于所述樣品取自于外周血單核細(xì)胞(PBM)或骨髓細(xì)胞。
10.至少一種IRF-1特異性寡核苷酸在診斷癌癥，癌變前狀態(tài)，或?qū)ζ渌问降募膊〉囊赘行缘姆椒ㄖ械氖褂?，其中在取自于血液或其它活檢材料的樣品中分析所說的IRF-1特異性RNA。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的使用方法，其特征在于所述分析方法是通過逆轉(zhuǎn)錄/聚合酶鏈反應(yīng)并且隨后分析經(jīng)擴(kuò)增的cDNA來實(shí)現(xiàn)的。
12根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的使用方法，其特征在于所述寡核苷酸具有下列序列5′TTCCCTCTTCCACTCGGAGT3′(SEQ ID NO1)，5′GATATCTGGCAGGGAGTTCA3′(SEQ ID NO2)，或5′CTCTGGTCTTTCACCTCCTC3′(SEQ ID NO3)
13.具有下列序列的寡核苷酸5′TTCCCTCTTCCACTCGGAGT3′(SEQ ID NO1)，5′GATATCTGGCAGGGAGTTCA3′(SEQ ID NO2)，或5′CTCTGGTCTTTCACCTCCTC3′(SEQ ID NO3)
14.診斷癌癥，癌變前狀態(tài)或?qū)ζ渌问郊膊〉囊赘行缘姆椒?，其特征在于在取自于血液或其它活檢材料的樣品中測(cè)定生物活性IRF-1多肽的含量。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過使用分子標(biāo)記，干擾素調(diào)節(jié)因子-1(IRF-1)診斷癌癥，癌變前狀態(tài)，以及對(duì)其它形式的疾病的易感性的方法。該方法特征在于優(yōu)選地采用逆轉(zhuǎn)錄/聚合酶鏈反應(yīng)方法分析取自于血液或其它活檢材料的樣品中的IRF-1特異性RNA。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1124779SQ9510229
公開日1996年6月19日 申請(qǐng)日期1995年2月23日 優(yōu)先權(quán)日1994年2月24日
發(fā)明者谷口維紹 申請(qǐng)人:貝林格爾·英格海姆國(guó)際有限公司