一株水解米渣的蛋白酶產(chǎn)生菌:枯草芽孢桿菌及其篩選與使用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株水解米渣的蛋白酶產(chǎn)生菌：枯草芽孢桿菌及其篩選和使用方法，該枯草芽孢桿菌（ Bacillussubtilis ）菌株純培養(yǎng)物于2014年5月13日保藏于武漢中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國武漢·武漢大學(xué)，郵編430072，簡(jiǎn)稱枯草芽孢桿菌HP90，保藏編號(hào)CCTCCNO.M2014201。通過初篩和復(fù)篩篩選得到目標(biāo)菌株。取斜面保藏菌株培養(yǎng)后，即直接用于米渣中蛋白質(zhì)的水解?？莶菅挎邨U菌HP90用于米渣蛋白水解，水解度達(dá)19.83％。該菌株成本低、能循環(huán)利用、穩(wěn)定性好、綠色安全、能直接用于生物催化，原料來源廣泛，方法簡(jiǎn)單實(shí)用，因此，該菌株具有重要應(yīng)用前景，還可應(yīng)用于其他蛋白質(zhì)的水解。CCTCC NO.M 20142012014.05.13
【專利說明】-株水解米渣的蛋白酶產(chǎn)生菌：枯草芽抱桿菌及其篩選與 使用方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物或酶，特別涉及蛋白酶產(chǎn)生菌。

【背景技術(shù)】
[0002] 稻谷，在植物學(xué)上屬禾本科稻屬普通栽培稻亞屬種的普通稻亞種，是全球第一大 糧食品種。稻谷的年均產(chǎn)量大約占到了全國糧食總產(chǎn)量的2/5,達(dá)到了 1.90億t。米渣是 W早釉米、碎米、陳化米等為原料進(jìn)行發(fā)酵和生產(chǎn)糖漿、味精、生化藥品等過程中被過濾掉 米漿后剩下的殘?jiān)?，價(jià)格低廉，產(chǎn)量巨大，在大米淀粉糖的生產(chǎn)過程中每消耗7t大米就要 產(chǎn)生It米渣。米渣中蛋白質(zhì)含量約為40%?70%，相當(dāng)于稻谷中蛋白質(zhì)含量的5?8倍， 其含量接近大豆，而且氨基酸配比符合WH0/FA0推薦的理想模式，其品質(zhì)被公認(rèn)為糧食種 子蛋白中的最佳者。但是該些優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源大部分都W干粉的形式廉價(jià)的賣給了飼料 廠做飼料，并沒有得到深度開發(fā)和利用，若將該些米渣蛋白資源轉(zhuǎn)化成具有高附加值的氨 基酸和多膚，不但能提高其生物效價(jià)、經(jīng)濟(jì)價(jià)值，對(duì)提高我國稻谷深加工的技術(shù)含量，W及 促進(jìn)整個(gè)糧食產(chǎn)業(yè)的發(fā)展都有著深遠(yuǎn)的影響。
[0003] 蛋白質(zhì)經(jīng)酸、堿或者蛋白酶處理可獲得氨基酸和多膚。酸、堿水解作用強(qiáng)烈會(huì)破壞 一些敏感氨基酸，并且生成有毒的氯丙醇類物質(zhì)。酶水解條件溫和，對(duì)敏感氨基酸無破壞， 能最大保留原料理化性質(zhì)、風(fēng)味、功能特性、綠色安全，能耗小?？墒悄壳岸鄶?shù)利用商品蛋白 酶水解蛋白質(zhì)，該使得工業(yè)化生產(chǎn)成本較高，因此，篩選蛋白酶產(chǎn)生菌尤為重要。
[0004] 目前中國專利數(shù)據(jù)庫中，涉及蛋白酶產(chǎn)生菌的專利申請(qǐng)件不多，僅有 ZL2010101038046號(hào)《一種耐有機(jī)溶劑蛋白酶產(chǎn)生菌及其所產(chǎn)耐有機(jī)溶劑蛋白酶的基因和 應(yīng)用》、2007101919691號(hào)《一種耐有機(jī)溶劑堿性蛋白酶產(chǎn)生菌W及該耐有機(jī)溶劑堿性蛋白 酶的基因和應(yīng)用》和2013101991045號(hào)《一種膠原蛋白酶產(chǎn)生菌》。至今為止，尚無涉及水 解米渣的蛋白酶產(chǎn)生菌的申請(qǐng)件。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明旨在提供一株水解米渣的蛋白酶產(chǎn)生菌一枯草芽抱桿菌，使之能夠用于 米渣蛋白的生物法水解。
[0006] 本發(fā)明的又一目的是提供上述枯草芽抱桿菌的篩選方法及使用方法，使其具備特 定的工業(yè)用途。
[0007] 為達(dá)到上述目的，發(fā)明人提供一株水解米渣的蛋白酶產(chǎn)生菌是枯草芽抱桿菌 炬acillus subtilis)，該菌株純培養(yǎng)物已經(jīng)于2014年5月13日保藏于武漢中國典型培 養(yǎng)物保藏中也，保藏單位地址：中國武漢?武漢大學(xué)，郵編430072,保藏編號(hào)為CCTCC NO. M 2014201。該菌株簡(jiǎn)稱枯草芽抱桿菌HP90,系從中國貴州傳統(tǒng)臘腸中分離得到。
[0008] 上述枯草芽抱桿菌HP90形態(tài)特征和生理生化特征接近芽抱桿菌屬，枯草芽抱桿 菌HP90 的 16S rRNA序列與公細(xì)(AJ276351)序列同源性在99% W上，看家基因recA序列與公acj77"s s"如/7. (CP002906. I) 序列同源性達(dá)99%。根據(jù)《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)>中芽抱桿菌屬的分類概況，HP90屬 芽抱桿菌綱MaciWi )，芽抱桿菌目MacW知7es )，芽抱桿菌科)，芽抱桿菌 屬(公aciJ7化0,枯草芽抱桿菌種(化?ciJ7化況
[0009] 發(fā)明人提供的枯草芽抱桿菌HP90菌株的篩選方法是；先從臘腸采樣，將樣品中的 蛋白酶產(chǎn)生菌分別經(jīng)富集培養(yǎng)后，采用酪蛋白為底物，經(jīng)過富集培養(yǎng)后稀釋涂布在酪蛋白 平板選擇培養(yǎng)基上，W微生物分解酪蛋白的能力作為初篩指標(biāo)，挑取具有透明圈較大的菌 落在酪蛋白平板上H區(qū)劃線純化，純化后的單菌落移接斜面培養(yǎng)基保存，從而實(shí)現(xiàn)初篩；之 后W米渣為底物，搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，W微生物搖瓶發(fā)酵米渣，離也，上清液注酪蛋白平板孔，恒 溫培養(yǎng)，W平板孔直徑為指標(biāo)第一次復(fù)篩；平板經(jīng)直徑較大的菌株再經(jīng)搖瓶發(fā)酵米渣，離也 后測(cè)上清液蛋白酶活力，W酶活為指標(biāo)二次復(fù)篩；最后酶活較高的菌株發(fā)酵米渣，離也，上 清液沸水滅酶，測(cè)上清液中氨態(tài)氮，W氨態(tài)氮為指標(biāo)第H次復(fù)篩。
[0010] 所述富集培養(yǎng)的條件為：富集培養(yǎng)基W g/lOOmL計(jì)的成分；牛肉膏0. 5?1. 0,蛋 白腺 0. 5 ?1. 0,（畑4)25〇4 0. 1 ?0. 2，K2HP04 0. 5 ?1. 0，M拆〇4 0. Ol ?0. 02，CaCl2 0. Ol?0. 02,化Cl 0. 5?1. 0，pH 6. 5?7. 5 ;酪蛋白選擇培養(yǎng)基W g/100血計(jì)的成分：牛 肉膏 0. 5 ?1. 0,酪蛋白 0. 5 ?1. 0，（畑4)25〇4 0. 1 ?0. 2,馬冊(cè)〇4 0. 5 ?1. 0, M拆〇4 ? 7&0 0. Ol ?0. 02, CaCla 0. Ol ?0. 02,化Cl 0. 5 ?1. 0,瓊脂粉 2. 0,抑 6. 5 ?7. 5 ;斜面保藏 培養(yǎng)基細(xì)菌為細(xì)菌完全培養(yǎng)基，真菌為PDA培養(yǎng)基；種子培養(yǎng)基同發(fā)酵培養(yǎng)基W g/1 OOmL計(jì) 的成分：米渣 1. 2 ?1. 8,化Cl 0. 5 ?1. 0, M拆〇4 ? 7&0 0. Ol ?0. 02, CaCla 0. Ol ?0. 02， 馬冊(cè)〇4 0. 5 ?1. 0, pH 6. 5 ?7. 5。
[0011] 為了驗(yàn)證本發(fā)明的菌株，進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn)： (1)樣品采集： 23個(gè)分離樣品分別采集于2012年10月，從貴州花溪傳統(tǒng)臘肉、豆鼓、酸肉、發(fā)酵肉、豆 制品、酒曲、酒酷等采樣，用聚己帰袋封口；2012年11月從貴州矜東南屠宰場(chǎng)及花溪貴州大 學(xué)南區(qū)食堂附近的表層±壤、齡泥采樣，用聚己帰袋封口；取回樣品后，即著手分離工作。 [00 1引 口)富集培養(yǎng)： 稱取5. Og樣品，加入到50血無菌生理鹽水中，再放入4顆小玻璃珠，于30°C、18化/min 下振蕩培養(yǎng)30min，取5mL加入富集培養(yǎng)基中，3(TC、180r/min下?lián)u床富集培養(yǎng)2化； 上述富集培養(yǎng)基的成分為（W g/100血計(jì)）；牛肉膏0.5?1.0,蛋白腺0.5?1.0， (NH4)2S04 0. 1 ?0. 2,馬冊(cè)04 0. 5 ?1. 0, MgS04 ? 7&0 0. Ol ?0. 02, CaCla 0. Ol ?0. 02， 化Cl 0. 5?1. 0 ;培養(yǎng)基的抑6. 5?7. 5。
[0013] (3)初篩： 取上述0. 2mL稀釋適當(dāng)梯度的富集菌液涂布于酪蛋白選擇培養(yǎng)基平板，靜置5min，倒 置平板，于3(TC培養(yǎng)。挑取形成透明圈較大的單一菌落，劃線純化后在試管斜面上劃Z形 線，3(TC條件下培養(yǎng)至出現(xiàn)豐滿的菌落后，4 C冰箱保藏。
[0014] 初篩共獲得形成明顯透明圈的菌株115株，其中菌株HP90形成的透明圈最大。
[00巧]上述初篩酪蛋白選擇培養(yǎng)基的成分為（W g/100血計(jì)）；牛肉膏0.5?1.0,酪蛋 白 0. 5 ?1. 0，（畑4)25〇4 0. 1 ?0. 2,馬冊(cè)〇4 0. 5 ?1. 0, M拆〇4 ? 7&0 0. Ol ?0. 02, CaCla 0. Ol?0. 02,化Cl 0. 5?1. 0,瓊脂粉2. 0 ;培養(yǎng)基的抑6. 5?7. 5。
[0016] 斜面保藏培養(yǎng)基；細(xì)菌用細(xì)菌完全培養(yǎng)基，真菌用PDA培養(yǎng)基。
[0017] (4)第一次復(fù)篩： 用打孔器在初篩酪蛋白選擇培養(yǎng)基平板上打孔，每平板均勻打3孔(H孔為一組平行)， 孔徑為0. 4cm。挑取初篩試管菌2環(huán)接入種子培養(yǎng)基中，于3(TC、180r/min下培養(yǎng)2化后， W 6%?8% (1.235X 1〇6 C化/mL)接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在同樣條件下培養(yǎng)2化后， 于4°C、lOOOOr/min離也lOmin，上清液即粗酶液。取30 y L粗酶液注入平板孔，平板于3(TC 恒溫培養(yǎng)1化后，測(cè)量水解透明圈直徑d作為第一次復(fù)篩指標(biāo)；選取形成透明圈直徑最大的 酶液所對(duì)應(yīng)的菌株W備第二次復(fù)篩。
[0018] 經(jīng)第一次復(fù)篩，115株菌株粗酶液都形成透明圈，透明圈直徑從LOcm到2. 8cm 不等，透明圈直徑d > 2. 4cm的菌株共26株，菌株HP90形成的透明圈直徑最大，為 2. 75 + 0. 05cm。
[0019] 上述種子培養(yǎng)基同發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為（W g/100血計(jì)）；米渣1.2?1.8,化Cl 0. 5 ?1. 0, M拆〇4 ? 7&0 0. Ol ?0. 02, CaCla 0. Ol ?0. 02, K2HPO4 0. 5 ?1. 0 ;培養(yǎng)基的抑 6. 5 ?7. 5。
[0020] 妨第二次復(fù)篩： 選取水解透明圈直徑d > 2. 4cm的菌株，采用化Iin-酷試劑顯色法測(cè)定其粗酶液(粗 酶液制備同第一次復(fù)篩中粗酶液制備）中蛋白酶活力。
[002。 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取9個(gè)IOmL容量瓶依次編號(hào)0到8,分別加入100帖/血的酪 氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0，1，2, 3,4, 5,6, 7, SmU用蒸觸水定容，制得濃度依次為0,10, 20, 30,40, 50， 60, 70,80帖/血的酪氨酸溶液。分別取上述梯度酪氨酸溶液1血，各加0. 4mol/L崎哪溶 液5血，F(xiàn)olin-酷試劑1血，置于40°C水浴中顯色20min,取出于680皿波長，IOmm比色皿， W不含酪氨酸的0號(hào)管為空白，分別測(cè)定其吸光度；再W吸光度為縱坐標(biāo)，酪氨酸的濃度為 橫坐標(biāo)，繪制吸光度值-酪氨酸濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0022] 酶活力測(cè)定；粗酶液用抑7. 5的磯酸緩沖液稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，供測(cè)試用。將1%酪 蛋白溶液放入4(TC恒溫水浴中預(yù)熱5min，然后按下述過程操作：①試驗(yàn)組(需作3個(gè)平行 試驗(yàn)）；吸取Im稀釋的粗酶液加入試管，40°C水浴預(yù)熱2min，加1 %酪蛋白溶液ImL搖勻， 4(TC準(zhǔn)確計(jì)時(shí)lOmin，加0. 4mol/L H氯己酸2血搖勻終止反應(yīng)，取出靜置lOmin，過濾，取 1血濾液，力日0. 4mol/LNa2C〇35mL，加化Iin-酷試劑lmL，4(TC顯色20min，于680nm波長，用 IOmm比色皿測(cè)其吸光度。②空白組；同試驗(yàn)組，只是將酪蛋白溶液和H氯己酸溶液的加入 順序調(diào)換。
[0023] 酶活力計(jì)算；酶活單位定義為ImL粗酶液在4(TC條件下，Imin水解酪蛋白產(chǎn)生 1嗦酪氨酸的酶量為一個(gè)酶活力單位（U)D發(fā)酵液蛋白酶活力（u/mL) =AXKX4n/10,式中， A-樣品平行試驗(yàn)的平均吸光度；K一吸光常數(shù)；4一反應(yīng)液的總體積（mL) ;10-反應(yīng)時(shí)間 (min) ；n一粗酶液稀釋倍數(shù)。
[0024] 經(jīng)第二次復(fù)篩得到發(fā)酵液酶活在190u/mL W上的菌株8株，其中菌株HP90的蛋白 酶活力高于其他7株，達(dá)354+ 1.加/mL。
[00幼做第S次復(fù)篩： 選取上述蛋白酶活力在190u/mL W上的8株菌株發(fā)酵后離也，上清液沸水滅酶后測(cè)定 其中氨基酸態(tài)氮含量；所述上清液制備同第一次復(fù)篩上清液的制備。
[0026] 氨基酸態(tài)氮的測(cè)定；吸取5血上述滅過酶的發(fā)酵上清液，置于100血容量瓶中，蒸 觸水定容。然后吸取20mL置于200mL燒杯中，加60mL蒸觸水，開動(dòng)磁力攬拌器，用0. 05mol/ L化OH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至酸度計(jì)指示抑=8. 2。再加入10血甲酵溶液混勻，再用0. 05mol/ LNaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至抑=9. 2,記下消耗0. 05mol/LNa0H標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升數(shù)。同時(shí)做試劑 空白試驗(yàn)。
[0027] 氨基酸態(tài)氮計(jì)算；X=[ (Vi-Va) ? CX0. 014] X 100/[5X (VlOO)] 式中：X-樣品中氨態(tài)氮的含量，g/lOOmL ;Vi-測(cè)定用樣品稀釋液加入甲酵溶液后消耗 化OH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL八2-實(shí)際空白試驗(yàn)加入甲酵溶液后消耗化OH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積， 血；Vs-樣品稀釋液取用量，血；C一化OH標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L ;0. 014- 1血Imol/L化OH 標(biāo)準(zhǔn)溶液溶液相當(dāng)于氮的g數(shù)。
[0028] 經(jīng)第H次復(fù)篩，菌株HP90發(fā)酵液氨態(tài)氮明顯高于其他7株，排列第1，為 22. 20mg/100血，對(duì)應(yīng)米渣蛋白水解度為（19. 83 + 0. 5) %。
[002引菌株HP90的鑒定： 鑒定菌種的屬種，了解其基本的生理生化特征，對(duì)有效地利用已有文獻(xiàn)、指導(dǎo)進(jìn)一步 實(shí)驗(yàn)有著重要作用。為此，對(duì)枯草芽抱桿菌HP90菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，生理生化特征，16S rRNA及看家基因recA序列鑒定。
[0030] 形態(tài)特征；將菌種劃線接種于細(xì)菌完全培養(yǎng)基固體平板于3(TC，培養(yǎng)1她。在細(xì)菌 完全培養(yǎng)基上解淀粉芽抱桿菌HP90菌落生長較快，菌落呈淡黃色，半透明，圓形或近圓形， 邊緣齊整，光滑半濕潤，稍隆起，菌落直徑1. 5?3. 5mm，不產(chǎn)生色素，粘稠、易挑取。取斜面 保存幼齡菌進(jìn)行革蘭氏染色，在光學(xué)顯微鏡下枯草芽抱桿菌HP90為短直桿狀，革蘭氏染色 都呈紫色，為革蘭氏陽性桿菌。生理生化特征采用API 20肥、Biolog GP微生物鑒定自動(dòng) 分析系統(tǒng)，生理生化結(jié)果見表1、表2。
[0031] 表1菌株HP90生理生化特征一利用碳源產(chǎn)酸

【權(quán)利要求】
1. 一株水解米渣的蛋白酶產(chǎn)生菌：枯草芽孢桿菌，其特征在于該枯草芽孢桿菌 菌株純培養(yǎng)物已于2014年5月13日保藏于武漢中國典型培養(yǎng)物保 藏中心，保藏單位地址：中國武漢?武漢大學(xué)，郵編430072,簡(jiǎn)稱枯草芽孢桿菌HP90,保藏編 號(hào)為 CCTCC NO. M 2014201。
2. 如權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌，其特征在于所述枯草芽孢桿菌HP90的16S rRNA序列與似57序列同源性在99%以上，看家基因recA序 列與5^5/7. 7?0tW-7序列同源性達(dá)99 %;根據(jù)《伯杰氏 系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》中芽孢桿菌屬的分類規(guī)定，HP90屬芽孢桿菌綱(feciBi)，芽孢桿菌 目（ifeciJJa/es )，芽孢桿菌科(ifeci77acea<9 )，芽孢桿菌屬)，枯草芽孢桿菌種 {Bacillus subtil is、。
3. 如權(quán)利要求1和2所述的解淀粉芽孢桿菌的篩選方法，其特征在于：先從臘腸采樣， 將樣品中的蛋白酶產(chǎn)生菌分別經(jīng)富集培養(yǎng)后，采用酪蛋白為底物，經(jīng)過富集培養(yǎng)后稀釋涂 布在酪蛋白平板選擇培養(yǎng)基上，以微生物分解酪蛋白的能力作為初篩指標(biāo)，挑取具有透明 圈最大的菌落在酪蛋白平板上三區(qū)劃線純化，純化后的單菌落移接斜面培養(yǎng)基保存，從而 實(shí)現(xiàn)初篩；之后以米渣為底物，搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，以微生物搖瓶發(fā)酵米渣，離心，上清液注酪蛋 白平板孔，恒溫培養(yǎng)，以平板孔直徑為指標(biāo)第一次復(fù)篩；平板經(jīng)直徑最大的菌株再經(jīng)搖瓶發(fā) 酵米渣，離心后測(cè)上清液蛋白酶活力，以酶活為指標(biāo)二次復(fù)篩；最后酶活較高的菌株發(fā)酵米 渣，離心，上清液沸水滅酶，測(cè)上清液中氨態(tài)氮，以氨態(tài)氮為指標(biāo)第三次復(fù)篩。
4. 如權(quán)利要求3所述的篩選方法，其特征在于：富集培養(yǎng)基以g/100mL計(jì)的成分：牛 肉膏 0? 5 ?1. 0,蛋白胨 0? 5 ?1. 0，（NH4)2S04 0? 1 ?0? 2, K2HP04 0? 5 ?1. 0, MgS04 ? 7H20 0? 01 ?0? 02, CaCl2 0? 01 ?0? 02, NaCl 0? 5 ?1. 0,培養(yǎng)基的 pH 6. 5 ?7. 5 ;酪蛋白選擇 培養(yǎng)基以g/l〇〇mL計(jì)的成分：牛肉膏0. 5?1. 0,酪蛋白0. 5?1. 0,（NH4)2S04 0. 1?0. 2， K2HP04 0? 5 ?1. 0, MgS04 ? 7H20 0? 01 ?0? 02, CaCl2 0? 01 ?0? 02, NaCl 0? 5 ?1. 0,瓊月旨 粉2. 0,培養(yǎng)基的pH 6. 5?7. 5 ;斜面保藏培養(yǎng)基細(xì)菌為細(xì)菌完全培養(yǎng)基，真菌為PDA培 養(yǎng)基；種子培養(yǎng)基同發(fā)酵培養(yǎng)基以g/l〇〇mL計(jì)的成分：米渣1. 2?1. 8, NaCl 0. 5?1. 0， MgS04.7H20 0? 01 ?0? 02，CaCl2 0? 01 ?0? 02，K2HP04 0? 5 ?1. 0,培養(yǎng)基的 pH 6. 5 ?7. 5。
5. 如權(quán)利要求1和2所述的枯草芽孢桿菌的使用方法，其特征在于：取斜面保藏菌株 枯草芽孢桿菌HP90 2環(huán)分別接于種子培養(yǎng)基中，于30°C、180r/min搖床培養(yǎng)24h后，以 6%?8%的接種量分別接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，同樣條件下?lián)u床培養(yǎng)24h，即用于米渣蛋白水 解。
6. 如權(quán)利要求5所述的使用方法，其特征在于：所述種子培養(yǎng)基的成分以g/100mL計(jì) 的成分為：米渣 1. 2 ?1. 8，NaCl 0? 5 ?1. 0，MgS04 *7H20 0? 01 ?0? 02，CaCl2 0? 01 ?0? 02， K2HP04 0? 5 ?1. 0 ;其 pH 6. 5 ?7. 5。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK104357346SQ201410474539
【公開日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月18日
【發(fā)明者】何臘平, 薛榮濤, 李翠芹 申請(qǐng)人:貴州大學(xué)