一種磷酸化的細(xì)菌蛋白質(zhì)NopL的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種磷酸化的細(xì)菌蛋白質(zhì)NopL的應(yīng)用。本發(fā)明成功地在體外表達(dá)純化NopL及其突變體，并進(jìn)行磷酸化實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)NopL能直接被SIPK所磷酸化，這是首次發(fā)現(xiàn)的一個(gè)能夠直接作為SIPK底物的細(xì)菌蛋白。另外通過構(gòu)建NopL缺失磷酸化位點(diǎn)的突變體，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)NopL不能再被蛋白激酶磷酸化之后，它同時(shí)也喪失了其原本在與豆科植物共生過程中發(fā)揮的促進(jìn)作用，說明了NopL這種促進(jìn)共生的功能是磷酸化依賴的。該發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究豆科植物與根瘤菌互作機(jī)制提供了新的研究方向，具備極高的理論與實(shí)踐價(jià)值。
【專利說明】一種磷酸化的細(xì)菌蛋白質(zhì)NopL的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。更具體地，涉及一種磷酸化的細(xì)菌蛋白質(zhì)NopL 的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 大量研究監(jiān)測(cè)顯示，土壤中有限的氮含量是限制農(nóng)作物生長(zhǎng)發(fā)育的重要因素。雖 然氮以氣體形式廣泛存在，但植物在土壤中可直接吸收利用的氮?jiǎng)t是以銨鹽或硝酸鹽形式 存在的。人們只能通過大量使用化學(xué)固氮法生產(chǎn)化肥，以保證農(nóng)作物的產(chǎn)量。然而這樣的 生產(chǎn)方法需要耗費(fèi)大量的礦物燃料，并且增加溫室氣體二氧化碳的排放，而且近年來緣于 化肥的過度使用也帶來日益顯著的環(huán)境問題，這顯然不利于農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。
[0003] 相比之下，生物固氮具有化學(xué)固氮無可比擬的優(yōu)勢(shì)。其不依賴于礦物能源，且生物 固氮本身就是大自然不斷進(jìn)化的結(jié)果，是整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的一部分。根瘤菌侵染豆科植物并 成功定殖后，宿主根部就會(huì)形成"根瘤"這樣的特殊結(jié)構(gòu)。根瘤菌就是在這一特殊的植物器 官的保護(hù)下，通過固氮酶不斷將氮?dú)廪D(zhuǎn)化為植物可利用的氨，同時(shí)宿主植物將光合作用合 成的碳水化合物蘋果酸鹽提供給根瘤菌作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。然而每種根瘤菌僅能與有限種類和 數(shù)量的宿主進(jìn)行共生固氮，換言之，根瘤菌對(duì)于不同的豆科植物具有嚴(yán)格的宿主特異性。產(chǎn) 生特異性的主要原因是因?yàn)閮烧咧g共生關(guān)系的形成受到了大量的信號(hào)分子調(diào)控。
[0004] 其中，由根瘤細(xì)菌分泌的、并能直接轉(zhuǎn)運(yùn)至宿主細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的蛋白是極其重要的決 定宿主特異性的因素。以根瘤菌NGR234為例，由其分泌的III型效應(yīng)蛋白NopL與植物的防 御反應(yīng)相關(guān)，能在共生過程中發(fā)揮極其顯著的促進(jìn)作用，例如在與菜豆（cv. Tendergreen) 互作過程中能夠明顯的抑制根瘤細(xì)胞的早衰，延長(zhǎng)有效根瘤的壽命從而延長(zhǎng)固氮的周期。 另外，NopL相比其他同樣由根瘤菌NGR234分泌的III型效應(yīng)蛋白來說，分泌量居首位，因 而研究該蛋白在真核細(xì)胞中的生化功能對(duì)于研究根瘤菌與豆科植物互作的分子機(jī)制具有 極其重要的意義。目前未見有相關(guān)的研究成果和報(bào)道，NopL是如何影響根瘤細(xì)胞的早衰， 具體的機(jī)制尚不清楚，NopL影響根瘤細(xì)胞早衰真正機(jī)制的研究仍然是困擾我們的一個(gè)技術(shù) 難題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有NopL抑制根瘤細(xì)胞早衰的具體機(jī)制的研究 不足，公開NopL在真核細(xì)胞中影響根瘤細(xì)胞早衰的直接機(jī)制，為根瘤固氮相關(guān)研究提供理 論基礎(chǔ)和應(yīng)用指導(dǎo)。
[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種磷酸化的細(xì)菌蛋白質(zhì)NopL的應(yīng)用，具體是在促進(jìn)根瘤 菌和植物共生中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明另一目的是提供水楊酸誘導(dǎo)的蛋白激酶（salicylic acid induced protein kinase，SIPK)的激活劑在制備根瘤細(xì)胞早衰抑制劑方面和在構(gòu)建抗根瘤細(xì)胞早 衰的轉(zhuǎn)基因豆科植物方面的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明再一目的是提供一種編碼失活形式NopL重組蛋白的基因，其核苷酸序列 如 SEQ ID N0 :1 所示。
[0009] 本發(fā)明再一目的是提供一種失活形式NopL重組蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0: 2所示。
[0010] 本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)： 本發(fā)明提供了磷酸化的細(xì)菌蛋白質(zhì)NopL在促進(jìn)根瘤菌與植物共生中的應(yīng)用。
[0011] 具體地，所述促進(jìn)根瘤菌與植物共生是指抑制根瘤細(xì)胞的早衰。
[0012] 所述磷酸化的細(xì)菌蛋白質(zhì)NopL是指被水楊酸誘導(dǎo)的蛋白激酶所磷酸化的細(xì)菌蛋 白質(zhì)NopL。
[0013] 本發(fā)明還提供了水楊酸誘導(dǎo)的蛋白激酶的激活劑在制備根瘤細(xì)胞早衰抑制劑方 面的應(yīng)用。
[0014] 同時(shí)也提供了水楊酸誘導(dǎo)的蛋白激酶的激活劑在構(gòu)建抗根瘤細(xì)胞早衰的轉(zhuǎn)基因 豆科植物方面的應(yīng)用。
[0015] 另外，本發(fā)明還提供了一種編碼失活形式NopL重組蛋白（NopL_S12xA，即NopL的 衍生體）的基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0 :1所示。
[0016] 同時(shí)也提供了一種失活形式NopL重組蛋白（NopL-S12xA)，其氨基酸序列如SEQ ID N0 :2 所示。
[0017] 本發(fā)明還提供了一種包含有失活形式NopL重組蛋白（NopL-S12xA)的編碼基因的 克隆載體 pBS-/?o/?Z-S12xA 和表達(dá)載體 pPROEX-/7〇/?Z-S12xA。
[0018] 本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)上述失活形式NopL重組蛋白（NopL_S12xA)的方法，包 括將含有失活形式NopL重組蛋白（NopL-S12xA)編碼基因的表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，表 達(dá)得到失活形式NopL重組蛋白（NopL-S12xA)，步驟如下： 51. 人工合成一段314bp的DNA片段，核苷酸序列如SEQ ID N0 :3所示； 52. 通過feoRV-如cl酶切位點(diǎn)將人工設(shè)計(jì)合成的314 bp的DNA片段連入載體 pBS-/?o/?Z (Zhang eiaA, 2011)，得到重組載體 所述pBS-/?o/?Z是本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的包含基因全長(zhǎng)的pBluescript載體；此步驟的 目的是要用合成的帶有5個(gè)點(diǎn)突變位點(diǎn)的314 bp片段置換野生型/70/7Z的對(duì)應(yīng)區(qū)域； 53. 以重組載體為模板，SEQ ID N0:4?15所示序列為引物，逐個(gè)進(jìn)行PCR 點(diǎn)突變，得到重組質(zhì)粒pBS-/7〇/7Z-S12xA ; 54. 以重組質(zhì)粒pBS-/?〇M-S12xA為模板，SEQ ID勵(lì)：16?17所示序列為引物，進(jìn)行卩0? 反應(yīng)；PCR產(chǎn)物經(jīng)內(nèi)切酶和及?HI雙酶切后，連接到用同樣酶雙酶切的pPROEX表達(dá)載 體，得到重組表達(dá)載體pPR0EX-/?〇M-S12xA ; 55. 將重組表達(dá)載體pPR0EX-/?〇M-S12xA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21，利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)， 純化即得失活形式NopL重組蛋白（NopL-S12xA)。
[0019] 其中，S3所述逐個(gè)進(jìn)行PCR點(diǎn)突變的方法是依次使用一對(duì)引物進(jìn)行反應(yīng)，得到的 成功突變的產(chǎn)物，用于下一次點(diǎn)突變PCR的模板。
[0020] 另外，細(xì)菌蛋白質(zhì)NopL作為水楊酸誘導(dǎo)的蛋白激酶的直接底物被磷酸化從而抑 制根瘤細(xì)胞的早衰，這一機(jī)制在研究豆科植物與根瘤菌互作機(jī)制上的應(yīng)用也在本發(fā)明的范 圍內(nèi)。
[0021] 本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過前期工作研究，推測(cè)NopL可以干擾MAPK途徑，來影響根瘤菌與植物 的共生作用，但是對(duì)于這一推測(cè)是否正確還沒有進(jìn)一步驗(yàn)證和研究，而且NopL具體是如何 干擾MAPK途徑來實(shí)現(xiàn)影響根瘤菌與植物的共生的作用的，其具體機(jī)制是什么，更是一項(xiàng)空 白。促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK)是一類存在于各 種真核生物體中的絲氨酸/蘇氨酸型蛋白激酶，它與其它一些信號(hào)分子組成MAPK級(jí)聯(lián)信號(hào) 通路，接受外界刺激信號(hào)，并將信號(hào)傳入細(xì)胞內(nèi)，影響特定基因的表達(dá)，從而在真核生物的 生長(zhǎng)、發(fā)育、分化和凋亡等多方面起著重要的作用。體內(nèi)MAPK途徑是極其復(fù)雜的，MAPK家 族成員眾多，他們分別能與不同的上游信號(hào)分子和下游效應(yīng)分子組合，形成各種細(xì)胞內(nèi)信 號(hào)通路。MAPK級(jí)聯(lián)通路中底物的特異性各異，且各自具有一定的獨(dú)立性，同時(shí)又能在多個(gè)水 平上相互交聯(lián)，這樣被各異的生物和非生物的刺激所引起的信號(hào)傳導(dǎo)途徑在某個(gè)MAPK上 相互聯(lián)系起來，形成一個(gè)錯(cuò)綜復(fù)雜的信號(hào)傳遞網(wǎng)絡(luò)。因而這些不同的信號(hào)傳遞途徑是在哪 一步整合起來的，調(diào)節(jié)機(jī)制是怎樣的，都是仍待研究的內(nèi)容。另外由于在生物體中還存在有 各種其他激酶與MAPK的性質(zhì)相似，因此，目前來說，究竟NopL是否可以干擾MAPK途徑，來 影響根瘤菌與植物的共生作用，以及其具體機(jī)制是什么的研究仍然是一個(gè)技術(shù)難題。
[0022] 為了驗(yàn)證NopL能夠干擾MAPK途徑進(jìn)而抑制根瘤細(xì)胞早衰這一結(jié)論，并研究其具 體的調(diào)節(jié)機(jī)制，本發(fā)明人通過大量的研究和探索，首次發(fā)現(xiàn)NopL可以直接作為真核細(xì)胞 中MAPK的底物，并且發(fā)現(xiàn)該MAPK就是水楊酸誘導(dǎo)的蛋白激酶（salicylic acid-induced protein kinase, SIPK)，NopL通過被MAPK直接磷酸化，進(jìn)而發(fā)揮在與豆科植物互作時(shí)促進(jìn) 共生固氮的作用。在研究過程中，發(fā)明人克服了一系列的技術(shù)難題，其中最大的研究難題在 于如何克服體內(nèi)MAPK途徑的復(fù)雜性和多樣性，并進(jìn)一步確定NopL是直接作為真核細(xì)胞內(nèi) SIPK蛋白激酶的底物，被MAPK磷酸化，進(jìn)而發(fā)揮促進(jìn)根瘤細(xì)胞早衰的作用的。為了達(dá)到上 述目的，需要以大腸桿菌為宿主，在體外表達(dá)純化SIPK和MEK2 DD這兩種真核細(xì)胞中的蛋白 激酶。植物蛋白激酶在原核細(xì)胞(如大腸桿菌細(xì)胞）里純化出來往往是沒有活性的，因?yàn)樗?們是真核生物里的蛋白，翻譯時(shí)使用的編碼氨基酸密碼子、mRNA、tRNA等都是來源于真核 細(xì)胞里的一套蛋白質(zhì)表達(dá)翻譯系統(tǒng)，而到了原核生物體內(nèi)，氨基酸密碼子發(fā)生變化，缺少了 真核生物里那套稀有密碼子，很可能最后在大腸桿菌里表達(dá)出的蛋白質(zhì)是一個(gè)沒有活性的 蛋白質(zhì)，或者水溶性很差，或者只是表達(dá)了其中的一個(gè)肽段，這樣的蛋白根本不能在體外完 成磷酸化實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明人嘗試在MEK2 DD上連接HIS6標(biāo)簽，以此標(biāo)簽純化融合蛋白，但是實(shí) 驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這樣表達(dá)出來的MEK2 DD激酶蛋白活性是不穩(wěn)定的，很容易失活，導(dǎo)致整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù) 性很差，所得到結(jié)果數(shù)據(jù)不能令人信服。為了克服上述難題，本發(fā)明人嘗試使用GST標(biāo)簽來 融合表達(dá)SIPK和MEK2 DD并通過標(biāo)簽體外純化。因?yàn)榇髽?biāo)簽往往能增加整個(gè)融合蛋白的水 溶性和穩(wěn)定性，有利于獲得有功能、并且活性穩(wěn)定的激酶蛋白。經(jīng)過大量的探索和研究，并 通過大量的重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明我們成功獲得了兩種穩(wěn)定性和活性都很好的功能性激 酶蛋白，并利用這兩種具有活性的蛋白完成了體外的磷酸化實(shí)驗(yàn)，直接證明了 NopL而不是 NopL-S12xA能夠直接被SIPK磷酸化。同時(shí)，還通過Pull-down和雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，表 明了 SIPK與NopL在體內(nèi)和體外都存在相互作用的關(guān)系。
[0023] 另外，本發(fā)明還通過結(jié)瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)NopL的磷酸化位點(diǎn)突變后，突變體 NopL-S12xA無法作為SIPK的底物，在結(jié)瘤實(shí)驗(yàn)中表達(dá)NopL-S12xA蛋白的根瘤菌突變體相 比起野生型根瘤菌，誘導(dǎo)產(chǎn)生的根瘤中含有大量的壞死面積，也即大量根瘤細(xì)胞出現(xiàn)早衰。 說明NopL-S12xA突變體蛋白基本喪失了抑制根瘤細(xì)胞早衰的能力，從而無法促進(jìn)共生，表 明NopL抑制根瘤細(xì)胞早衰的作用是磷酸化依賴的，NopL是通過作為MAPK的直接底物，被 MAPK磷酸化，進(jìn)而發(fā)揮其抑制根瘤細(xì)胞早衰來促進(jìn)共生的作用的。該發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究豆 科植物與根瘤菌互作機(jī)制提供了新的理論與實(shí)踐基礎(chǔ)。
[0024] 本發(fā)明具有以下有益效果： 本發(fā)明提供了一種磷酸化的細(xì)菌蛋白質(zhì)NopL的應(yīng)用，具體是指在促進(jìn)根瘤菌與豆科 植物共生中的應(yīng)用。本發(fā)明以大腸桿菌這一原核細(xì)胞作為宿主，通過在體外表達(dá)純化NopL 及其突變體，以及真核細(xì)胞中的兩種蛋白激酶SIPK和MEK2DD的融合蛋白形式，通過標(biāo)簽體 外純化，成功獲得兩種功能性的激酶蛋白，并利用這兩種具有活性的蛋白完成了體外的磷 酸化實(shí)驗(yàn)，直接證明了 NopL而不是NopL-S12xA能夠直接被SIPK磷酸化，這是首次發(fā)現(xiàn)的 一個(gè)能夠直接作為促分裂原活化蛋白激酶底物的細(xì)菌蛋白。也是細(xì)菌蛋白NopL在真核細(xì) 胞中的作用新機(jī)制，即NopL直接作為真核細(xì)胞內(nèi)SIPK的底物，被MAPK磷酸化，從而在根瘤 菌與豆科植物互作的過程中抑制根瘤細(xì)胞早衰、促進(jìn)共生固氮。
[0025] 結(jié)瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)NopL的磷酸化位點(diǎn)突變后，突變體NopL-S12xA無法作為蛋白激 酶MAPK的底物，在結(jié)瘤實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)為基本喪失了抑制根瘤細(xì)胞早衰的能力，即喪失了其原 本在與豆科植物共生過程中發(fā)揮的促進(jìn)共生作用。說明了 NopL這種促進(jìn)根瘤菌與寄主共 生的功能是磷酸化依賴的。該發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究豆科植物與根瘤菌互作機(jī)制提供了新的理 論與實(shí)踐基礎(chǔ)，提供了新的研究方向，具備極高的理論與實(shí)踐價(jià)值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 圖1為重組基因/70/7Z-S12xA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖；1為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)品，2 為/7〇M_S12xA，大小為 1017 bp。
[0027] 圖2為重組蛋白NopL_S12xA的SDS-PAGE檢測(cè)圖；1為標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品，2為純化后 的重組蛋白NopL-S12xA，大小為37 kD。 圖3為重組蛋白NopL-S12xA的Western blot檢測(cè)圖；1為標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品，2為純化后 的 NopL-S12xA，大小為 37 kD。
[0028] 圖4為使用[γ _32P] ATP進(jìn)行體外磷酸化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
[0029] 圖5為根瘤菌野生型NGR234、NGR 和突變型NGR Q/7〇M-/7〇M-S12xA與宿主 菜豆（cv. Tendergreen)共生互作后收獲的成熟根瘤的剖面圖。
[0030] 圖6為使用軟件Image J計(jì)算出分別由根瘤菌野生型NGR234、NGRQfloM和突 變型NGR Ω/70/7Z-/70/7Z-s 12xA誘導(dǎo)產(chǎn)生的根瘤剖面中壞死面積占整個(gè)侵染面積的百分?jǐn)?shù)柱 形圖。柱子上的星號(hào)表示相比于野生型根瘤菌誘導(dǎo)產(chǎn)生的根瘤內(nèi)壞死面積百分?jǐn)?shù)而言，由 兩個(gè)突變體根瘤菌誘導(dǎo)產(chǎn)生的根瘤中壞死百分?jǐn)?shù)具有顯著地差異（Kruskal - Wallis計(jì)算 法，Ρ〈0· 00001)。
[0031] 圖7為NopL-S12xA的12個(gè)點(diǎn)突變位置示意圖；每一行末尾處標(biāo)注的數(shù)字代表該 行最末一個(gè)氨基酸的編號(hào)，即是位于第幾個(gè)氨基酸，紅色字母頭頂標(biāo)的數(shù)字也為該氨基酸 的編號(hào)；圖中紅色粗體標(biāo)注的絲氨酸"S"為NopL-S12xA氨基酸序列中發(fā)生點(diǎn)突變的位置。
[0032] 圖 8 為 SIPK 與 NopL 的 Pull-down 實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0033] 圖9為SIPK與NopL雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0034] 以下結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明 做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本【技術(shù)領(lǐng)域】常規(guī)試 齊[J、方法和設(shè)備。
[0035] 除非特別說明，以下實(shí)施例中所采用的試劑和材料均為市購。
[0036] 以下實(shí)施例中所采用的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，包括PCR擴(kuò)增、質(zhì)粒提取、質(zhì)粒轉(zhuǎn) 化、DNA片段連接、酶切、凝膠電泳等，如無特殊說明，通常按照常規(guī)方法操作，具體可參見 《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》（第三版）（Sambrook J，Russell DW，Janssen K，Argentine J.黃培 堂等譯，2002,北京：科學(xué)出版社)，或按照試劑或儀器制造廠商所建議的條件。
[0037] 實(shí)施例1構(gòu)建重組質(zhì)粒pBS-/7〇/?Z_S12xA 1、本實(shí)施例利用人工合成DNA片段以及PCR進(jìn)行定點(diǎn)突變的方法，構(gòu)建重組質(zhì)粒 pBS-/?〇M-S12xA。首先合成突變的重組基因/?〇M-S12xA，重組蛋白NopL-S12xA中包含12 個(gè)突變的磷酸化位點(diǎn)，均是由絲氨酸（Serine)突變成丙氨酸(Alanine)的點(diǎn)突變。這12 個(gè)突變位點(diǎn)分別是：S7A/S12A/S17A/S36A/S7 3A/S89A/S139A/S148A/S187A/S198A/S240A/ S245A。
[0038] 2、上述12個(gè)突變位點(diǎn)中，N端的5個(gè)點(diǎn)突變S7A/S12A/S17A/S36A/S89A是通過人 工合成核苷酸片段的方法突變完成的，人工合成的DNA片段序列（314 bp)如SEQ ID N0 :3 所示，其兩端含有酶切位點(diǎn)，可進(jìn)行進(jìn)一步的分子克隆。
[0039] 3、其余7個(gè)點(diǎn)突變均通過PCR完成 (1) PCR完成各點(diǎn)突變使用的引物序列如下： S73A-F :(如 SEQ ID N0 :4 所示） 5' -CATATCCTTATCCAGCACCTTGTGAATGG-3'， S73A-R :(如 SEQ ID N0 :5 所示） 5' -CCATTCACAAGGTGCTGGATAAGGATATG-3'。
[0040] S139A-F:(如 SEQ ID N0 :6 所示） TCGCAAGCCGGGCTAGCCCCGTCCGCCACCC, S139A-R:(如 SEQ ID N0 :7 所示） GGGTGGCGGACGGGGCTAGCCCGGCTTGCGA。
[0041] S148A-F:(如 SEQ ID N0 :8 所示） ACCCCACTGAACCCAGCCCCACCGCCGCATGC, S148A-R:(如 SEQ ID N0 :9 所示） GCATGCGGCGGTGGGGCTGGGTTCAGTGGGGT〇
[0042] S187A-F:(如 SEQ ID NO :10 所示） ACGCGGGCTACAGCTGCTCCCGCGCCACTGA, S187A-R:(如 SEQ ID NO :11 所示） TCAGTGGCGCGGGAGCAGCTGTAGCCCGCGT。
[0043] S198A-F:(如 SEQ ID NO :12 所示） GCTGAGAGGGGAAGGGCTCCCCAGCCTAGCG, S198A-R:^nSEQIDN0:13K*) CGCTAGGCTGGGGAGCCCTTCCCCTCTCAGC。
[0044] S240A/S245A-F:(如 SEQ ID NO :14 所示） CAGGTGGGACCAGCACACTCTGGACCGGCGCAAGCCCGG, S240A/S245A-R:^nSEQIDN0:15K*) CCGGGCTTGCGCCGGTCCAGAGTGTGCTGGTCCCACCTG。
[0045] (2)構(gòu)建重組載體 pBS-/?〇M5" 通過feoRV-AscI酶切位點(diǎn)將人工設(shè)計(jì)合成的314 bp的DNA片段連入載體pBS-/7〇/7Z (Zhang ei a人，2011)。人工設(shè)計(jì)合成的314 bp的DNA片段兩端含有feoRV-AscI酶切位 點(diǎn)，將其與用同樣的內(nèi)切酶酶切的載體pBS-/7〇/7Z進(jìn)行連接，酶切條件為37°C酶 切3h。
[0046] 取1〇μ?連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5 α，并將轉(zhuǎn)化后的菌懸液涂布于含有氨芐青 霉素（lOOKg/mL)的LB固體培養(yǎng)基表面，37°C培養(yǎng)12?16h。隨機(jī)挑取6株單菌落接種到 3mL含有氨芐青霉素（lOOPg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。將菌液離心后提取質(zhì)粒做酶 切檢測(cè)，并交測(cè)序驗(yàn)證。酶切和測(cè)序驗(yàn)證均為陽性的重組質(zhì)粒即為重組載體PBS-/70/7Z#。
[0047] (3)點(diǎn)突變 PCR 以得到的重組載體PBS-/70/7ZW為PCR模板，逐個(gè)進(jìn)行點(diǎn)突變(方法為依次使用一對(duì)引 物進(jìn)行反應(yīng)，得到的成功突變的產(chǎn)物，將用于下一次點(diǎn)突變PCR的模板以進(jìn)行下一個(gè)點(diǎn)突 變反應(yīng))，PCR的反應(yīng)體系（總體積5〇μυ如下所示： 模板（50 ng) ?μ? dNTP Mix (2. 5 mM) 4μ? 引物 F (10 μΜ) lμ? 引物 R (10 μΜ) Iμ? Fast Pfu (2· 5 U/μ? ?μ? 5 XFast Pfu reaction buffer 10M-L dd H20 32μ?。
[0048] 上述 PCR 反應(yīng)條件為：95°C 5min ;95°C 30s，55°C 90s，72°C 4 min，12 次循環(huán)； 72。。 10min。
[0049] 通過上述PCR，使用不同的引物重復(fù)此過程，最終獲得含有失活形式的重組蛋白 NopL_S12xA編碼序列的重組質(zhì)粒pBS-/?o/?Z-S12xA。
[0050] 實(shí)施例2構(gòu)建重組表達(dá)載體pPR0EX-/?〇M-S12xA 本實(shí)施例目的是將基因片段/?〇/^-S12xA克隆至pPROEX表達(dá)載體中。
[0051] 首先設(shè)計(jì)引物NopL-S12xA-F和NopL-S12xA-R，并在引物兩端引入紐el和 酶切位點(diǎn)(劃線部分)，以方便其插入PPR0EX載體。
[0052] 引物序列如下： NopL-S12xA-F :(如 SEQ ID N0 :16 所示） 5' -CGGGGCGCC ATGGATATCAATTCAACCGC-3' ； NopL-S12xA-R :(如 SEQ ID N0 :17 所示） 5, -GCGGATCC TCAAATGTCAAAATCCACCG-3，。
[0053] 以pBS-/7〇M-S12xA為模板，利用上述引物進(jìn)行外源片段的PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)體 系（總體積5〇μυ如下所示： 模板（50 ng) ?μ? dNTP Mix (2. 5 mM) 4μ? 引物 F (10 μΜ) lμ? 引物 R(l〇PM) Iμ? PrimerStar DNA Polymerase (2. 5 U/M-L) 1M-L 5 XPrimerStar reaction buffer 10M-L dd H20 32μ?。
[0054] 上述 PCR 反應(yīng)條件為：94°C 5min ;95°C 30s，55°C 30s，72°C lmin，32 個(gè)循環(huán)； 72。。 lOmin。
[0055] PCR反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行電泳檢測(cè)，如附圖1所示，目的產(chǎn)物是一條1017bp的片段。利 用TIANGEN的膠回收試劑盒回收1017 bp的PCR產(chǎn)物，提交測(cè)序，得到/7〇M-S12xA的基因 序列如SEQ ID NO: 1所示，其所編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。突變位點(diǎn)如附圖 7所示，圖中紅色粗體標(biāo)注的絲氨酸"S"為NopL-S12xA氨基酸序列中發(fā)生點(diǎn)突變的位置； NopL-S12xA與NopL的區(qū)別在于以下紅色"S"部分都被點(diǎn)突變成了丙氨酸（A)。
[0056] 同時(shí)，PCR產(chǎn)物用內(nèi)切酶勱el和漢·ΗΙ于37°C雙酶切3 h，與同樣用勱el和fe?HI 雙酶切的PPR0EX表達(dá)載體連接，得到重組表達(dá)載體pPR0EX-/?〇M-S12xA。
[0057] 取1〇μ?連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α并將轉(zhuǎn)化后的菌懸液涂布于含有氨芐青霉 素（lOOPg/mL)的LB固體培養(yǎng)基表面，37°C培養(yǎng)12?16h后隨機(jī)挑取6株單菌落接種到3mL 含有氨芐青霉素（lOOKg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。將菌液離心后提取質(zhì)粒做雙酶 切檢測(cè)，并交測(cè)序驗(yàn)證。
[0058] 取5μ?酶切和測(cè)序檢測(cè)都正確的重組表達(dá)質(zhì)粒pPR0EX-/?〇M-S12xA，轉(zhuǎn)化 表達(dá)型大腸桿菌BL21 (DE3)，同樣按照上述方法篩選出含有重組質(zhì)粒的宿主菌BL21 (DE3-/?〇M-S12xA)。
[0059] 實(shí)施例3重組蛋白NopL_S12xA的誘導(dǎo)表達(dá)及純化 1、重組蛋白NopL-S12xA的誘導(dǎo)表達(dá) 將重組后的工程菌BL21 (DE3-/7〇M-S12xA)劃線到含有氨芐青霉素（5(^g/mL)的LB固 體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)12?16h。
[0060] 隨機(jī)挑出一個(gè)單菌落接種到3mL含有氨芐青霉素（5(^g/mL)的LB液體培養(yǎng)基中， 37°C、220rpm 震蕩培養(yǎng) 12h。
[0061] 培養(yǎng)好的菌液按1:100的比例接種到300mL含有氨芐青霉素（5(^g/mL)的LB液體 培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)至0D 6QQ= 0.6 (大約3h)時(shí)，加入IPTG至終濃度為ImM，繼續(xù)37°C、 220rpm條件下震蕩培養(yǎng)20h。
[0062] 2、重組蛋白NopL_S12xA的純化回收 上述經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)后的菌液于5500g條件下離心5min，棄去上清液，將收集的菌體重 懸于預(yù)冷的10mL的裂解緩沖液（50mM磷酸二氫鉀，1M氯化鈉，10mM咪唑）中。用超聲波破 碎儀（MIS0NIX)破碎細(xì)胞后，15000g離心20min，收集的上清液即為含重組蛋白的粗制液。 此粗提物再用Ni-NTA樹脂凝膠柱（Qiagen)純化，具體步驟可以參見產(chǎn)品說明書。
[0063] 3、重組蛋白 NopL-S12xA 的 SDS-PAGE 分析 獲得純化后的重組蛋白NopL-S12xA用SDS-PAGE (12%)電泳分析，如附圖2所示，表明 此重組蛋白可以在大腸桿菌體內(nèi)大量表達(dá)并能夠用親和層析進(jìn)行純化。
[0064] 實(shí)施例4重組蛋白NopL_S12xA的Western blot檢測(cè) 本實(shí)施例對(duì)純化的重組蛋白NopL-S12xA進(jìn)行Western blot檢測(cè)分析，方法參照常規(guī) 的 Western blot 操作。
[0065] 將上述純化的重組蛋白NopL-S12xA樣品使用12% SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離，隨后 電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上。使用封閉液封閉NC膜60min。
[0066] 所用一抗是由大腸桿菌BL21 (DE3)表達(dá)純化的NopL蛋白免疫兔子后，取兔子血 清分離而來。二抗為羊抗兔抗體。
[0067] 一抗用封閉液(含5%質(zhì)量比脫脂奶粉的TBST緩沖液）進(jìn)行稀釋后，與NC膜溫育 lh，使用TBST緩沖液（50mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，pH7. 5、150mM的氯化鈉，和0. 05% 的吐溫-20)洗去一抗。再加入封閉液稀釋的二抗，溫育lh，再用TBST洗去二抗。最后使用 3, 3' -diamino-benzidine (DAB)進(jìn)行顯色，結(jié)果如附圖3所示，與SDS-PAGE結(jié)果一致，成 功構(gòu)建了能夠表達(dá)重組蛋白NopL-S12xA的重組工程菌BL21 (DE3-/?〇M-S12xA)，并能夠用 親和層析進(jìn)行純化。
[0068] 實(shí)施例5 NopL體外磷酸化實(shí)驗(yàn) 本實(shí)施例通過體外磷酸化實(shí)驗(yàn)證明蛋白NopL是有絲分裂原活化蛋白激酶的直接底 物。
[0069] 1、材料 (1)反應(yīng)所需的兩個(gè)激酶為His6-SIPK和NtMEK2DD-His6 (可作為SIPK的上一級(jí)激酶用 以激活SIPK)。
[0070] His6_SIPK即水楊酸誘導(dǎo)的蛋白激酶，來源于煙草的有絲分裂原活化的蛋白激酶。 NtMEK2 DD-His6可作為SIPK的上一級(jí)激酶用以激活SIPK，煙草中的MAPKK。
[0071] 所述兩個(gè)激酶是以大腸桿菌這一原核細(xì)胞作為宿主,表達(dá)真核細(xì)胞中的兩種蛋白 激酶SIPK和MEK2 DD的融合蛋白形式，并通過標(biāo)簽體外純化獲得的。
[0072] (2)反應(yīng)所需的底物蛋白為：NopL蛋白和突變體NopL-S12xA蛋白，是在大腸桿菌 中表達(dá)純化獲得。
[0073] (3)從大腸桿菌里表達(dá)純化重組蛋白（上述激酶和底物蛋白）的具體方法如下： S1.首先將含有目的基因的重組表達(dá)載體(常常是含有GST或His6等標(biāo)簽的表達(dá)載體） 轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21菌株中，細(xì)菌細(xì)胞在Luria-Bertani (LB)培養(yǎng)基（10g/L酵母提取粉， 5g/L氯化鈉，10g/L胰蛋白胨）中37°C過夜培養(yǎng)。
[0074] S2.隨后轉(zhuǎn)移入100倍體積的LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，并當(dāng)0D_達(dá)到0. 6時(shí)，于其 中加入異丙基-β -D-硫代半乳糖苷（IPTG)在25°C中過夜培養(yǎng)。
[0075] S3.將大腸桿菌細(xì)胞離心收集后重懸于預(yù)冷的裂解緩沖液（50mM磷酸二氫鈉， 300mM氯化鈉，10mM咪唑，并用氫氧化鈉調(diào)pH值8. 0 ),使用裂解酶裂解40分鐘后，再使用超 聲破碎此重懸物，并離心收集上清液體。
[0076] S4.使用鎳-次氮基三乙酸親和色譜法（QIAgenes凡Handbook ;Qiagen, Hilden,Germany),通過力口入 GST-binding resin (glutathione agarose beads ；Novagen, USA)或是Ni-NTA magnetic agarose beads來進(jìn)行標(biāo)簽蛋白的純化。
[0077] S5.使用 Amicon Microcon concentratorCThe Amicon Ultra-〇. 5 centrifugal concentrator，YM-10, Millipore，Bedford，MA，USA)對(duì)純化后的洗脫液進(jìn)行濃縮。
[0078] S6.隨后若是進(jìn)行磷酸化實(shí)驗(yàn)，使用磷酸化反應(yīng)緩沖液（20mM羥乙基哌嗪乙硫磺 酸-氫氧化鉀，pH 7. 6, ImM二硫蘇糖醇，10mM氯化鎂）洗滌蛋白兩次； 若是進(jìn)行pull-down分析，使用磷酸鹽緩沖液（PBS)(137mM氯化鈉，2. 7mM氯化鉀，10mM 磷酸氫二鈉，使用NaOH調(diào)節(jié)pH至7. 4)將蛋白洗滌兩次。
[0079] 純化GST標(biāo)簽蛋白與純化His標(biāo)簽蛋白方法相冋，區(qū)別僅在于純化GST標(biāo)簽蛋白 時(shí)使用的裂解緩沖液是PBS緩沖液，洗脫緩沖液是：50mM三異丙基乙磺酰(鹽酸調(diào)節(jié)其pH 至8.0)，10mM還原性谷胱甘肽。
[0080] 2、將兩個(gè)激酶His6-SIPK和NtMEK2DD-His 6與底物NopL蛋白或突變體NopL-S12xA 分別依次加入磷酸化緩沖液(配方為20mM羥乙基哌嗪乙硫磺酸-氫氧化鉀；pH 7. 6, ImM二 硫蘇糖醇；10mM氯化鎂；50mM三磷酸腺苷；50MCi/mL [γ-32Ρ]三磷酸腺苷)中，在30°C中反 應(yīng) 30min。
[0081] 將磷酸化反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，分離后的蛋白膠經(jīng)過磷屏曝光 后，使用臺(tái)風(fēng)掃描儀（Typhoon 9410 variable Mode Imager, GE Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)掃描磷屏上的信號(hào)進(jìn)行放射自顯影。
[0082] 3、結(jié)果發(fā)現(xiàn)NopL樣品組在NopL (37 kD)對(duì)應(yīng)位置(如附圖4所示）出現(xiàn)條帶，而 NopL-S12xA對(duì)照組則無(如附圖4所示)。
[0083] 結(jié)果說明了野生型NopL蛋白可以被真核細(xì)胞中的有絲分裂原活化的蛋白激酶 所磷酸化并作為其直接底物，然而失去了 12個(gè)磷酸化位點(diǎn)的突變體NopL-S12xA不能被 磷酸化，證明了 NopL可以直接作為真核細(xì)胞中有絲分裂原活化的蛋白激酶的底物，而 NopL_S12xA 則不能。
[0084] 實(shí)施例6 Pull-down實(shí)驗(yàn)研究NopL與SIPK的相互作用 1、方法 51. 將 100 μ g 的 GST-NopL(或 GST-NopL-S12xA)、43 μ g 的 GST 和 141 μ g 的 His6-SIPK 溶于100 μ L PBS緩沖液中，4°C孵育2h ; 52. 加入800 μ L PBS緩沖液和100 μ L谷胱甘肽瓊脂糖珠子，將整個(gè)混合物的體積擴(kuò) 充至lmL，繼續(xù)4°C孵育lh ; 53. 通過100 xgX 10 s的離心條件收集珠子，并用10倍的PBS緩沖液（137 mM氯化 鈉，2. 7 mM氯化鉀，10 mM磷酸氫二鉀，使用NaOH將pH值調(diào)至7. 4)洗滌珠子； 54. 在洗滌后的珠子(約剩余30 yL的緩沖液)中加入7yL的5XSDS(Sodium dodecyl sulfate，十二烷基硫酸鈉）上樣緩沖液[250mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（pH 6.8),10% (w/v) SDS，50% (v/v)甘油，0.5% (w/v)溴酚藍(lán)，5% (v/v) 2-巰基乙醇]，95°C加熱樣品 5 min ； 55. 使用抗 His6 的抗體（Roche，Basel，Switzerland ; 1 :2000 稀釋比）通過 Western 雜 交分析蛋白樣品(按照本領(lǐng)域常規(guī)的Western操作方法進(jìn)行)。
[0085] 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果如附圖8所示，通過Pull-down實(shí)驗(yàn)的分析，驗(yàn)證了 SIPK和NopL在體 外能相互作用，而NopL-S12xA不能與SIPK相互作用。
[0086] 實(shí)施例7雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)研究NopL與SIPK的體內(nèi)相互作用 1、由于SIPK是煙草葉片中的一種MAPK，而且煙草葉片中天然存在的激酶遠(yuǎn)遠(yuǎn)不止 SIPK -種，所以根本無法設(shè)計(jì)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來證明NopL在煙草葉片細(xì)胞中被磷酸化（Bartsev ei a人，2004; Zhang ei a人，2010)是單純因?yàn)楸籗IPK磷酸化引起的。為了克服單純體 外磷酸化實(shí)驗(yàn)不足以說明在體內(nèi)NopL -定是被SIPK所磷酸化的缺陷，本發(fā)明人還設(shè)計(jì)了 雙分子突光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)（Bimolecular fluorescent complementation，BiFC)來分析 NopL 與 SIPK體內(nèi)的相互作用，表明了 SIPK與NopL在體內(nèi)和體外都存在相互作用的關(guān)系。
[0087] 2、雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)的方法如下： S1.構(gòu)建重組質(zhì)粒 pSATl-nEYFP-Nl-/7〇/7Z、pSATl-nEYFP-Nl-/7〇/7Z-S12xA 和 pSATl-cEYFP-NlH 其中，pSATl-nEYFP-Nl 和 pSATl-cEYFP-Nl (Citovsky ei a7·，2006)分別編碼N端 和C端部分的增強(qiáng)型黃色突光蛋白（Enhanced yellow fluorescence protein，EYFP);重 組質(zhì)粒克隆方法為： 511. 對(duì)于pSATl-nEYFP-Nl-/?〇M，使用 SEQ ID N0:19和引物 SEQ ID N0:20所示的序列 為引物，以pBS-/?〇M為模板，PCR擴(kuò)增出基因片段后，使用內(nèi)切酶班/?(111與&ΜΠ 進(jìn)行 雙酶切，連接到使用相同內(nèi)切酶雙酶切的載體口341'1-業(yè)￥---附((：^〇^1^￡^ <^.，2006)， 并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選出成功連接的轉(zhuǎn)化子并獲得重組質(zhì)粒pSATl-nEYFP-Nl-/? 〇/7Z ; 512. 對(duì)于 pSATl-nEYFP-Nl-/7〇M_S12xA，使用 SEQ ID NO :20 和引物 SEQ ID NO : 21所示的序列為引物，以pBS-/?〇M-S12xA為模板，PCR擴(kuò)增出/?〇M-S12xA基因片段 后，使用內(nèi)切酶與進(jìn)行雙酶切，連接到使用相同內(nèi)切酶雙酶切的載體 pSATl-nEYFP-Nl(Citovsky eia乂，2006)，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選出成功連接的轉(zhuǎn)化子并 獲得重組質(zhì)粒 pSATl-nEYFP-Nl-/?o/7Z-S12xA ; 513. 對(duì)于 pSATl-cEYFP-Nl-STiT，使用 SEQ ID NO :22 和引物 SEQ ID NO :23 所示的序 列為引物，以PET-分/況（Zhang e i a乂，2011)為模板，PCR擴(kuò)增出分/況基因片段后，使用 內(nèi)切酶及_7 J與feoRI進(jìn)行雙酶切，連接到使用相同內(nèi)切酶雙酶切的載體pSATl-cEYFP-Nl (Citovsky ei al，2006)，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選出成功連接的轉(zhuǎn)化子并獲得重組質(zhì)粒 pSATl-cEYFP-NlH
[0088] S2. BiFC操作方法，包括質(zhì)粒的準(zhǔn)備，洋蔥細(xì)胞的培養(yǎng)，基因槍轟擊的方法，轟擊后 顯微鏡的觀察等細(xì)節(jié)參見Hollender和Liu (2010)。
[0089] 3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果如附圖 9 所不，DAPI (4，，6 - diamidino - 2 - phenylindole)為細(xì)胞 核染料；YF (yellow fluorescence)為黃色突光；BF (bright field)為明場(chǎng)；Merge 為前三 種場(chǎng)景的疊加。其中，（a)中的箭頭指出了對(duì)應(yīng)細(xì)胞中細(xì)胞核的位置，也即兩種蛋白在細(xì)胞 中互作的地點(diǎn)。標(biāo)尺（a)為50 ym;(b)、（c)和（d)均為300 μπι。
[0090] 結(jié)果顯示，只有（a)組（即SIPK和NopL相互作用組）特異地在細(xì)胞核部位出現(xiàn)熒 光信號(hào)，表明了 SIPK和NopL能在植物細(xì)胞內(nèi)相互作用。
[0091] 實(shí)施例8根瘤細(xì)胞壞死面積檢測(cè) 1、本實(shí)施例使用野生型根瘤菌NGR234、NGR Ω/70/7Ζ (NGR234的/70/7Z突變體）和 NGRQ/?〇/7Z-/?〇/7Z-S12xA (表達(dá)重組蛋白NopL_S12xA的NGR234突變體）與宿主菜豆（cv. Tendergreen)進(jìn)行結(jié)瘤實(shí)驗(yàn)，來研究NopL蛋白是否能夠抑制根瘤細(xì)胞早衰及其具體機(jī)制。
[0092] 所述的野生型根瘤菌NGR234為本實(shí)驗(yàn)室保存。
[0093] 突變型根瘤菌NGRQ/?〇M即NGR234的突變體，參考Zhang ei a人，2010。
[0094] 突變型根瘤菌NGRQ/7〇M-/7〇M-S12xA即表達(dá)重組蛋白NopL-S12xA的NGR234突 變體，突變體NGRQ/7〇/7Z-/7〇/7Z-S12xA的構(gòu)建方法如下： 51. 構(gòu)建pBS-p/?〇M-/?〇M-S12xA :以 pBS-/7〇M_S12xA 為模板，以 SEQ ID N0 :15 和 SEQ ID N0 :18所示序列為引物擴(kuò)增/7〇M-S12xA基因片段； 52. 將/?〇M-S12xA 基因片段克隆入 pBS-p/?〇M (Zhang et al·，2011)，獲得重組質(zhì) 粒 pBS-p/?o/7Z-/?o/7Z-S12xA ;得到的 pBS-p/?o/7Z-/?o/7Z-S12xA 是 pBluescript 的一個(gè)衍生物， 它含有NopL的258-bp的啟動(dòng)子序列（Zhang ei a人，2011)和NopL_S12xA的編碼序列； 53. 通過限制性內(nèi)切酶從 pHP45W(Prentki and Krisch, 1984)中切下 QSpe 基 因片段，連入 pBS-p/?o/7Z-/?o/7Z-S12xA 中的 位點(diǎn)，得到 pBS-p/?o/7Z-/?o/7Z-S12xA-Q ; 54. 使用油al內(nèi)切酶從pBS-p/?〇M-/?〇M-S12xA-Q中將含有NopL啟動(dòng)子、NopL-S12xA 編碼區(qū)域和QSpe序列的整個(gè)大片段切下，連入自殺載體pJQ-j^?V(Liang MT，2012)的油<31 酶切位點(diǎn)中，得到 pJQ-j^z/V-p/7〇Mi〇M_S12xA-Q ; 55. 最后通過三親本雜交（Figurski and Helinski，1979)，將得到的 Ρ^__7^?/ν-ρ/?〇Μ_β〇Μ_δ12χΑ-Ω 質(zhì)粒轉(zhuǎn)入突變株 NGR Ω/7〇/7Ζ (Zhang et al.，2011)，使其 發(fā)生重組雙交換進(jìn)行突變； 56. 由S5得到的克隆通過提取其基因組，進(jìn)行PCR驗(yàn)證，以及Western雜交等檢測(cè)手段 確認(rèn)為成功的根瘤菌突變體NGR Ω -/7〇/?Z-S12xA。
[0095] 2、結(jié)瘤實(shí)驗(yàn)具體操作如下： 51. 將菜豆（cv. Tendergreen)的種子使用濃硫酸浸泡10 min進(jìn)行表面消毒后，使用 已滅菌的雙蒸水洗去表面殘留的硫酸，并將種子在雙蒸水中浸泡過夜； 52. 將種子轉(zhuǎn)移入瓊脂糖平皿中，并在暗處萌發(fā)（24±2°C); 53. 種子萌發(fā)后，將它們轉(zhuǎn)移入無色透明的塑料罐子中繼續(xù)培養(yǎng)（24±2°C，16/8h的光 暗周期)，罐子里放置有以3 :1的體積比混合的蛭石和陶粒；該塑料罐子下方還有一個(gè)用棉 繩連在一起的另一個(gè)同樣的罐子，里面放置不含氮源的B&D營(yíng)養(yǎng)液； 所述不含氮源的B&D營(yíng)養(yǎng)液配方為ImM氯化鈣，0.5mM磷酸二氫鉀，1〇μΜ檸檬酸鐵， 0. 25mM硫酸鎂，0. 25mM硫酸鉀，?μΜ硫酸錳，2μΜ硼酸，0. 5μΜ硫酸鋅，0. 2μΜ硫酸銅，0. ?μΜ 硫酸鈷，〇. ιμΜ鑰酸鈉； 54. 5d后，分別用ΤΥ液體培養(yǎng)基接種根瘤菌野生型NGR234、突變型NGR Ω/70/7Ζ和 待根瘤菌生長(zhǎng)飽和后離心收集菌體，并使用10 mM硫酸鎂重懸菌 體至0D6(?值為0. 2,得到三種重懸液； 所述TY液體培養(yǎng)基的配方為5g/L蛋白胨，3g/L酵母提取粉，0. 4g/L氯化鈣； 55. 分別取上述三種重懸液2mL接種到每一盆菜豆植物根上，每一種根瘤菌重懸液接 種10盆植物；菜豆植物在16/8 h的光暗周期下，24 ±2°C的環(huán)境中，培育45d，收獲成熟根 瘤。
[0096] 3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (1)成熟根瘤的剖面圖如附圖5所示，黑褐色部分表示壞死部分。同時(shí)，使用Image J 計(jì)算根瘤截面中壞死面積占總整個(gè)侵染面積的百分?jǐn)?shù)，如附圖6所示，柱子上的星號(hào)表示 相比由野生型根瘤菌誘導(dǎo)產(chǎn)生的根瘤內(nèi)壞死面積百分?jǐn)?shù)而言，由兩個(gè)突變體根瘤菌誘導(dǎo)產(chǎn) 生的根瘤中壞死百分?jǐn)?shù)具有顯著地差異（Kruskal - Wallis計(jì)算法，P〈0. 00001)。
[0097] (2)結(jié)果顯示，相比于野生型根瘤菌NGR234誘導(dǎo)產(chǎn)生的根瘤來說，表達(dá) /?〇M-S12xA的突變型根瘤菌NGRQfloM-floM-SUxA誘導(dǎo)產(chǎn)生的根瘤中出現(xiàn)顯著數(shù)量的壞 死面積(如附圖5和附圖6所示)，說明其在與該豆科植物共生過程中極大喪失了抑制根瘤 細(xì)胞早衰的能力，這也就說明了 NopL的磷酸化位點(diǎn)對(duì)于其在共生過程中正常行使功能是 不可或缺的。
[0098] 綜上所述，本發(fā)明闡述了細(xì)菌蛋白質(zhì)NopL在真核細(xì)胞中作用的新機(jī)制。細(xì)菌蛋 白NopL直接作為真核細(xì)胞內(nèi)促有絲分裂原活化的蛋白激酶MAPK底物而促進(jìn)共生固氮。當(dāng) NopL的磷酸化位點(diǎn)突變后，突變體NopL-S12xA無法作為蛋白激酶MAPK的底物，在結(jié)瘤實(shí)驗(yàn) 中表現(xiàn)為基本喪失了抑制根瘤細(xì)胞早衰的能力，從而無法促進(jìn)共生固氮。該發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步 研究豆科植物與根瘤菌互作機(jī)制提供了新的研究思路，以及新的理論與實(shí)踐基礎(chǔ)。
[0099] 以上實(shí)施例僅為介紹本發(fā)明的優(yōu)選案例，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，在不背離本 發(fā)明精神的范圍內(nèi)所進(jìn)行的任何顯而易見的變化和改進(jìn)，都應(yīng)被視為本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1. 磷酸化的細(xì)菌蛋白質(zhì)NopL在促進(jìn)根瘤菌與植物共生中的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于，所述促進(jìn)根瘤菌與植物共生是指抑制根瘤 細(xì)胞的早衰。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于，所述磷酸化的細(xì)菌蛋白質(zhì)NopL是指被水楊 酸誘導(dǎo)的蛋白激酶所磷酸化的細(xì)菌蛋白質(zhì)NopL。
4. 水楊酸誘導(dǎo)的蛋白激酶的激活劑在制備根瘤細(xì)胞早衰抑制劑的應(yīng)用。
5. 水楊酸誘導(dǎo)的蛋白激酶的激活劑在構(gòu)建抗根瘤細(xì)胞早衰的轉(zhuǎn)基因豆科植物的應(yīng) 用。
6. -種編碼失活形式NopL重組蛋白的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
7. -種失活形式NopL重組蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。
【文檔編號(hào)】C12R1/41GK104151405SQ201410402161
【公開日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年8月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月15日
【發(fā)明者】史德海林·奧斯丁·巴特瑟, 謝致平, 葛盈盈, 相其旺 申請(qǐng)人:中山大學(xué)