專利名稱：3-羥甲基頭孢菌素的酶促?；闹谱鞣椒?br> 技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包括酶促?；?-羥甲基頭孢菌素在內(nèi)的制備β-內(nèi)酰胺抗生素中間體的方法。
3-乙酸基甲基-7β-氨基頭孢-3-em-4-羧酸(7-ACA)是制備半合成商品頭孢菌素抗生素的重要起始材料。商業(yè)上，該中間體是通過化學(xué)或酶促水解頭孢菌素C〔一種頂頭孢霉(Cephalosporium acremonium)的發(fā)酵產(chǎn)品〕的D-2-氨基己二酰側(cè)鏈而產(chǎn)生的(參見Newton and Abraham，Nature 175，548，1955)。3-羥甲基-7β-氨基頭孢-3-em-4-羧酸(des-7-ACA)通常是作為在通過化學(xué)或酶促(酯酶)水解3-乙?；鶊F(tuán)以制備7-ACA中形成的付產(chǎn)物而產(chǎn)生的?？赏ㄟ^用各種酯酶作用于7-ACA而產(chǎn)生des-7-ACA。另外，可以按照將頭孢菌素轉(zhuǎn)化成7-ACA的同樣方法，經(jīng)酶水解從脫乙酰頭孢菌素C生產(chǎn)之(世界專利No.WO90/12110)。由于C-7氨基基團(tuán)的高反應(yīng)性性質(zhì)，可在從脫乙?；绑w化學(xué)合成7-ACA時產(chǎn)生產(chǎn)物的混合物。使用典型化學(xué)酰化劑如乙酰氯或乙酸酐而產(chǎn)生7-ACA、N-乙酰7-ACA和N-乙酰脫乙酰7-ACA。此外，在這些條件下3-羥甲基-7β-氨基頭孢-3-em-4-羧酸是對內(nèi)酯化敏感的?，F(xiàn)有技術(shù)中，鄰位乙?；姆椒òǚ忾]反應(yīng)性C-7氨基基團(tuán)，然后在具有酸受體堿的4-(叔氨基)吡啶催化劑存在下，在非極性有機(jī)溶劑中進(jìn)行鄰位乙酰化并使C-7氨基基團(tuán)去封閉(歐洲專利NO.153，874A)。其他方法包括使C-7?；衔锏?-位羧基酯化，以防止反應(yīng)期間發(fā)生內(nèi)酯化作用，然后使此羧基去酯化并除去對C-7氨基的保護(hù)，以產(chǎn)生3-烷酰氧基甲基-3β-氨基頭孢-3-em-4-羧酸(美國專利3，432，694);或者在具有酸受體堿的4-(叔氨基)吡啶催化劑存在下，在含水介質(zhì)中進(jìn)行鄰位乙?；?，然后再使C-7氨基基團(tuán)去封閉(歐洲專利No.0230972)。另外，還已描述了在含水溶劑中?；?-羥甲基頭孢菌素的化學(xué)方法(美國專利5，221，739)。
已知某些酯酶和脂肪酶不僅可催化水解反應(yīng)，而且對某些底物來說，還可用于合成中的定向酯化和酯基轉(zhuǎn)移。Jeffrey等人(Biochem.J.81，591-596，1961)首先使用柑桔乙酰酯酶證明可使用酯酶產(chǎn)生脫乙酰頭孢菌素衍生物(美國專利3，202，656;歐洲專利No.0109300)。繼后，又從芽霉菌(歐洲專利0 044 736)、裂殖菌(美國專利3，239，394)、根瘤菌(美國專利3，436，310)、枯草芽孢桿菌(美國專利3，304，310，歐洲專利0 173 206)、紅冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)(英國專利No.2，060，610)、深紅酵母菌(英國專利No.1，474，519)和麥胚中發(fā)現(xiàn)了許多其他具有使頭孢菌素化合物脫乙?；芰Φ孽ッ负椭久?。最后，Wang，Y-F等人報導(dǎo)(J.Org.Chem.53，3128-3129，1988)了使用乙酸異丙烯酯作為不可逆?；D(zhuǎn)移劑，用于糖的脂肪酶催化的乙?；磻?yīng)。
我們已不可預(yù)見地發(fā)現(xiàn)，可使用下文所述的某些酶，連同下文所述的在定向合成中發(fā)揮功能的某些?；w，以生產(chǎn)C-3′位?；念^孢菌素。
本發(fā)明的方法用于生產(chǎn)鄰位?；念^孢菌素具有不需要封閉7位氨基基團(tuán)和排除內(nèi)酯化的優(yōu)點。酶促反應(yīng)所固有的特異性得以在C-3′位進(jìn)引選擇性?；?，而沒有產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)所特有的付產(chǎn)物。具體地說，本發(fā)明是涉及制備有下列結(jié)構(gòu)式的頭孢菌素化合物的?；椒?其中R1是氫或式 的?；鶊F(tuán)其中R是羧酸的殘基，X是氫或鹵素，且G是氧、硫、亞砜或亞甲基;其包括在得自紅冬孢酵母、麥胚、柑桔皮、枯草芽胞桿菌或黑曲霉的脂肪酶或酯酶存在下，在含水介質(zhì)中使式
的化合物與?；w反應(yīng)。


圖1des-7-ACA至7-ACA的百分轉(zhuǎn)化率對時間作圖(實施例1)。
圖2des-7-ACA至7-ACA的百分轉(zhuǎn)化率對時間作圖(實施例2)。
圖3說明實施例13中所述分離結(jié)果的254nm吸光率對管號作圖。
本發(fā)明中所用酰基供體至少包含三個碳原子并且是在合成路線中驅(qū)動C-3′位上反應(yīng)的供體。這些酰基供體是乙酰供體或一鹵代乙酰供體。?；w可以是“可逆的”或“不可逆的”供體?？赡婀w包括乙酸乙酯和三醋精。這些酯和醇(式Ⅱ的化合物)與產(chǎn)物(式Ⅰ的化合物)和衍生于酯的醇達(dá)到平衡。例如，使用乙酸乙酯完成下列反應(yīng)
該反應(yīng)按可逆方向進(jìn)行，以從酯Ⅰ和醇生成乙酸乙酯和醇Ⅱ的混合物。用不可逆供體如乙酸異丙烯酯 產(chǎn)生的醇不穩(wěn)定，并互變異構(gòu)成為丙酮。該丙酮不能象“可逆”型供體一樣參于逆反應(yīng)。因此，在生成乙?；a(chǎn)物(1)
的方向中有一種驅(qū)動力，并使產(chǎn)率達(dá)到相應(yīng)更好的水平。
用于本發(fā)明的?；w的例子有下式化合物 其中R″是C1-C10烷基、C2-C10烯基、C3-C10環(huán)烷基、C3-C10環(huán)烯基、C2-C10炔基、C6-C30芳基、C1-C10取代的烷基、C2-C10取代的烯基、C3-C10取代的環(huán)烷基、C3-C10取代的環(huán)烯基、C6-C30取代的芳基、式 的基團(tuán)，其中n是2或更大的正整數(shù)，(較好是2至3，000，更好是2至100)，且R'''是H或乙?；?，或式 的基團(tuán)，其中n和R'''定義同上;X是氫或鹵素。
優(yōu)選的芳基供體是其中R'''是C2-C6烯基、被1-3個乙酸基基團(tuán)取代的C1-C6芳基、C6-C10芳基或式
的基團(tuán)，其中n是2至100的整數(shù)。
芳基供體的特定實例包括乙酸異丙烯酯、三醋精、乙酸乙烯酯、乙酸乙酯、二醋精、乙二醇二乙酸酯、順-1，4-二乙酸基丁烷、1，4-二乙酸基丁烷、乙酸苯酯、1，2，4-三乙酸苯、1，3-丁二醇二乙酸酯、1，2-丙二醇二乙酸酯、乙酸正丁酯、三甘醇二乙酸酯、乙酸異丙酯和乙酸異丁酯等。
更優(yōu)選的?；w是乙酸異丙烯酯、三醋精、乙酸乙烯酯、二醋精、乙二醇二乙酸酯、順-1，4-二乙酸基丁烷、1，4-二乙酸基丁烷、乙酸苯酯、1，3-丁二醇二乙酸酯、1，2-丙二醇二乙酸酯或三甘醇二乙酸酯。
R1是“羧酸的殘基”，其包括頭孢菌素工藝中已知的那些C7位側(cè)鏈和青霉素工藝中已知那些C6位側(cè)鏈。即，這些側(cè)鏈?zhǔn)瞧渲蠷為C1-C20羧酸的殘基的側(cè)鏈，且具體例子是此時R是氫、C1-C6烷基、被氰基、羧基、鹵素、氨基、C1-C4烷氧基、C1-C4烷硫基、三氟甲基或三氟甲硫基取代的C1-C6烷基;萘基、苯基、被取代的式
的苯基基團(tuán)-其中α和α′各自為氫、鹵素、氰基、硝基、羥基、C1-C4烷氧基、C1-C4烷酰氧基、C1-C4烷基、C1-C4烷硫基、氨基、C1-C4烷酰氨基、C1-C4烷基磺酰氨基、羧基、氨甲?；?、羥甲基、氨甲基或羧甲基;或 的基團(tuán)-其中α和α′具有如上限定的同樣意義，Z是O或S，且m是0或1;式R3-CH2-的芳基甲基基團(tuán)-其中R3是萘基、呋喃基、苯并噻吩基、苯并氨基噻唑基、苯并呋喃基、吡啶基、4-吡啶硫基、嘧啶基、噠嗪基、吲哚基、吡唑基、咪唑基、三唑基、四唑基、噁唑基、噻唑基、噁二唑基、噻二唑基、以及被氨基、羥基、氰基、硝基、鹵素、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、苯基或取代的苯基或C1-C4烷基磺酰氨基取代的所說的芳基甲基基團(tuán);被取代的式 的甲基基團(tuán)-其中R4是環(huán)己-1，4-二烯基、苯基或式
的取代的苯基-其中α和α′定義同上，或R4是如上文限定的R3，且Q是羥基、C1-C4烷酰氧基、羧基、磺基、氨基、磺氨基、或被取代的式 的氨基基團(tuán)-其中X是氫或C1-C4烷基，Ry是C1-C4烷基、呋喃基、噻吩基、苯基、鹵代苯基、硝基苯基、苯乙烯基、鹵代苯乙烯基、硝基苯乙烯基或式 的基團(tuán)-其中Rx有如上文限定的同樣意義且R2是氫、C1-C4烷基磺酰、C1-C4烷基、或C1-C4烷?；?或者Q是被取代的式
的氨基基團(tuán)-其中R2具有如上文限定的同樣含義，且q是2或3;或者Q是被取代的式 的氨基基團(tuán);或者Q是式 的苯甲酰氨基基團(tuán)-其中X是1至3;或者Q是吡啶酮或結(jié)構(gòu)式 的吡啶酮基-碳酰氨基基團(tuán)-其中Rx定義同上;或者Q是有結(jié)構(gòu)式
的碳酰氨基基團(tuán)，所說的基團(tuán)可以是被C1-C4烷基、氨基、羧基、羥基或鹵素取代的;或者Q是有結(jié)構(gòu)式 的咪唑基或吡唑基，且所說的咪唑基或吡唑基可以是被C1-C4烷基、羧基、氨基或鹵素取代的;或者Q是由結(jié)構(gòu)式 代表的苯并噠嗪酮基團(tuán)或其互變體-其中Rx定義同上，且t是1至3;或者Q是有結(jié)構(gòu)式
的苯并吡喃酮基團(tuán)，或R是有結(jié)構(gòu)式 的基團(tuán)-其中R5是如上文限定的R3或R4，R9是氫或鹵素，且R6是氫、C1-C4烷基、被鹵素取代的C1-C4烷基、羧基取代的烷基或由式 代表的環(huán)烷基基團(tuán)-其中b和b′各自是氫或C1-C3烷基;n是0、1、或3;或者b或b′與它們所連接的碳一起形成3至6元碳環(huán);且R7是羥基、C1-C4氨基、C1-C4烷氨基，或二(C1-C4烷基)氨基;或者R6是被苯基取代的C1-C4烷基或被一個或兩個選自C1-C4烷基、氫、鹵素、羧基或被保護(hù)的羧基的相同或不同的基團(tuán)取代的苯基;或者R6是C1-C4烯基;或者R6是式
的環(huán)酰胺基團(tuán)-其中Ⅴ是2-4;R8是氫或C1-C3烷基;且R6是式R3-CH2-的芳基甲基基團(tuán)-其中R3定義同上文所述;或者R是式-(CH2)tCOOH的基團(tuán)-其中t的定義同前所述;或者R是式 的基團(tuán)-其中t定義同上;或者R是式 的基團(tuán)-其中t定義同上，R12是氫且R11是苯基，取代的苯基，或式〈 的基團(tuán)-其中R13可以是苯基、取代的苯基、C1-C6烷基、C1-C6取代的烷基、氨基苯基、苯基磺酰、(取代的苯基)磺酰、C1-C4烷氧基、或氧代(C1-C6烷基)。
在上述由各結(jié)構(gòu)式(即式Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ)代表的化合物的定義中，“烷基”是指直鏈或支鏈烷基基團(tuán)，如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、正己基、3-甲基戊基等烷基基團(tuán);“被取代的烷基”包括由氰基、羧基、鹵素、氨基、C1-C4烷氧基、C1-C4烷硫基、三氟甲基及三氟甲硫基取代的烷基;“被氰基取代的烷基”是指氰基甲基、氰基乙基、4-氰基丁基等;“被羧基取代的烷基”是指例如羧甲基、2-羧基乙基、2-羧基丙基、4-羧基丁基、5-羧基戊基等基團(tuán);“被鹵素取代的烷基”是指氯代甲基、溴代甲基、2-氯代乙基、1-溴代乙基、4-氯代丁基、4-溴代戊基、6-氯代己基、4-氟代丁基、3-氟代丙基、氟代甲基等基團(tuán);“被氨基取代的烷基”是指例如2-氨基乙基、氨基甲基、3-氨基丙基及4-氨基丁基等基團(tuán);“被C1-C4烷氧基取代的烷基”是指甲氧基甲基、2-甲氧基乙基、2-乙氧基乙基、乙氧基甲基、3-丙氧基丙基、3-乙氧基丁基、4-叔丁氧基丁基、3-甲氧基戊基、6-甲氧基己基等基團(tuán);“被C1-C4烷硫基取代的烷基”是指例如甲硫基甲基、2-甲硫基乙基、2-乙硫基丙基、4-甲硫基丁基、5-乙硫基己基、3-叔丁硫基丙基等基團(tuán);“被三氟甲基取代的烷基”的例子有2，2，2-三氟乙基、3，3，3-三氟丙基、4，4，4-三氟丁基、6，6，6-三氟己基等;“被三氟甲硫基取代的烷基”是指例如三氟甲硫基甲基、2-三氟甲硫基乙基、2-三氟甲硫基丙基、4-三氟甲硫基丁基、5-三氟甲硫基己基，以及C1-C6烷基取代的基團(tuán)。
術(shù)語“烯基”是指至少具有1個碳-碳雙鍵的基團(tuán)。這樣基團(tuán)的少數(shù)例子是乙烯基、1-丙烯-2-基、1-丁烯-4-基、1-戊烯-1-基、1-丁烯-1-基等基團(tuán)。
術(shù)語“被取代的烯基”是指至少具有1個碳-碳雙鍵，并且被選自鹵素、羧基、氨基、C1-C4烷氧基、C1-C4烷硫基、三氟甲基、三氟甲硫基、氰基等的1個多個基團(tuán)取代的基團(tuán)。
術(shù)語“炔基”是指至少具有1個碳-碳三鍵的基團(tuán)。其少數(shù)例子是乙炔基、丙炔基等基團(tuán)。
術(shù)語“環(huán)烷基”是指至少有3個碳原子的環(huán)狀烷基基團(tuán)。其少數(shù)例子是環(huán)丙基、環(huán)己基等基團(tuán)。
術(shù)語“被取代的環(huán)烷基”是指被鹵素、羧基、氨基、C1-C4烷氧基、C1-C4烷硫基、三氟甲基、三氟甲硫基、氰基等中的1個或多個基團(tuán)取代的環(huán)狀烷基基團(tuán)。
術(shù)語“芳基”代表芳族性質(zhì)的環(huán)狀基團(tuán)。這些基團(tuán)的例子包括苯基、萘基和蒽基。
術(shù)語“被取代的芳基”是指被鹵素、羧基、氨基、C1-C4烷氧基、C1-C4烷硫基、三氟甲基、三氟甲硫基、氰基等中的1個或多個取代的芳基基團(tuán)。
術(shù)語“C1-C4烷硫基”是指那些具有1至4個碳原子并且被至少1個硫原子取代的基團(tuán)。
術(shù)語“鹵素”是指氟、氯、溴或碘基團(tuán)。
式Ⅰ中，由α和α′代表取代基的被取代的苯基基團(tuán)包括鹵代苯基如4-氯代苯基、3-溴代苯基、2-氟代苯基、2-碘代苯基、2，4-二氯代苯基，和3，5-二氯代苯基;羥苯基如2-羥基苯基、3-羥基苯基、4-羥基苯基、2，4-二羥基苯基和3，4-二羥基苯基;烷氧基苯基如2，6-二甲氧基苯基、4-甲氧基苯基、3-乙氧基苯基、3，4-二甲氧基苯基、4-叔丁氧基苯基、4-甲氧基-3-乙氧基苯基和4-正丙氧基苯基;烷酰氧基苯基如2-乙酰氧基苯基、4-丙酰氧基苯基、4-甲酰氧基苯基、4-乙酰氧基苯基、3-丁酰氧基苯基和3-乙酰氧基苯基;烷基苯基如4-甲基苯基、2-甲基苯基、2，4-二甲基苯基、3-叔丁基苯基、4-乙基苯基、4-乙基-3-甲基苯基、和3，5-二甲基苯基;烷硫基苯基如4-甲硫基苯基、3-正丁硫基苯基、2-乙硫基苯基、3，4-二甲硫基苯基和3-正丙硫基苯基;氨基苯基如2-氨基苯基、4-氨基苯基、3，5-二氨基苯基和3-氨基苯基;烷酰氨基苯基如2-乙酰氨基苯基、4-乙酰氨基苯基、3-丙酰氨基苯基和4-丁酰氨基苯基;烷基磺酰氨基苯基如3-甲基磺酰氨基-苯基、4-甲基磺酰氨基苯基、3，5-二(甲基磺酰氨基)苯基、4-正丁基磺酰氨基苯基和3-乙基磺酰氨基苯基;羧基苯基如2-，3-或4-羧基苯基、3，4-二羧基苯基和2，4-二羧基苯基;氨甲酰基苯基如2-氨甲?；交?、2，4-二氨甲酰基苯基和4-氨甲?；交?羧甲基苯基如4-羥甲基苯基和2-羥甲基苯基;氨甲基苯基如2-氨甲基苯基和3-氨甲基苯基;羧甲基苯基如2-羧甲基苯基、4-羧甲基苯基和3，4-二(羧甲基)苯基;以及帶有不同取代基的被取代的苯基基團(tuán)如4-氯-3-甲基苯基、4-氟-3-羥苯基、3，5-二氯-4-羥苯基、4-羥基-3-氯代苯基、4-羥基-3-甲基苯基、4-乙基-3-羥苯基、4-甲氧基-3-羥苯基、4-叔丁氧基-2-羥苯基、4-乙酰氨基-3-甲氧苯基、3-氨基-4-乙基苯基、2-氨甲基-4-氯代苯基、3-羥甲基-3-甲氧基苯基、2-羥甲基-4-氟代苯基、2-乙酰氧基-4-氨基苯基、4-乙酰氧基-3-甲氧基苯基、3-異丙硫基-4-氯代苯基、2-甲硫基-4-羥甲基苯基、4-羧基-3-羥苯基、4-乙氧基-3-羥苯基、4-甲基磺酰氨基-2-羧基苯基、4-氨基-3-氯代苯基和2-羧甲基-4-羥苯基。
其中R是由式 代表的基團(tuán)且其中m＝0的式Ⅰ的RCO-基團(tuán)的例子是苯乙酰、4-氯代苯乙酰、3，4-二氯代苯乙酰、4-甲氧基苯乙酰、3-乙氧基苯乙酰、2-氨甲基苯乙酰、3-羧基苯乙酰、4-乙酰氧基苯乙酰、3-氨基苯乙酰和4-乙酰氨基苯乙酰;m＝1且Z＝0時，包括苯氧基乙酰、4-氯代苯氧基乙酰、4-氟代苯氧基乙酰、3-氨基苯氧基乙酰、3-羥基苯氧基乙酰、2-甲氧基苯氧基乙酰、2-甲硫基苯氧基乙酰、4-乙酰氨基苯氧基乙酰、3，4-二甲基苯氧基乙酰和3-羥甲基苯氧基乙酰;以及m＝1且Z＝s時，包括苯硫基乙酰、4-氯代苯硫基乙酰、3，4-二氯代苯硫基乙酰、2-氟代苯硫基乙酰、3-羥苯硫基乙酰和4-乙氧苯硫基乙酰。
其中R3是雜芳基的式Ⅰ的R3-CO2CO-基團(tuán)的例子是2-噻吩基乙酰、3-噻吩基乙酰、2-呋喃基乙酰、2-苯并噻吩基乙酰、2-苯并呋喃基乙酰、吲哚-2-基乙酰、1H-四唑-1-基乙酰、噁唑-2-基乙酰、噁唑-4-基乙酰、噻唑-4-基乙酰、2-氨基噻唑-4-基乙酰、1，3，4-噁二唑-2-基乙酰、1，3，4-噻二唑-2-基乙酰、5-乙基-1，3，4-噻二唑-2-基乙酰，以及被氨基、C1-C4烷基磺酰氨基、羥基、鹵素、C1-C4烷基或C1-C4烷氧基基團(tuán)取代的雜芳基基團(tuán)。
其中R是由式R4-CH(Q)-代表的被取代的甲基基團(tuán)且Q是氨基、羧基、羥基或硫的式Ⅰ化合物之RCO-基團(tuán)的例子是2-羧基-2-苯乙酰、2-氨基-2-(2-萘基)乙酰、2-羧基-2-(4-羥苯基)乙酰、2-氨基-2-苯乙酰、2-氨基-2-(4-羥苯基)乙酰、2-氨基-2-(3-氯代-4-羥苯基)乙酰、2-氨基-2-(環(huán)己-1，4-二烯基)乙酰、2-氨基-2-(3-甲基亞磺酰氨基苯基)乙酰、2-氨基-2-(3-甲基亞磺酰氨基苯基)乙酰、2-氨基-2-(3-乙基亞磺酰氨基苯基)乙酰和2-乙氧基-2-(3-羥苯基)乙酰、2-氨基-2-(2-噻吩基)乙酰、2-氨基-2-(3-苯并噻吩基)乙酰、2-氨基-2-(1H-四唑-1-基)乙酰、2-羥基-2-(1，3，4-噻二唑-2-基)乙酰、2-氨基-2-(2-氨基噻唑-4-基)乙酰、2-羧基-2-(2-噻吩基)乙酰、2-羧基-2-(苯并噻吩-2-基)乙酰和2-羥基-2-(苯并呋喃-2-基)乙酰;當(dāng)Q是由結(jié)構(gòu)式 代表的被取代的氨基基團(tuán)時，這樣的芳基基團(tuán)的例子是2-(N-甲基-N-苯甲?；奔柞；被?-2-(2-呋喃基)乙酰、2-(N，N-二甲基氨甲酰脲基)-2-(4-氯代苯基)乙酰、2-〔N-甲基-N-(2-氯代肉桂酰)氨基甲酰氨基〕-2-(2-噻吩基)乙酰和2-(N-乙基-N-乙酰氨基甲酰氨基)-2-(4-羥苯基)乙酰;當(dāng)Q是由結(jié)構(gòu)式 代表的被取代的氨基基團(tuán)時，例子包括2-〔(3-甲基咪唑啉-2-酮-1-基)碳酰氨基〕-2-苯乙酰、2-〔(3-乙酰咪唑啉-2-酮-1-基)碳酰氨基-2-苯乙酰、2-〔(3-甲基磺酰咪唑啉-2-酮-1-基)-2-(2-噻吩基)乙酰和2-〔(3-乙酰六氫嘧啶-2-酮-1-基)碳酰氨基〕-2-苯乙酰;當(dāng)Q是由結(jié)構(gòu)式
代表的羥基取代的苯甲酰氨基基團(tuán)時，這樣的芳基基團(tuán)的例子是2-(2，4-二羥苯甲酰氨基)-2-苯乙酰、2-(4-羥苯甲酰氨基)-2-(4-羥苯基)乙酰、2-(3，4-二羥苯甲酰氨基)-2-(2-氨基噻唑-4-基)乙酰、2-(3，5-二羥苯甲酰氨基)-2-(3-噻吩基)乙酰和2-(2-羥苯甲酰氨基)-2-(2-苯并呋喃基)乙酰。
當(dāng)Q是羥基取代的吡啶碳酰氨基基團(tuán)時，例子包括例如2-羥吡啶-4-酮-6-基碳酰氨基和3-羥吡啶-4-酮-6-基碳酰氨基。當(dāng)Q是吡啶基碳酰氨基基團(tuán)時，例子是例如吡啶-3-基碳酰氨基、4-氨基吡啶-3-基磺碳酰氨基、5-氯代吡啶-2-基碳酰氨基、3-羧基吡啶-4-基碳酰氨基和4-氨基吡啶并-2-基碳酰氨基。當(dāng)Q是如上限定的咪唑或吡唑基團(tuán)時，例子包括例如2-氨基咪唑-4-基碳酰氨基、5-羧基吡唑-3-基碳酰氨基、3-氨基吡唑-4-基碳酰氨基和4-羥吡唑-5-基碳酰氨基。當(dāng)Q是苯并噠嗪-4-酮-3-基碳酰氨基基團(tuán)時，Q的例子是由結(jié)構(gòu)式
代表的。
當(dāng)R是酮基團(tuán)或由式 代表的肟基取代的基團(tuán)時，由式Ⅰ代表的化合物中RCO芳基基團(tuán)的例子是酮基團(tuán)2-氧代-2-苯基乙酰、2-氧代-2-(2-噻吩基)乙酰、2-氧代-2-(2-氨基-噻吩-4-基)乙酰;以及肟基取代的基團(tuán)2-苯基-2-甲氧基氨基乙酰、2-(2-噻吩基)-2-乙氧基亞氨基乙酰、2-(2-呋喃基)-2-甲氧基亞氨基乙酰、2-(2-苯并噻吩基)-2-羧基甲氧基亞氨基乙酰、2-(2-噻吩基)-2-(2-羧基乙氧基)亞氨基乙酰、2-(2-氨基-1，2，4-噻二唑-4-基)-2-甲氧基亞氨基乙酰、2-(2-氨基噻唑-4-基)-2-甲氧亞氨基乙酰、2-(2-氨基噻唑-4-基)-2-(2-羧基丙-2-基)氧代亞氨基乙酰、2-(5-氨基-1，3，4-噻二唑-2-基)-2-甲氧亞亞氨基乙酰。
當(dāng)結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)中的R6是由苯基或取代的苯基取代的C1-C4烷基時，這樣的基團(tuán)可以是芐基、4-羥芐基、4-氯代芐基、3-羧基芐基、3-氯代-4-羥芐基、2-苯乙基、1-苯乙基、3-苯丙基、4-羥基-2-苯丙基、3-苯丁基和類似的苯基-烷基基團(tuán)。
當(dāng)R6代表被氨基或保護(hù)氨基取代的C1-C4烷基時，例子包括2-氨乙基、3-氨丙基、4-氨丁基、2-氨丙基以及其中氨基被氨基保護(hù)基團(tuán)保護(hù)的這些基團(tuán)。
當(dāng)R6是C2-C4烯基基團(tuán)時，例子包括乙烯基、丁烯-2、丁烯-3、丁烯-1及類似基團(tuán)由其中R是式 的基團(tuán)的式(Ⅱ)代表的化合物，可見于Hamashima的美國專利4，634，671中。可舉例的取代基是，R9為氫;R5為苯基、呋喃基、噻吩基、噁唑基、異噁唑基、可以被保護(hù)或未被保護(hù)的氨基噻唑基、噻二唑基及氨基噻唑基，且R6可以是C1-C3烯基和-CH2COO2H。
當(dāng)R是式-(CH2)1CH(R12NR11)COOH的基團(tuán)時，且其中R12是氫時，R11的例子包括

或者R11與R12一起形成基團(tuán) 這樣的R11和R12的其他例子可見于美國專利號3，853，863、3，522，248;3，573，296、3，641，081、3，980，644和3，821，208中;日本專利號108，085(1976)、112，892(1978)、53，689(1978)、029，493(1976)、13，389(1973)、149，694(1975)、82，791(1977)中;德國專利號2，157，693、2，721，731、2，507，117、2，208，631、2，458，554、2，418，088、2，523，280和2，841，363中;比利時專利號790，540(1973)中和美國專利號1，565，053與2，040，942中，以及下列文章中Anctrisano，T.，et al.，J.Appl.Chem.Biotechnol，(1976)，26，459-468。
式Ⅰ和式Ⅱ化合物中最優(yōu)選的R1是氫、乙酰、戊二酰、α-氨基鄰聯(lián)吡啶基和苯乙酰;G最好是硫且X最好是氫。
用以完成本發(fā)明?；^程的酶是得自紅冬孢酵母、麥胚、桔皮、枯草芽孢桿菌或黑曲霉的脂肪酶或酯酶。
可以任何形成使用酶。例如，它們可以是粗制品、部分純化的或純化至結(jié)晶的。如果酶濁由微生物得到的，可用全細(xì)胞在原位生成酶完成酶促反應(yīng)，或者在適當(dāng)?shù)靥幚砑?xì)胞后得到可溶性酶再以其完成酰化作用。
一般說來，酶的形式應(yīng)是易于分散于與酰基供體和式Ⅱ的起始化合物接觸的反應(yīng)介質(zhì)中的。因此，可以使來自微生物的酶、細(xì)胞全培養(yǎng)物的樣品，較好在經(jīng)處理后使細(xì)胞不再存活，并且在必要時，可在例如用超處理、溶解酶處理或去污劑處理等常規(guī)方法破壞細(xì)胞后使用之。也可使用在得以保留酶活性情況下儲存的細(xì)胞制品，例如丙酮干燥的粉末或丙酮處理的細(xì)胞。優(yōu)選的處理方法是使用絡(luò)合劑例如乙二胺四乙酸(EDTA)。
也可以使無細(xì)胞形式的微生物酶。因此，可使用得自培養(yǎng)物的濾液或懸浮液。必要時，可在過濾或離心前用上述方法破碎細(xì)胞。另外，可用常規(guī)方法進(jìn)一步純化無細(xì)胞酶。可使用的技術(shù)包括例如用鹽或用有機(jī)溶劑如丙酮沉淀酶、在例如在離子交換柱上或?qū)γ赣刑禺愑H和性的載體上層析，并經(jīng)凝膠過濾或透析脫鹽。無細(xì)胞酶可以作為溶液、沉淀物或適當(dāng)固相化的制劑使用。
當(dāng)酶是來自麥胚或桔皮時，可以使用植物材料的含酶提取物?？捎贸Ｒ?guī)方法制備這樣的提取物，一般可包括首先用物理技術(shù)例如用如英國專利說明書No.966，222中所述的研磨或榨壓方法或用化學(xué)技術(shù)例如按英國專利說明書No.1，121，308中所述用石油醚等烴溶劑處理植物材料，以從植物材料中釋放出酶。可以將除去或未除去細(xì)胞碎片的所得制劑直接加到反應(yīng)混合物中?；蛘?，必要時可進(jìn)一步例如使用上述制備微生物酶的技術(shù)處理制劑，以得到可以如上述微生物酶一樣使用的無細(xì)胞酶。
優(yōu)選的制備方法是用戊二醛/聚1，2-亞乙基亞胺(PE1)處理可溶性酶使之不能溶解。這種不溶化技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，例如參見Ogata，Ottesen & Svendson，Biochim.Biophys.Acta，159，(1968)，403-405。
用于本發(fā)明的麥胚脂肪酶是本領(lǐng)域中已知的。例如，Singer，J.Biol，Chevn.，174，1948，11描述了這樣的脂肪酶，并可按該出版物中所述方法進(jìn)一步純化之。一種商業(yè)來源的麥胚脂肪酶是可由Sigma Chemical Company，St.Lowis，Mo提供的Ⅰ型麥胚脂肪酶(Cat.No.L3001)。
本發(fā)明所用于桔皮酯酶是已知的。例如英國專利申請966，222，美國專利3，202，056和歐洲專利0109300中描述了這些酯酶，并可按這些專利說明書中所述方法制備之。商業(yè)來源的適當(dāng)桔皮酯酶包括可得自Sigma Chemical Company，St.Lowis，Mo的乙酰酯酶(Cat，No.A 4530)。
得自黑曲霉的適當(dāng)脂肪酶是本領(lǐng)域中已知的。Malcata，Hill和Amundson，在Biotechonl.Bioeng.，38，1991，853-868中描述了這種脂肪酶?？墒褂靡阎呐囵B(yǎng)基和生長條件，發(fā)酵黑曲霉的產(chǎn)生脂肪酶的菌株，以制備這種脂肪酶?？捎葿iocatalysts，Ltd.，MainAve.，Traforest Industrial Estate，Pontypridd，Mid Glamorgan，CS 37 5UT，United Kingdom購得由黑曲霉產(chǎn)生的商品脂肪酶。
由枯草芽胞桿菌產(chǎn)生的適當(dāng)酯酶是本領(lǐng)域已知的。例如美國專利3，304，301和歐洲專利0173206中描述了這樣的酯酶。可使用本領(lǐng)域已知的培養(yǎng)基和生長條件發(fā)酵產(chǎn)生酯酶的葳草胞桿菌菌株，以制備這樣的酯酶。優(yōu)選的枯草芽胞桿菌菌株包括ATCC 6633和ATCC 9466。
得自紅冬孢酵母的適當(dāng)酯酶是本領(lǐng)域中已知的。例如，英國專利2060610中描述了這樣的酯酶。可使用已知的培養(yǎng)基和生長條件發(fā)酵能產(chǎn)生酯酶的紅冬孢酵母菌株，以制備這種酯酶。優(yōu)選的紅冬孢酵母菌株包括ATCC 10657。
進(jìn)行常規(guī)實驗的確定方法中所需酶的量，該量可根據(jù)來源、純度及反應(yīng)條件而有所不同。
可在含水介質(zhì)中完成本發(fā)明的方法。例如，可在水中或適于培養(yǎng)脂肪酶或酯酶生產(chǎn)菌的發(fā)酵液中完成該方法。在水中完成本發(fā)明方法的能力，可使?；^程在從培養(yǎng)液中純化的早期階段完成。另外，當(dāng)在含水介質(zhì)中完成?；^程中，不必為了完成酰化而將培養(yǎng)液混合物移入溶劑中。本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基培養(yǎng)微生物。較好使用攪拌或振蕩下的通氣條件。培養(yǎng)微生物的適當(dāng)條件包括提供微生物生長所需的營養(yǎng)素。生長所需的典型培養(yǎng)基包含必要的碳源、氮源和微量元素。
碳源可包括糖如麥芽糖、乳糖、葡萄糖、果糖、甘油、山梨醇、蔗糖、淀粉、甘露醇、丙二醇等;有機(jī)酸如乙酸鈉、檸檬酸鈉等;氨基酸如谷氨酸鈉等;以及醇如乙醇、丙醇等。
氮源可包括N-乙胺A、玉米漿、大豆粉、牛肉膏、酵母浸膏、廢糖蜜、面包酵母、胰胨、營養(yǎng)大豆(nutrisoy)、胨、yeastamin、硝酸鈉、硫酸銨等。
微量元素可包括磷和鎂、錳、鈣、鈷、鎳、鐵、鈉及鉀鹽。
使用的培養(yǎng)基可包含一種以上的碳和氮源或其他營養(yǎng)素。
ATCC Catalogue of Filamentous Fungi，Ameriam Type Culture Collecfion，Roclcville，MD中描述了培養(yǎng)黑曲霉的適當(dāng)技術(shù);美國專利3，304，310中描述培養(yǎng)枯草芽胞桿菌的適當(dāng)技術(shù);英國專利2，060，610描述了培養(yǎng)紅冬孢酵母的適當(dāng)技術(shù)。
在本發(fā)明的方法中，條件可以有很大變異。例如，可在大約-20℃至30℃的溫度下，在大約5至9的pH條件下，用足可完成該反應(yīng)的時間，如通常約用5分鐘至100小時完成該方法。較好在大約0℃至25℃的溫度，在大約7至8的pH的條件下，使反應(yīng)進(jìn)行大約10分鐘至48小時(最好約30分鐘至4小時)。
本發(fā)明的方法至少使4%或更多的式Ⅱ化合物轉(zhuǎn)化為式Ⅰ化合物，且轉(zhuǎn)化率較好為至少10%，更好為至少50%，最好為至少80%。
本發(fā)明的方法較好包括從反應(yīng)介質(zhì)中分離所需產(chǎn)物的附加步驟。分離技術(shù)是本領(lǐng)域中已知的。這些分離技術(shù)包括層析、用有機(jī)溶劑提取、作為不溶性材料沉淀及重結(jié)晶。優(yōu)選的分離技術(shù)是層析、特別是柱層析。例如，可以真空處理反應(yīng)介質(zhì)以除去微量未反應(yīng)的?；w和雜質(zhì)。然后將粗混合物加于制備性層析柱(如Hp 20ss)上。用水洗后，可用適當(dāng)?shù)娜軇┤缂状枷疵撍璁a(chǎn)物。然后用常規(guī)結(jié)晶技術(shù)制得所需產(chǎn)物。
下列實施例是舉例說明本發(fā)明，而不看作是對本發(fā)明的限制。
實施例1使用R.toruloides全細(xì)胞作為酶來源并使用乙酸異丙烯酯作為?；w從des-7-ACA合成7-ACA按下述方法制備用于生產(chǎn)酯酶的紅冬孢酵母(R.toruloides)的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)物為制備種子培養(yǎng)物，首先將冷凍保存的培養(yǎng)物以2%的濃度接種到含100ml下述培養(yǎng)基的500ml培養(yǎng)瓶中2%葡萄糖、1%酵母浸膏、1%細(xì)菌蛋白胨、0.5%KH2PO4、pH6.0。培養(yǎng)基經(jīng)蒸汽滅菌30分鐘。在28℃和250rpm的轉(zhuǎn)速將種子培養(yǎng)物培養(yǎng)24小時，用2%培養(yǎng)體積開始生產(chǎn)階段發(fā)酵。生產(chǎn)階段培養(yǎng)基組成是8%玉米漿、1%K2HPO4、3%葡萄糖，pH6.2。在1L發(fā)酵罐中將培養(yǎng)基蒸汽滅菌2小時。在高通氣條件下，于16-24℃將發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液培養(yǎng)3或4天。按下述方法監(jiān)測酯酶活性向200μL全細(xì)胞中(在蒸餾水中稀釋得到10-20%的底物轉(zhuǎn)化率)加入在0.2M磷酸鉀緩沖液(pH6.5)中濃度為200mg/mL的200μL頭孢菌素C鉀鹽。將混合物于37℃保溫20分鐘并加入3.0mL乙腈/水(1/1)以終止反應(yīng)。在C18反相柱上，使用由10mM辛磺酸、0.1%H3PO4、10%甲醇(pH2.5)組成的流動相，以HPLC法分析乙腈/水混合物的上清液。全培養(yǎng)液的比活性一般為L0-37國際單位/mL(一個國際單位(IU)定義為每分鐘生成1微摩爾產(chǎn)物所需的酶量)。離心全細(xì)胞培養(yǎng)液制備紅冬孢酵母洗出的細(xì)胞濃縮物，并使細(xì)胞懸浮液達(dá)到每毫升80單位活性。經(jīng)差速離心除去玉米漿固形物。將333mg/mL的固形物加到2MHEPES緩沖液(pH6.5-8.1)中，并用濃氨水將pH調(diào)到7.8-8.0，直至達(dá)到使之溶解，以制備脫乙酰7-ACA儲備溶液。調(diào)整溶液的體積以使底物在0.75M HEPES緩沖液中的終濃度為250mg/mL。合并底物儲備溶液(12.5mL)和酶(12.5mL)(紅冬孢酵母細(xì)胞濃縮物，80IU/mL)并加入乙酸異丙烯酯(10mL)以開始反應(yīng)。溫度保持在20-24℃并用濃氨水滴定使pH保持在6.5。持續(xù)攪拌反應(yīng)混合物并使反應(yīng)進(jìn)行2小時，或直到產(chǎn)物生成達(dá)到平臺。用如前所述的HPLC方法監(jiān)測反應(yīng)。圖1顯示了典型的反應(yīng)曲線。
實施例2使用R.toruloides全細(xì)胞作為酶來源并用三醋精作為酰基供基供體從des-7-ACA合成7-ACA按實施例1中所述方法制備紅冬孢酵母和脫乙酰7-ACA(des-7-ACA)。按實施例1中所述于24℃開始保溫，但不同的是加入三醋精作為乙酰供體。圖2中舉例說明了用三醋精作?；w的典型反應(yīng)曲線。
實施例3使用R.toruloides全細(xì)胞作為酶來源并用乙酸乙烯酯作為?；w從des-7-ACA合成7-ACA將500μl des-7-ACA儲備溶液(在750mM HEPES緩沖液(pH7.8)中，250mg/mL)加至500μl細(xì)胞原培養(yǎng)物中。向混合物中加入作為乙醛清除劑的亞硫酸氫鈉(100mg)。加入260μl乙酸乙烯酯并振蕩混合物，使之在-20℃下反應(yīng)。加入濃氨水使pH保持在7.0。從-20℃環(huán)境中取出樣品，周期取樣期間溫度升至0至-10℃之間。分析混合物后證明des-7-ACA至7-ACA的轉(zhuǎn)化率為73%。
實施例4使用R.toruloides全細(xì)胞作為酶來源并使用各種不同的?；w從des-7-ACA合成7-ACA按實施例1中所述方法制備紅冬孢酵母和des-7-ACA)。按實施例1中所述于24℃開始保溫或者使反應(yīng)成比例地降至1.0mL規(guī)模。下列表中總結(jié)了使用各基供體的產(chǎn)物生成情況。
表1供體轉(zhuǎn)化率(%)反應(yīng)時間(分鐘)乙酸異丙烯酯82150三醋精64120乙酸乙烯酯23120乙酸乙酯1420二醋精22120二甘醇二乙酸酯49120順-1,4-二乙酸基丁烷29601,4-三乙酸基丁烷2335乙酸苯酯49351,2,4-三乙酸基苯13601,3-丁二醇二乙酸酯24301,2-丙二醇二乙酸酯4090乙酸-正丁酯430三甘醇二乙酸酯32150乙酸異丙酯1015乙酸異丁酯930肟酯(比較)1.330實施例5
使用經(jīng)用EDTA(pH4.0)處理從R.toruloides全細(xì)胞釋放的酯酶從des-7-ACA和乙酸乙丙烯酯合成7-ACA按實施例1所述方法培養(yǎng)紅冬孢酵母。用EATA(0.1M，pH4.0)處理培養(yǎng)物以從全細(xì)胞中釋放酯酶。在截留分子量為30，000的濾膜上濃縮可溶性酶。使之達(dá)到80IU/mL的最終比活性。按實施例1所述進(jìn)行7-ACA的合成，但不同的是反應(yīng)在6℃下完成。200分鐘后所產(chǎn)生的7-ACA的轉(zhuǎn)化率為79%。
實施例6使用固相化的R.toruloides產(chǎn)生的酯酶從des-7-ACA和乙酸異丙烯酯合成7-ACA按實施例1中已述方法培養(yǎng)紅冬孢酵母。按實施例5中所述方法得到可溶性酯酶。用PEI(0.1%)和戊二醛(0.5%)處理可溶性酶。將混合物攪拌1小時，然后過濾回收固定化的酶。用水洗酶并再次過濾得到活性為350IU/g的固相化酯酶。按實施例1中所述從des-7-ACA合成7-ACA，但不同的是在5℃下進(jìn)行反應(yīng)，并且反應(yīng)混合物中使用60IU/mL的固相化酶。180分鐘后得到7-ACA的轉(zhuǎn)化產(chǎn)率為76%。
實施例7使用枯草芽胞桿菌(ATCC 6633)無細(xì)胞提取物作為酶來源并使用不同的?；w從des-7-ACA合成ACA按下述程序進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。將得自胰酶解大豆瓊脂斜面的培養(yǎng)物接種到含有25mL胰酶解大豆培養(yǎng)基的125mL培養(yǎng)瓶中，于28℃以250rpm的速度振蕩24小時，以制備種子培養(yǎng)物。將種子培養(yǎng)物以1%濃度接種到20個生產(chǎn)儲存瓶中，其中每個500mL培養(yǎng)瓶含有100mL胰酶解大豆培養(yǎng)基。于28℃，以250rpm的速度將培養(yǎng)物振蕩培養(yǎng)4小時。離心1800mL生產(chǎn)階段全培養(yǎng)液，用20mM磷酸鹽緩沖液(pH6.5)洗細(xì)胞，以總體90mL重新懸浮并冷凍之。經(jīng)離心將融解的細(xì)胞進(jìn)一步濃縮至15mL并重新懸浮以使酯酶的終活性達(dá)到0.63IU/mL。
將最后的細(xì)胞濃縮物(0.63IU/mL)500μL加到500μL des-7-ACA母液(實施例1)中。加入400μL乙酰供體以開始反應(yīng)。開始時使pH保持在6.5-7.0，但后來增加到8.0.以提高反應(yīng)速度。pH在8.0保持總共48小時。下表中比較了使用各種乙酰供體時所得7-ACA的轉(zhuǎn)化產(chǎn)率。
表2供體轉(zhuǎn)化率(%)乙酸異丙烯酯16三醋精16三甘醇二乙酸酯27
二甘醇二乙酸酯26實施例8使用濃縮的枯草芽胞桿菌(ATCC 9466)無細(xì)胞提取物作為酶來源并用二甘醇二乙酸酯作為?；w從des-7-ACA合成7-ACA按實施例7所述進(jìn)行用于生產(chǎn)頭孢菌素C酯酶活性的枯草芽胞桿菌的搖瓶發(fā)酵。用截留分子量為30，000的濾膜超濾，將得自1500mL無細(xì)胞提取物的細(xì)胞外酶濃縮到20mL體積，且其中酶的比活性為40UI/mL。將40單位的酶加到1.0mL des-7-ACA母液中，再加入400μl二甘醇二乙酸酯以開始反應(yīng)。加入2M NH3使反應(yīng)的pH保持在7.5。于60分鐘時加入另一份400μL二甘醇二乙酸酯。在t＝60λ120和180分鐘時取樣品并按實施例1中所述方法檢測7-ACA產(chǎn)生量。120分鐘后，有54%的底物被轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物。在繼后60分鐘一直保持著這一水平。
實施例9使用各種事業(yè)上可利用的酯酶和脂肪酶并用乙酸異丙烯酯作為酰基供體從des-7-ACA合成7-ACA在作為?；w的乙酸異丙烯酯存在下，篩選具有從des-7-ACA產(chǎn)生7-ACA能力的各種市售脂肪酶和酯酶。將濃度為125mg/mL的500μL des-7-ACA(按實施例1的相似方法制備)與已懸浮在500μL 20mM磷酸鹽緩沖液(pH6.5)中的各種酶一起保溫。加入500μL乙酸異丙烯酯以啟動反應(yīng)，并在20-24℃下用濃氨水將pH保持在7.0以使反應(yīng)進(jìn)行3小時。下列酶能夠從des-7-ACA合成7-ACA。
表3酶量轉(zhuǎn)化率(%)得自麥胚的I型脂肪酶50mg24(Sigma Chemical Co.)得自黑曲霉的脂肪酶100mg13(Biocatalysts)得自桔皮乙酰酯酶250μL14(Sigma Chemical Co.)實施例10使用7-ACA作為乙酰供體并使用得自麥胚的I型脂肪酶作為酶源從脫乙酰頭孢菌素C合成頭孢菌素C將麥胚I型脂肪酶與脫乙酰頭孢菌素C(在Bis-Tris緩沖液300mM/150mM中，200mg/mL)一起保溫，加入50mg 7-ACA以啟動反應(yīng)并使反應(yīng)在20-24℃，pH7.0條件下進(jìn)行。生成頭孢菌素C的轉(zhuǎn)化產(chǎn)率為19%。
實施例11使用乙酸異丙烯酯或乙酸乙烯酯作為乙酰供體并使用固相化的麥胚I型脂肪酶作為酶源從des-7-ACA合成7-ACA將麥胚(200g)與水(800mL)混合，在攪拌器中勻漿1分鐘，然后再勻漿1分鐘。用1% PEI處理所得混合物并在室溫下攪拌10分鐘。將溶液以8000rpm離心10分鐘，以得到澄清的脂肪酶提取物。通過截留分子量為30，000的濾膜超濾提取物并濃縮到100mL。將所得物冷卻到4℃并經(jīng)10分鐘加入固體硫酸銨(40g)。將所得混合物以8000rpm離心10分鐘。于40℃下攪拌10分鐘將蛋白餅溶解在30mL水中。將懸液以8000rpm離心10分鐘得到50mL脂肪酶濃縮物。將濃縮物于4℃攪拌，加入硅藻土(0.5g)，然后在約1分鐘時間內(nèi)緩慢加入0.5mL 50%戊二醛。將混合物攪拌4分鐘以上，然后經(jīng)2分鐘時間加入1體積的冷丙酮。于4℃將混合物存放10分鐘。過濾除去固定化的酶并重新懸浮在水中。將pH調(diào)到7.0，然后再次過濾回收得到13.5g固定化酶。
將150mg/mL的固定化麥胚脂肪酶與150mg/mL des-7-ACA合并并在1mL 1M HEPES緩沖液(pH7.8)中25℃保溫4小時(振蕩速度250rpm)。在t＝0和150分鐘時加入乙酸乙烯酯(0.1mL)或乙酸異丙烯酯(0.10mL)。4小時后，在分別使用乙酸乙烯酯和乙酸異丙烯酯的情況下，7-ACA的轉(zhuǎn)化產(chǎn)率分別為18%和7%。
實施例12苯乙酰脫乙酰7-ACA的酰化制得有下列成分的混合物苯乙酰-脫乙酰7-ACA(50mg)、2M MES/NH+緩沖液(0.5mL)、乙酸甲酯(4.5mL)、乙酸異丙烯酯(0.5mL)和紅冬孢酵母細(xì)胞的懸浮液(150IU/mL)。混合物于25℃攪拌2小時(使pH降至6.0)。此時，TLC顯示反應(yīng)混合物為大約50∶50的未反應(yīng)苯乙酰-脫乙酰7-ACA與苯乙酰7-ACA的混合物(與真實化合物相比較)。
實施例13從7-ACA和未反應(yīng)的脫乙酰7-ACA中分離合成的7-ACA真空處理50mL如實施例1中所述的反應(yīng)混合物，以除去微量丙酮和未反應(yīng)的乙酸異丙烯酯。7-ACA和脫乙酰7-ACA的終濃度分別為2.45%和1.25%。將樣品加于制備性HP20ss柱(4cm×30cm)上。用150mL蒸餾水洗柱并用10%甲醇洗脫產(chǎn)物，每管收集10mL。圖3顯示了典型的柱洗脫曲線。合并7-ACA峰值部分(100mL)并經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮到20mL終體積。用6NHCl使pH降至4.2，加入10mL甲醇并冷卻樣品。過濾收集所得固體物。7-ACA的回收率為65%，余留有5%脫乙酰7-ACA且存在的7-ADCA少于0.1%。
權(quán)利要求
1.制備下列結(jié)構(gòu)式之頭孢菌素化合物的?；椒?， 其中，R1是氫或R-C-的?；鶊F(tuán)-其中R是羧酸的殘基，X是氫或鹵素，且G是硫、氧、亞砜、砜或亞甲基；該方法包括在得到紅冬孢酵母、麥胚、桔皮、枯草芽胞桿菌、黑曲霉的脂肪酶或酯酶存在下，使結(jié)構(gòu)式 的化合物與?；w在含水介質(zhì)中反應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的脂肪酶或酯酶得自紅冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的脂肪酶或酯酶得自紅冬孢酵母ATCC 10657。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中R1是氫、乙酰、戊二酰、α-氨基己二?；虮揭阴＃珿是硫且X是氫。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中G是硫。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中R1是氫。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中R1是氫。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的?；w是式 的基團(tuán)-其中R″是C1-C10烷基、C2-C10烯基、C3-C10環(huán)烷基、C3-C10環(huán)烯基、C2-C10炔基、C6-C30芳基、C1-C10被取代的烷基、C2-C10被取代的烯基、C3-C10被取代的環(huán)烷基、C3-C10被取代的環(huán)烯基、C6-C30被取代的芳基、式 的基團(tuán)-其中n是2或大于2的整數(shù)，R'''是H或乙酰或式 的基團(tuán)-其中n和R'''定義同上所述;X是氫或鹵素。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中R″是C2-C6烯基、被1-3個乙酸基基團(tuán)取代的C1-C6烷基、C6-C10芳基，或式 的基團(tuán)-其中n是2至100的整數(shù)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中?；w是乙酸異丙烯酯、三醋精、乙酸乙烯酯、乙酯乙酯、二醋精、二甘醇二乙酸酯、順-1，4-二乙酸基丁烷、1，4-二乙酸基丁烷、乙酸苯酯、1，2，4-三乙酸基苯、1，3-丁二醇二乙酸酯、1，2-丙二醇二乙酸酯、乙酸-正丁酯、三甘醇二乙酸酯、乙酸異丙酯或乙酸異丁酯。
11.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中?；w是乙酸異丙烯酯、三醋精、乙酸乙烯酯、乙酯乙酯、二醋精、二甘醇二乙酸酯、順-1，4-二乙酸基丁烷、1，4-二乙酸基丁烷、乙酸苯酯、1，2，4-三乙酸基苯、1，3-丁二醇二乙酸酯、1，2-丙二醇二乙酸酯、乙酸-正丁酯、三甘醇二乙酸酯、乙酸異丙酯或乙酸異丁酯。
12.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中酰基供體是乙酸異丙烯酯、三醋精、乙酸乙烯酯、乙酯乙酯、二醋精、二甘醇二乙酸酯、順-1，4-二乙酸基丁烷、1，4-二乙酸基丁烷、乙酸苯酯、1，2，4-三乙酸基苯、1，3-丁二醇二乙酸酯、1，2-丙二醇二乙酸酯、乙酸-正丁酯、三甘醇二乙酸酯、乙酸異丙酯或乙酸異丁酯。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中酰基供體是乙酸異丙烯酯、三醋精、乙酸-乙烯酯、二醋精、二甘醇二乙酸酯、順-1，4-二乙酸基丁烷、1，4-二乙酸基丁烷、乙酸苯基酯、1，3-丁二醇二乙酸酯、1，2-丙二醇二乙酸酯或三甘醇二乙酸酯。
14.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中酰基供體是乙酸異丙烯酯、三醋精、乙酸-乙烯酯、二醋精、二甘醇二乙酸酯、順-1，4-二乙酸基丁烷、1，4-二乙酸基丁烷、乙酸苯基酯、1，3-丁二醇二乙酸酯、1，2-丙二醇二乙酸酯或三甘醇二乙酸酯。
15.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中?；w是乙酸異丙烯酯、三醋精、乙酸-乙烯酯、二醋精、二甘醇二乙酸酯、順-1，4-二乙酸基丁烷、1，4-二乙酸基丁烷、乙酸苯基酯、1，3-丁二醇二乙酸酯、1，2-丙二醇二乙酸酯或三甘醇二乙酸酯。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的方法在大約-20℃至30℃的溫度，在大約5至9的pH條件下進(jìn)行大約5分鐘至100小時。
17.根據(jù)權(quán)利要求1的方法在大約0℃至25℃的溫度，在大約7至8的pH條件下進(jìn)行大約30分鐘至4小時。
18.根據(jù)權(quán)利要求1的方法包括分離所需產(chǎn)物的附加步驟。
19.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中分離是經(jīng)層析完成的。
20.根據(jù)權(quán)利要求3的方法是用全細(xì)胞、用EDTA處理細(xì)胞后得到的可溶性酶、或用戊二醛/PEI處理可溶性酶后得到的固定化酶完成的。
全文摘要
使用脂肪酶或酯酶完成3-羥甲基頭孢菌素的3′酰化的方法。優(yōu)選的酶是從紅冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)得到的。
文檔編號C12P35/00GK1112927SQ9510190
公開日1995年12月6日 申請日期1995年1月28日 優(yōu)先權(quán)日1994年2月3日
發(fā)明者J·J·厄謝爾, G·羅曼克, M·波利迪諾, D·A·洛 申請人:布里斯托爾-米爾斯·斯奎布公司