專利名稱：一種提高血清特異性生長(zhǎng)因子免疫學(xué)測(cè)定靈敏度的技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
免疫學(xué)診斷技術(shù) 技術(shù)背景
腫瘤可以通過自分泌和旁分泌的方式產(chǎn)生一系列生長(zhǎng)因子，包括表皮生長(zhǎng)因子 (EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、血小板衍 生生長(zhǎng)因子(PDGF)、腫瘤生長(zhǎng)因子a (TGF-a )和促血管生成素(angiopoietin， ANG)等許多因子。這些生長(zhǎng)因子，可以進(jìn)入血液循環(huán)，成為血清特異性生長(zhǎng)因子 (specific growth factors, SGF)，能不斷刺激腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和血管生成，加快 了腫瘤的發(fā)展。而不斷增大的腫瘤組織又進(jìn)一步分泌更多的生長(zhǎng)因子，進(jìn)一步刺激 腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，形成惡性循環(huán)。因此，體內(nèi)血清特異性生長(zhǎng)因子的表達(dá)水平與腫 瘤的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移和惡性程度密切相關(guān)。定量檢測(cè)血液或體液中血清特異性生長(zhǎng)因子可 用于惡性腫瘤的早期診斷，判斷腫瘤轉(zhuǎn)移與否及治療效果。
VEGF、 PDGF、 ANG等許多生長(zhǎng)因子通常以同源二聚體或三聚體形式存在。這種 結(jié)構(gòu)往往會(huì)干擾只能識(shí)別生長(zhǎng)因子某個(gè)表位的單克隆抗體與抗原分子的結(jié)合，影響 免疫檢測(cè)的靈敏度。此外，腫瘤患者體內(nèi)還存在一定濃度的，能與相應(yīng)生長(zhǎng)因子結(jié) 合的分泌性受體。這些分泌性受體也能與相應(yīng)的生長(zhǎng)因子結(jié)合，阻礙生長(zhǎng)因子與抗 體的結(jié)合，也在一定程度上影響到生長(zhǎng)因子免疫檢測(cè)的靈敏度。如果對(duì)待測(cè)樣品進(jìn) 行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理，破壞生長(zhǎng)因子的二聚體結(jié)構(gòu)及其與分泌性受體復(fù)合體結(jié)構(gòu)，使之 變成游離單體，利于與檢測(cè)抗體結(jié)合。然后再用相應(yīng)的抗體通過免疫學(xué)方法檢測(cè)生 長(zhǎng)因子，則能夠顯著提高生長(zhǎng)因子的免疫檢測(cè)靈敏度。
在蛋白質(zhì)親和層析純化技術(shù)中，常采用酸性緩沖液(多為甘氨酸緩沖液)破壞 抗體與抗原、抗體與A蛋白、G蛋白、配體與受體之間的結(jié)合，從固相層析介質(zhì)中 分離洗脫目的蛋白。酸性甘氨酸緩沖液化學(xué)性質(zhì)溫和，只破壞抗體與抗原、配體與 受體的結(jié)合，不會(huì)使目的蛋白變性，用堿性緩沖液中和PH后，不影響目的蛋白的免 疫學(xué)活性和生物學(xué)活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明專利描述了一種利用酸性解離方法對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行預(yù)處理，破壞生長(zhǎng)因 子的二聚體結(jié)構(gòu)及其與分泌性受體復(fù)合體結(jié)構(gòu)，使之變成游離單體，利于與檢測(cè)抗 體結(jié)合。然后再用特異性抗體通過酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、免疫熒光測(cè)定法或免 疫比濁法檢測(cè)血液和體液中的血清特異性生長(zhǎng)因子，提高血清特異性生長(zhǎng)因子免疫 檢測(cè)的靈敏度。下面以免疫比.濁法檢測(cè)血清促血管生成素UNG)為例，介紹樣品預(yù) 處理的具體方法和檢測(cè)步驟
(1) 常規(guī)方法抽取腫瘤患者外周血2ml，室溫靜置30分鐘使血液凝固，U00轉(zhuǎn)/ 分鐘(rpm)離心，吸取清亮血清，-18'C凍存?zhèn)溆茫?br> (2) 取15|u 1緩沖液(Rl ) (5%聚乙二醇6000, 20mM Tris-HC1緩沖液，PH6. 0 ) 和15nl處理液(R2 ) ( 600mM甘氨酸、0.2% Towen-20， PH2.5)加入到酶 標(biāo)板的微孔中，使緩沖液的PH值低于3.5, 37'C反應(yīng)20min，破壞待測(cè)血清特 異性生長(zhǎng)因子二聚體結(jié)構(gòu)及與分泌性受體復(fù)合物，使形成游離型單體；
(3)加入200 p 1抗休試劑(R3) ( 50mMTris-HC1緩沖液，200nM NaCl懸浮的10 Hg/ml聚苯乙烯微球交聯(lián)的生長(zhǎng)因子抗體，粒徑為200nm, PH8. 0,)混勾，中 和預(yù)處理樣品，使反應(yīng)液PH值達(dá)到7. 4左右。30秒鐘內(nèi)在340nm處測(cè)定反 應(yīng)液的吸光度值(OD值)Al,然后37'C再反應(yīng)20min, 30秒鐘內(nèi)在340nm處 測(cè)定反應(yīng)液的吸光度值(OD值)A2;
(4 )樣品吸光度值(OD值)△ A = A2-A1
(5) 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)SGF溶液(初始濃度64 U/ml)用緩沖液R1梯度稀釋， 獲得SGF終濃度分別為32 U/ml、 16 U/ml、 8U/ml、 0. 0 U/ml的液體，按上 述(l) - (4)方法測(cè)得AA，以SGF濃度為橫坐標(biāo)，以AA值為縱坐標(biāo)，繪 制標(biāo)準(zhǔn)曲線；
(6) 結(jié)果計(jì)算樣品中SGF含量根據(jù)其AA值與標(biāo)準(zhǔn)曲線中對(duì)應(yīng)的SGF濃度計(jì)算 得到。
采用酸性甘氨酸緩沖液解離方法處理血清樣品，可以破壞SGF的二聚體結(jié)構(gòu)， 解離SGF與分泌性受體的復(fù)合體，使SGF變成游離單體，利于與檢測(cè)抗體結(jié)合，而 不會(huì)不影響SGF的免疫學(xué)活性和生物學(xué)活性。用堿性緩沖液中和反應(yīng)液PH后，可以 提高抗體與待測(cè)SGF的結(jié)合效率，克服了 二聚體結(jié)構(gòu)和分泌性受體對(duì)SGF與抗體結(jié) 合的干擾，顯著提高血清SGF.免疫檢測(cè)的靈敏度。我們已經(jīng)進(jìn)行的大量實(shí)驗(yàn)檢測(cè)及 臨床試驗(yàn)結(jié)果也證明了此方法對(duì)于提高SGF檢測(cè)靈敏度的有效性。具體結(jié)果以ANG 檢測(cè)為例，見下表。
免疫比濁法檢測(cè)預(yù)處理與未處理樣品血清ANG實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較表
樣品例數(shù)OD340 (X土SD)預(yù)處理未處理
標(biāo)準(zhǔn)品(32U/ml)60. 35 ± 0. 070. 26 ± 0. 05
正常人血清1300. 28 ± 0. 160. 18 ± 0. 12
癌癥患者血清1750. 58 ± 0. 230. 36 ± 0. 18
從上面實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，經(jīng)過預(yù)處理的標(biāo)準(zhǔn)品和血清樣品，平均0D340值比 未處理組明顯增大。已有的調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，預(yù)處理法測(cè)定正常人血清ANG含量低于 32U/ml, 90%的肝癌、肺癌和大腸癌患者，60%以上的鼻咽癌患者，血清ANG含量 增高。而如果采用未處理法檢測(cè)血清ANG,有25 - 30。/。血清ANG陽性癌癥患者會(huì)漏 檢?？梢娝嵝愿拾彼峋彌_液預(yù)處理樣品后，能顯著提高腫瘤患者SGF免疫檢測(cè)的靈 敏度。
實(shí)現(xiàn)方式
上述技術(shù)可配制成樣品處理緩沖液，作為各種SGF免疫檢測(cè)試劑盒的組成成分
之一，用于惡性腫瘤的篩查、早期診斷、腫瘤轉(zhuǎn)移與否及惡性程度評(píng)判、預(yù)后評(píng)判 及治療效果評(píng)價(jià)等。也可作為許多科學(xué)研究中對(duì)SGF的檢測(cè)。比如，我們介紹的樣 品處理方法和緩沖液配方可作為SGF酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)(ELISA)試劑盒、免疫熒光 檢測(cè)(IFA)試劑盒、免疫比濁檢測(cè)試劑盒的組成成分，用于臨床及科研對(duì)SGF的檢測(cè)。
此外，上述酸性甘氨酸緩沖液樣品預(yù)處理技術(shù)方法同樣適用于其他存在聚合體 結(jié)構(gòu)和復(fù)合體的蛋白質(zhì)的免疫學(xué)檢測(cè)，應(yīng)用于臨床診斷及科研檢測(cè)。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明技術(shù)涉及一種采用酸性解離方法對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行預(yù)處理，提高血清特異性生長(zhǎng)因子(SGF)免疫學(xué)測(cè)定靈敏度的技術(shù)。其主要特征是采用酸性緩沖液破壞SGF的二聚體結(jié)構(gòu)及其與分泌性受體的復(fù)合體結(jié)構(gòu)，使其變成游離單體，利于與檢測(cè)抗體結(jié)合，提高檢測(cè)的靈敏度。本項(xiàng)技術(shù)可作為免疫學(xué)檢測(cè)試劑盒的組成成分，用于SGF的檢測(cè)，適用于惡性腫瘤的診斷、預(yù)后及療效評(píng)判。
2. 權(quán)利要求l所述的發(fā)明技術(shù)，其特征是酸性緩沖液的化學(xué)成分可以是甘氨 酸，或檸檬酸、乙酸等各種酸性化學(xué)物質(zhì)，都可以達(dá)到預(yù)期的破壞SGF的二 聚體及配體、受體復(fù)合體結(jié)構(gòu)，提高血清特異性生長(zhǎng)因子免疫學(xué)測(cè)定靈敏 度效果。
3. 權(quán)利要求l所述的發(fā)明技術(shù)，其特征是酸性緩沖液在低鹽的條件下破壞生長(zhǎng) 因子的二聚體結(jié)構(gòu)及其與分泌性受體的復(fù)合體結(jié)構(gòu)，使其變成游離單體， 利于與檢測(cè)抗體結(jié)合。
4. 權(quán)利要求l所述的發(fā)明技術(shù)，其特征是酸性緩沖液樣品預(yù)處理技術(shù)同樣適用 于科學(xué)研究對(duì)SGF的免疫學(xué)測(cè)定。
5. 權(quán)利要求l所述的發(fā)明技術(shù)，其特征是酸性緩沖液樣品預(yù)處理技術(shù)方法同樣 適用于其他存在聚合體或復(fù)合體結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)的免疫學(xué)測(cè)定，應(yīng)用于臨床 診斷及科研檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明技術(shù)介紹了一種采用酸性解離方法對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行預(yù)處理，提高血清特異性生長(zhǎng)因子(SGF)免疫學(xué)測(cè)定靈敏度的技術(shù)。其主要內(nèi)容是采用酸性甘氨酸緩沖液破壞生長(zhǎng)因子的二聚體結(jié)構(gòu)及其與分泌性受體的復(fù)合體結(jié)構(gòu)，使之變成游離單體，利于與檢測(cè)抗體結(jié)合，提高血清特異性生長(zhǎng)因子免疫學(xué)測(cè)定的靈敏度。此技術(shù)及試劑配方可作為生長(zhǎng)因子免疫學(xué)檢測(cè)試劑盒的組成成分，用于臨床和科學(xué)研究對(duì)SGF的檢測(cè)，適用于惡性腫瘤的診斷、預(yù)后及療效評(píng)判。
文檔編號(hào)G01N33/531GK101097217SQ20061009396
公開日2008年1月2日 申請(qǐng)日期2006年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月29日
發(fā)明者王珊珊 申請(qǐng)人:王珊珊