專利名稱：構象病的早期診斷的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種通過測定樣本中構象病的標記物(即致病構象體)來診斷或檢測構象病的方法。該方法包括一種增加致病構象體水平的循環(huán)擴增系統(tǒng)。具體地說，這樣一些構象病可以是朊病毒(prion)腦病。
結構的重要性是由于以下事實這些不同疾病都是因潛伏蛋白質(zhì)的構象出現(xiàn)異常轉變而引致的，其特征是引起蛋白質(zhì)聚集和組織沉積。這些構象病的醫(yī)學表現(xiàn)反映這種分子機制。當正常蛋白質(zhì)發(fā)生轉變時，一般很慢，并且在不知不覺之間加劇，但當出現(xiàn)不穩(wěn)定變異型蛋白質(zhì)時，發(fā)病就會很突然。這樣一些構象病的其中兩個著名例子是傳染性海綿腦病和阿滋海默氏癥(Alzheimer dementia)，這是一種有可能摧毀發(fā)達國家保健系統(tǒng)的疾病(評論參見Carrell等人，1997年)。
傳染性海綿腦病(TSE)也稱之朊病毒病，這是一組影響人和動物的神經(jīng)變性的病。人類的克-雅氏病(Creutzfeldt-Jakob Disease，CJD)、庫魯病、格-史氏病(Gerstmann-Straussler-Scheiker disease，GSS)和致死性家族性失眠癥(Fatal familialinsomnia，F(xiàn)FI)以及動物的羊瘙癢病和牛海綿腦病(BSE)都是傳染性海綿腦病(Prusiner，1991年)。
雖然這些疾病發(fā)生在人類中相對較罕見，但BSE通過食物鏈傳染給人的危險已引起政府衛(wèi)生當局和科學界的注意(Cousens等人，1997年，Bruce等人，1997年)。
這些疾病的特征是潛伏期特別長，繼而引發(fā)短暫和必定致命的臨床病(Roos等人，1973年)。到目前為止，還未找到治療方法。
這類疾病的主要特征是形成一種稱之PrPSc的畸形蛋白，它是一種正常蛋白質(zhì)經(jīng)翻譯后修飾的變型體，稱之PrPC(Cohen and Prusiner，1998年)。目前還測不到區(qū)別兩種PrP異構體的化學差異(Stahl等人，1993年)，它們之間的轉變好象包括構象的變化，其中正常蛋白質(zhì)的α-螺旋含量減少，而β-折疊含量增加(Pan等人，1993年)。結構改變后，生化性質(zhì)也隨之改變PrPC可溶于非變性去污劑，PrPSc是不溶的；PrPC容易被蛋白酶消化，而PrPSc則為部分抗性，結果形成N末端平截片段，稱為”PrPres”(Baldwin等人，1995年；Cohen和Prusiner，1998年)，或”PrP27-30”(分子量為27-30kDa)或”抗PK”(抗蛋白酶)形式。
目前對TSE還沒有一種準確診斷(世界衛(wèi)生組織報告，1998年；Budlka等人，1995年；Weber等人，1997年)。有人曾經(jīng)嘗試研究一種朊病毒病的診斷試驗，但受制于明顯缺乏對PrPSc的免疫應答?，F(xiàn)在的CJD臨床診斷是基于亞急性進行性癡呆(不到2年)、肌陣攣和多發(fā)性神經(jīng)機能障礙的結合，并借助特征周期性腦電圖(EEG)(世界衛(wèi)生組織報告，1998年；Weber等人，1997年)。然而，變異型CJD(vCJD)、大部分醫(yī)源性CJD以及高達40％的散發(fā)性CJD的腦電圖都沒有異常現(xiàn)象(Steinhoff等人，1996年)。CJD臨床診斷的平均準確率大約為60％，其它與朊病毒相關的疾病可能會高些。只有在疾病晚期當癥狀已變得明顯時，臨床診斷才能更準確(Webber等人，1997年)。
基因分析對遺傳性朊病毒病的診斷是有用的，但這只占病例中的15％。神經(jīng)成像只有在排除由腦結構病變引起的急性進行性癡呆的情況下才有用(Webber等人，1997年)。通過計算機輔助體層成像術(CT)及磁共振成像(MRI)對腦進行成像而獲得的結果主要取決于疾病所處的階段。CT很不敏感，80％的病例在早期均未能診斷出有萎縮(Galvez和Cartier，1983年)。在基底神經(jīng)節(jié)除了檢測到萎縮外，還檢測到MRI高強信號(Onofrji等人，1993年)。用CT也觀察到類似的變化，但這些變化決沒有特異性的。
最近的數(shù)據(jù)已經(jīng)識別出一些在CJD中有所增加的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和膠質(zhì)原蛋白質(zhì)(Jimi等人，1992年)。在疾病早期腦脊液(CSF)中的蛋白質(zhì)S-100、神經(jīng)元特異性同工酶和泛蛋白隨著疾病發(fā)展?jié)舛戎饾u下降而顯著增加(Jimi等人，1992年)。有人提出用神經(jīng)元死亡標記物14-3-3蛋白作為散發(fā)型CJD的特異性和敏感性試驗(Hsich等人，1996年)。然而，它對變異型CJD的診斷卻不適用，對遺傳型CJD的特異性就更少。由于患有其它疾病的病人的腦脊液也可能有14-3-3蛋白，因此世界衛(wèi)生組織不推薦這種試驗作全面篩選CJD，而且對其臨床診斷的確診也有所保留(世界衛(wèi)生組織報告，1998年)。
將臨床數(shù)據(jù)與生化標記物結合在診斷上能獲得更大的成功。但按照現(xiàn)在歐洲CJD監(jiān)測機構所用的手術診斷，只有通過免疫組織化學、組織印跡法或蛋白印跡法來檢查神經(jīng)病理和測定PrPSc才能得到確定性診斷(Weber等人，1997年；Budka等人，1995年)。
PrPSc的形成不僅是引起疾病的最可能原因，而且它也是最好的已知標記物。組織和細胞的PrPSc的測定與疾病及TSE傳染性有很大關聯(lián)，滅活或消除TSE傳染性的處理也會消除PrPsc(Prusiner，1991年)。識別人或動物組織中的PrPSc被認為是診斷TSE的關鍵(世界衛(wèi)生組織報告，1998年)。這種方法的一個主要制約是靈敏度，這是因為只在疾病晚期的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中才有高含量的PrPSc(足以用常規(guī)方法檢測)。然而，業(yè)已證明，疾病早期PrPSc有全身分布(含量低)，特別在淋巴網(wǎng)狀系統(tǒng)中(Aguzzi，1997年)。事實上，已經(jīng)有報道說在變異型CJD病人的腭扁桃體組織和闌尾發(fā)現(xiàn)PrPSc(Hill等人，1997年)。雖然還不確定在變異型CJD診斷中可用到的腭扁桃體組織或闌尾活檢要處于疾病多早的階段，但在對羊瘙癢病基因敏感的綿羊中，已發(fā)現(xiàn)在癥狀前及培養(yǎng)早期的腭扁桃體組織中可檢測到PrPSc。不過，到目前為止，任何散發(fā)型CJD或GSS病例的這些組織中都檢測不到PrPSc(Kawashima等人，1997)。
正常蛋白質(zhì)以白細胞和血小板中表示，因而一些受感染個體的血細胞可能含有PrPSc(Aguzzi，1997)。這就使測試血液以診斷CJD成為可能，但這需要的測定靈敏度比現(xiàn)有高得多。
當感染接種體中的PrPSc與宿主PrPC特異性相互作用時，假定朊病毒會復制，會加速其向致病型蛋白轉變(Cohen等人，1994年)。這個過程需要幾個月至幾年的時間，PrPSc才達到足以引發(fā)臨床癥狀的濃度。
PrPSc感染單元好象是富含β-折疊的寡聚結構，將它整合到生長聚集物就可轉變?yōu)檎５鞍?

圖1)。將純化的PrPC與過量50倍摩爾已變性的PrPSc混合在體外模擬這種轉變(Kocisko等人，1994)。
到目前為止所敘述的體外轉變系統(tǒng)都具有效率低的缺點，這是因為它們需要過量PrPSc，故這些轉變系統(tǒng)都不適用于診斷目的，因為不能監(jiān)測到低于檢測量的標記物。效率低的原因是PrPSc寡聚物(轉化單元)的數(shù)目在整個測定過程保持不變。轉化單元最后會逐漸生長，其結果只是變大，數(shù)目并沒有增加(圖1)。
通常，致病構象體是患有所述疾病的標記物。
步驟(i)最好包括培養(yǎng)所述樣本/非致病構象體的步驟(ia)。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施例，步驟(ia)和(ii)形成一個循環(huán)，該循環(huán)在進行步驟(iii)前至少重復兩次。優(yōu)選重復該循環(huán)5至40次，最好重復5-20次。
待測或待診斷的構象病的特征是潛伏蛋白的構象轉換。這種”潛伏蛋白”是一種能夠接納非致病構象和致病構象的蛋白。這種蛋白的一個例子是朊病毒蛋白PrP。這種蛋白的另一個例子是在阿滋海默氏癥中發(fā)現(xiàn)的蛋白，即β-淀粉蛋白。
待診斷或待測構象病最好是傳染性構象病，如TSE(定義見背景技術所述)。
對于TSE病的診斷，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施例，疾病的標記物和致病構象體都是PrPSc，而相關蛋白質(zhì)的非致病構象體是PrPC。
步驟(i)(及在步驟(ib)中任選)所用的非致病構象體的含量一般為已知量，但若只想確定致病構象體是否存在，則無需知道非致病構象體的含量。
步驟(i)(及在步驟(ib)中任選)所用的非致病構象體的量最好要過量。通常，非致病構象體與致病構象體(如果樣本有的話)的初始比率要大于100∶1，優(yōu)選大于1000∶1，最好大于1000000∶1。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施例中，步驟(i)的非致病構象體存在于健康受試者的腦勻漿中，和/或在步驟(i)進行前將非致病構象體加到腦勻漿中；因此，該實施例在步驟(i)中加入含有(最好為已知)過量非致病構象體的腦勻漿。健康受試者的腦勻漿最好來自待分析樣本的同一種屬(例如，人腦勻漿用于待分析的人樣本，大鼠腦勻漿用于待分析的大鼠樣本)。更優(yōu)選的是，非致病構象體存在于腦勻漿的特異性片段中，如腦勻漿的脂筏。這些片段的制備可以按照Sargiacomo M等人于1993年所述的實施例進行。
故本發(fā)明還涉及本文所述的方法或測定，其中將組織或組織片段加到步驟(i)的非致病構象體中。組織最好是健康受試者(即沒有致病構象體的受試者)的腦組織、或者勻漿或由其衍生的片段。
據(jù)報道(Kocisko等人，1994年)，糖基化型PrPC很少能優(yōu)先轉變成PrPSc型。具體地說，用磷酸肌醇特異性磷脂酶處理過的PrPC轉變成致病型通常比全糖基化和深度糖基化的PrPC更有效。所以本發(fā)明的另一實施例涉及本文所述的方法或測定，其中非致病構象體是與野生型PrPC相比，糖基化水平較低的PrPC。用PrPC作為本文所述的方法和測定的非致病構象體之前，最好對其進行處理以除去部分、所有或大量糖基化作用；非致病構象體更優(yōu)選為基本上無糖基化的PrPC。
對于TSE的診斷，若樣本有致病型聚集物，在步驟(i)期間它們會促使PrPC向PrPSc轉變，在步驟(ii)期間這些聚集物會分解成小的但仍然會感染的單元，每個單元仍能促使其它PrPC轉變。本文稱這種方法為”循環(huán)擴增”，如圖2所示。該系統(tǒng)導致樣本的最終PrPSc含量呈指數(shù)增長，很容易就被檢測到。根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選實施例，由PrPC的已知含量可以計算出樣本PrPSc的初始含量，從而可確定測定結束時樣本的PrPSc含量，以及考慮要進行的循環(huán)次數(shù)。
相反，若樣本沒有PrPSc(PrPSc本身或聚集物形式)，PrPC分子就不會轉變?yōu)镻rPSc，并且測定結束時也完全無標記物(在樣本檢測不到致病構象物)。
業(yè)已證明，PrPSc的感染單元是含β-折疊的寡聚物，將它整合到生長聚集物，該處它獲得與變異型相關的性質(zhì)(抵抗蛋白酶及不溶性)就可以轉變?yōu)檎５鞍?Jerrett和Lansbury，Jr.，1993年；Caughey等人，1997年)。培養(yǎng)了PrP的兩種型式后，寡聚種屬通過補充和轉變PrPC分子來增大其體積。該過程效率非常低，這是因為它取決于寡聚物最終生長的固定數(shù)目。轉化單元的數(shù)目在反應過程中不會增加，它們只會增大其體積。假設這個過程在動物和人體感染后發(fā)生；已經(jīng)知道這一過程需要幾個月，或者甚至幾年的時間。本發(fā)明敘述了將寡聚物破碎，再使每個小寡聚物都能轉變PrPC的工藝。
所以，通過使不同組織或生物流體中低于檢測量的PrPSc擴增，該系統(tǒng)可直接應用在構象病的診斷上，特別是傳染性構象病，如TSE。該系統(tǒng)可以較早識別人們演變TSE的危險，并且在生化上力求達到在臨床試驗期間TSE治療化合物的功效也非常有用。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施例，待分析樣本經(jīng)一”預處理”步驟，目的在于”選擇性濃縮”樣本中待測致病構象體。據(jù)報道，就TSE而論，PrPC和PrPSc均位于質(zhì)膜的特定區(qū)，其由于含有相當高的膽固醇和鞘糖脂而可耐柔和去污劑(如冰凍的Triton X-100)(M.Vey等人，1996年)。這些膜區(qū)稱為脂筏或去污劑抗性膜(DRM)或類細胞膜穴樣內(nèi)陷區(qū)(CLDs)，它們富含信號蛋白、受體和GPI錨定蛋白。我們已經(jīng)確定，腦中100％的PrPC附在含全蛋白少于2％的該片段中(參見實施例6和圖7)。因此，使脂筏與樣本分離的簡單步驟可使PrPC顯著增加。申請人在脂筏從羊瘙癢癥腦勻漿分離，回收脂筏的PrPC中也得到類似的結果。
因此，本發(fā)明的一個實施例包括將待分析樣本預處理以便選擇性濃縮樣本中的致病構象體的步驟。致病構象體最好是PrPSc，而預處理是在不溶于柔和去污劑的片段樣本進行提取。
步驟(i)和(ia)優(yōu)選在生理條件(pH值、溫度和離子強度)下進行，更優(yōu)選為將蛋白酶抑制劑和去污劑加到溶液中。選擇的條件要使到任何致病構象體，如果樣本有的話，可以將非致病構象體轉變成致病構象體，形成致病構象體聚集物或寡聚物。適當?shù)纳項l件對本領域技術人員是顯而易見的。
假定樣本含有一些致病構象體，培養(yǎng)期將有一段時間，以便使一些、所有或大部分非致病構象體轉變成致病構象體。本領域技術人員很容易確定這段時間。每次培養(yǎng)優(yōu)選為1分鐘至4小時之間，更好是30分鐘至1小時，特別優(yōu)選為大約60分鐘。
培養(yǎng)步驟(ia)還可包括另一步驟(ib)，該步驟包括加入另外一些非致病構象體。
在本發(fā)明方法的步驟(ii)中，可以采用各種方法解集聚集物。它們包括用溶劑處理(如十二烷基硫酸鈉、二甲基亞砜、乙腈、胍、脲、三氟乙醇、稀釋的二氟乙酸、稀釋的甲酸等)、改變?nèi)軇┑睦砘再|(zhì)，如pH值、溫度、離子強度、介電常數(shù)、以及用物理方法，如超聲波、激光照射、冷凍/解凍、擠壓式細胞破碎(French press)、高壓滅菌培養(yǎng)、高壓、攪拌、溫和地勻化、其它各種照明等。本發(fā)明的優(yōu)選方法是超聲波。
解集可在一段時間內(nèi)進行，以使在步驟(ii)中已經(jīng)形成的一些、所有或大部分聚集物解集。在任何一步解集步驟中不必使所有聚集物都解集。以這種方式，每步解集步驟都可以增加轉化單元的數(shù)目。
本領域技術人員很容易確定解集時間，它取決于所用的解集方法。解集優(yōu)選進行1秒至60分鐘，更優(yōu)選為5秒至30分鐘，特別優(yōu)選為5秒至10分鐘。若解集是用超聲波進行的，超聲波優(yōu)選為5秒至5分鐘，最好是5秒至30秒。
在過去，超聲波已用作幾種PrP純化方法的一部分，目的是增加大聚集物的溶解度，但從未有敘述它可以在體外使PrP的轉變擴增。
使用常規(guī)單探針超聲波振蕩器在同時處理許多樣本時會產(chǎn)生一個問題，如需要診斷試驗。市場上出售一些同時向所有孔提供超聲波的96孔格式微板超聲波振蕩器，而且它們可為自動操作編程。這些超聲波振蕩器較易被改裝成用在本發(fā)明的診斷方法中。
故本發(fā)明的一實施例涉及多孔超聲波振蕩器在步驟(ii)中用。
按照任何一種已知方法，在步驟(i)至(ii)中所述的循環(huán)擴增方法后的步驟(iii)，可以檢測新轉變的致病構象體，如PrPSc。PrPSc的特異性檢測通常(但不總是，見下文)在第一步分離兩種PrP異構體(正常蛋白和致病蛋白)時進行。分離是基于PrPSc具有區(qū)別于人體大部分正常蛋白的特別的生化性質(zhì)，即，PrPSc是部分抗蛋白酶處理的，甚至不溶于非變性去污劑。所以，擴增步驟后的第一步通常是用蛋白酶處理或通過離心將可溶性蛋白(PrPC)和不溶性蛋白(PrPSc)分離，以使樣本中的PrPC去除或分離。之后，采用下列任何一種方法都可檢測到PrPSc，其中包括A) SDS-PAGE電泳后用免疫印跡法。該方法使用市售抗PrP抗體，以本領域技術人員所公知的一種常規(guī)工藝來做。
B) 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。通過簡單測定方法，其中將樣本裝在孔板上，再用抗PrP抗體檢測PrPSc的含量，或者最好采用夾心ELISA法，其中將孔板涂上可特異性地捕獲樣本中PrP的抗PrP抗體，最后用第二抗PrP抗體檢測，都可以測定固相。兩種ELISA法都可以用帶標記(放射活性、螢光、生物素等)的抗PrP抗體進一步提高檢測的靈敏度。
C) 放射活性測定。在步驟開始前使作為擴增步驟底物的正常PrPC帶放射活性標記(3H、14C、35S、125I等)，去除沒有轉變的PrPC后可定量測定新轉變的PrPSc的放射活性。該步驟較為定量，與所用的抗體無關。
D) 螢光測定。在步驟開始前使作為擴增步驟底物的正常PrPC帶螢光探針標記，去除沒有轉變的PrPC后可定量測定新轉變的PrPSc的螢光。螢光測定也可不必去除沒有轉變的PrPC，這是因為PrPC和PrPSc的構象截然不同，因而兩種異構體的螢光性質(zhì)可能不相同。
E) 聚集測定。眾所周知，PrPSc(不是PrPC)可以聚集形成淀粉狀原纖維或棒狀結構。所以，采用以下用于定量這種積聚物形成的方法可測定PrPSc，包括電子顯微鏡、用特異性染料染色(剛果紅、硫黃素S和T等)、以及密度測定法。因為已知正常PrPC不會聚集，所以測定聚集時不必分離兩種異構體。
F) 結構測定。正常和致病PrP之間最主要差異在于其二級和三級結構。
所以可使用能評估蛋白結構的方法，包括核磁共振(NMR)、圓二色散(Circular dichroism)、傅里葉轉化紅外線光譜、拉曼光譜(Ramanspectroscopy)、內(nèi)螢光、紫外線吸收等。
使用最普遍的PrP單克隆抗體是”3F4”(Kascsak等人，1987年)，它是一種自以倉鼠263K PrPres(蛋白酶抗性構象體)免疫的小鼠衍生而來的單克隆抗體。這種抗體也可識別倉鼠和人的非致病構象體，但不能識別牛、小鼠、大鼠、綿羊或兔腦的非致病構象體；它也可與人致病構象體結合，但只能在蛋白質(zhì)變性后。
這些抗體可以帶標記，使得標記物容易測定。例如，一些科學家用帶銪標記的3F4抗體測量時間分辨螢光(Safar等人，1998年)。
上述測定方法可用于測定其它致病構象體，例如，同樣適用于致病型淀粉蛋白。
在一變換實施例中，過量加入的非致病構象體可以被標記和檢測到，以致測定結束時利用非致病構象體的含量就可以確定樣本中致病構象體的初始含量。
根據(jù)另一變換實施例，用直接抗該致病構象體的抗體可直接檢測到致病構象體(標記物)。
廣義上說，可將標記或標記分子加在致病構象體、非致病構象體或抗其中一種構象體的抗體上，取決于進行何種測定方法。
本發(fā)明的另一個目的是測定構象病的標記物，其特征在于潛伏蛋白在樣本的非致病和致病構象體之間進行轉換，所述測定方法包括下列步驟(i)使所述樣本與一定量非致病構象體接觸；(ii)使在步驟(i)中最終形成的任何聚集物解集；以及(iii)檢測樣本中所述致病構象體是否存在和/或含量。通常，致病構象體是患有所述疾病的標記物。
步驟(i)最好包括培養(yǎng)所述樣本/非致病構象體的步驟(ia)。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施例，步驟(ia)和(ii)形成一個循環(huán)，該循環(huán)在進行步驟(iii)前至少重復兩次。優(yōu)選重復該循環(huán)5至40次，最好重復5至20次。
本發(fā)明的又一個目的是提供特定測定方法使用的診斷試劑盒，其包括一定量非致病構象體，選擇性地還可加上微滴定板和多孔超聲波振蕩器。
利用本發(fā)明的方法，可檢測到樣本初始含有1至10fg致病構象體，相當于3至30×10-20摩爾。
樣本通常是生物樣本或組織，用本發(fā)明的方法可測定任何這樣一個生物樣本或組織。如果樣本是組織，本發(fā)明的測定和方法可以在勻漿或直接在體外樣本中進行。這些測定和方法通常在體內(nèi)外樣本中進行。樣本最好是生物流體，如血液、淋巴、尿或奶；腦組織、脊髓、扁桃體組織或闌尾組織；自血液衍生的樣本，如血細胞空殼或血沉棕黃層(buffy coat)制劑；或質(zhì)膜制劑，如脂筏、去污劑抗性膜或類細胞膜穴樣內(nèi)陷區(qū)。另外，樣本也可以是一組合物，其包括諸如生長激素等自人或動物源衍生的化合物(特別是蛋白)，或組織提取物，如可激活提取物。這樣一種樣本組合物可以被致病構象體污染。
樣本也可包括食品或飲品，或一部分食品或飲品(可以指定給人消耗，又可以指定給動物消耗)，使該食品或飲品帶有或不帶有致病構象體。
在步驟(i)中加入的非致病構象體最好與樣本的種屬相同。例如，它可衍生自待測生物樣本的健康(即非致病)形式(如組織)。此外，利用本技術領域已知裝置可合成或重組制備非致病構象體。然而，我們知道，非致病構象體不必制成純或基本純的形式。在大多數(shù)情況下，非致病構象體是含有相關非致病構象體的組織勻漿或其片段。優(yōu)選例子包括腦勻漿及自其衍生的片段，如脂筏。
樣本和/或非致病構象體最好來源于人或家禽，如牛、綿羊、山羊或貓。
本發(fā)明的再一個目的是提供一種調(diào)節(jié)潛伏蛋白質(zhì)在非致病和致病構象體之間進行構象轉換的化合物的識別方法，其包括(i)在所述化合物存在或不存在的情況下，使一定量非致病構象體與一定量致病構象體接觸；(ii)使在步驟(i)中最終形成的任何聚集物解集；(iii)在所述化合物存在或不存在的情況下確定致病構象體的數(shù)量。
若需要，步驟(i)可包括培養(yǎng)所述樣本/非致病構象體的步驟(ia)，這也適用于以上所述本發(fā)明的方法和測定在上述步驟(ia)和(ii)之間進行的循環(huán)。
如果在化合物存在的情況下所測定的致病構象體含量比化合物不存在時高，表明化合物是加快構象轉變的因子；如果所測定的含量較低，表明化合物是抑制這種轉變的因子。
根據(jù)上述方法，”識別”還應解釋為”篩選”一系列化合物。
“標記”或”標記分子”可以是用作檢測蛋白的任何化合物。標記或標記分子可以通過離子或共價相互作用、氫鍵、靜電相互作用或嵌入而附在蛋白質(zhì)上。標記或標記分子的例子包括，但不限于，螢光染料共軛物、生物素、地高辛精、放射性核苷酸、化學發(fā)光物質(zhì)、酶及受體，以便用螢光、與鏈霉抗生素和/或抗生物素共軛、定量放射活性或化學發(fā)光、催化和/或與配體受體相互作用來檢測帶標記的蛋白質(zhì)。它最好是螢光或磷光標記。
術語”構象病”是指一組疾病，由于潛伏蛋白出現(xiàn)異常構象轉變繁殖，導致蛋白質(zhì)積聚和組織沉積而產(chǎn)生。這樣一些疾病可以通過介導構象改變而傳染，以及從致病構象體向正?；蚍侵虏嬒篌w傳播，故本文將它們稱為”傳染性構象病”。這種疾病的例子是朊病毒腦病，包括牛海綿腦病(BSE)及其人類相當?shù)目?雅氏病(CJD)，它們的潛伏蛋白是PrP。
術語”散發(fā)性CJD”縮寫為”sCJD”，是克-雅氏病最常見的一種表現(xiàn)形式。這種病在平均年齡為60歲的個體自發(fā)發(fā)生，地球上每年每100萬個個體就有一個患有sCJD。
術語”醫(yī)源性CJD”縮寫為”iCJD”，指帶人朊病毒的人由于意外感染而引起的疾病。這種疾病最出名的例子是帶人朊病毒的小孩從污染的人生長激素制劑中意外感染。
術語”家族性CJD”指CJD的一種形式，它很少發(fā)生在家族成員身上，由于人朊病毒蛋白基因突變而引起。這種病由常染色體顯性遺傳病引起。遺傳了突變的家族成員會死于CJD。
術語”格-史氏病”縮寫為”GSS”，指遺傳型人朊病毒的一種形式。這種疾病由常染色體顯性遺傳病引起。遺傳了突變基因的家族成員會死于GSS。
術語”朊病毒(prion)”是指一種傳染顆粒，已知它們在人或動物身上引起一組傳染性構象病(海棉腦病)。術語”朊病毒”是詞語”蛋白質(zhì)(protein)”和”感染(infection)”的縮寫，如果把PrPSc分子計算在內(nèi)，朊病毒主要包括這種顆粒。
朊病毒與細菌、病毒及類病毒不同。已知的朊病毒包括使動物感染而引起羊瘙癢病、綿羊和山羊神經(jīng)系統(tǒng)的傳染和退化病以及牛海綿腦病或俗稱瘋牛病和貓的貓海綿腦變的朊病毒。已知影響人類的四種朊病毒病是(1)庫魯病，(2)克-雅氏病(CJD)，(3)格-史氏病(GSS)，(4)致死性家族性失眠癥(FFI)。本文使用的朊病毒包括在所用的任何動物，特別是人或家禽，中引起全部或任何這些疾病或其它病的所有形式朊病毒。
術語”PrP基因”和”朊病毒蛋白基因”在本文是互通的，都是描述表達朊病毒蛋白和多樣性及突變的基因材料，如題為”致病突變和多樣性”的表格中列出一些多樣性及突變。PrP基因可以來自任何動物，包括本文所述的”宿主”和”測試”動物以及其任何和所有多樣性和突變，業(yè)已公認，該術語包括其它一些還未被發(fā)現(xiàn)的PrP基因。
術語”PrP基因”通常指任何種屬的任何基因，其編碼包括任何朊病毒蛋白在內(nèi)的PrP氨基酸序列的任何形式。Gabriel等人于1992年敘述了一些常見PrP序列，列于本文的引用文獻中，用以揭示和描述這些序列。
本文所用的縮寫包括CNS指中樞神經(jīng)系統(tǒng)；BSE指牛海綿腦?。籆JD指克-雅氏?。籉FI指致死性家族性失眠癥；GSS指格-史氏病；PrP指朊病毒蛋白；
PrPC指PrP的正常、非致病構象體；PrPSc指PrP的致病或”羊瘙庠病”異構體(它也是朊病毒病的標記物)。致病突變和多樣性人PrP基因有許多已知的致病突變。此外，人、綿羊和牛PrP基因有已知的多樣性。
以下列出這些不構成限制的突變和多樣性。
突變表

出現(xiàn)在絕大多數(shù)個體上的正常氨基酸序列被稱為野生型PrP序列。這種野生型序列具有一定的特征多樣性變異。人PrP在殘基129(Met/Val)和219(Glu/Lys)出現(xiàn)兩種多態(tài)氨基酸。綿羊PrP在殘基171和136有兩種氨基酸多樣性，而牛PrP在成熟朊病毒蛋白的氨基末端區(qū)上有五個或六個重復的八氨基酸基序。這些多樣性沒有一種本身是致病的，它們表現(xiàn)為影響朊病毒病。一些改變PrP特異氨基酸殘基或改變八重復序列數(shù)目的人PrP基因突變與這些野生型朊病毒蛋白的正常變異型不同，它們已經(jīng)被識別出來，與遺傳型人朊病毒病不同。
要對上表列出的突變和多樣性有更多了解，可以參考PrP基因已公開的序列。例如，Gabriel等人于1992年揭示和公開了雞、牛、綿羊、大鼠、小鼠的PrP基因。Baslet等人于1986年公開了敘利亞倉鼠的序列。Goldmann等人于1990年公開了綿羊PrP基因。Goldmann等人于1991年公開了牛PrP基因序列。Harris等人于1991年公開了雞PrP基因序列。Kretzschmar等人于1992年公開了水貂PrP基因序列。Kretzschmar等人于1986年公開了人PrP基因序列。Locht等人于1986年公開了小鼠PrP基因序列。Westaway等人于1994年公開了綿羊PrP基因序列。這些公開全部列于本文的引用文獻中，用以揭示和描述PrP基因及PrP氨基酸序列。
本發(fā)明還提供一種檢測樣本(最好為血液或腦樣本)中有否致病型朊病毒蛋白的方法，其包括(i)使樣本與一定量非致病朊病毒蛋白接觸；(ia)培養(yǎng)樣本/非致病朊病毒蛋白；(ii)使在步驟(ia)中形成的任何聚集物解集；重復步驟(ia)和(ii)兩次或多次；然后(iii)檢測樣本中致病型朊病毒蛋白是否存在和/或含量。
本發(fā)明的另一個實施例提供一種診斷病人CJD的方法，其包括在病人身上抽取樣本(最好為血液或腦樣本)；(i)使樣本與一定量PrPC蛋白接觸；(ia)培養(yǎng)樣本/PrPC蛋白；(ii)使在步驟(ia)中形成的任何聚集物解集；重復步驟(ia)和(ii)兩次或多次；然后(iii)檢測樣本中PrPSc是否存在和/或含量。
本發(fā)明還提供一種檢測樣本(最好為血液或腦樣本)中有否致病型β-淀粉蛋白的方法，其包括(i)使樣本與一定量非致病β-淀粉蛋白接觸；(ia)培養(yǎng)樣本/非致病β-淀粉蛋白；(ii)使在步驟(ia)中形成的任何聚集物解集；重復步驟(ia)和(ii)兩次或多次；然后(iii)檢測樣本中致病β-淀粉蛋白是否存在和/或含量。
本發(fā)明的一實施例提供一種診斷病人阿滋海默氏癥的方法，其包括(i)使樣本與一定量非致病β-淀粉蛋白接觸；(ia)培養(yǎng)樣本/非致病β-淀粉蛋白；(ii)使在步驟(ia)中形成的任何聚集物解集；
重復步驟(ia)和(ii)兩次或多次；然后(iii)檢測樣本中致病β-淀粉蛋白是否存在和/或含量。
本發(fā)明也提供用于上述方法的裝置，具體地說，裝置包括微滴定板、多孔超聲波振蕩器及一定量非致病構象體。
本發(fā)明的再一個實施例提供一種構象病的診斷和檢測方法，其特征在于潛伏蛋白在非致病和致病構象體之間進行構象轉換，測定樣本中所述疾病的標記物，所述方法包括(i)使所述樣本與已知量非致病構象體接觸，(ii)使在步驟(i)中最終形成的聚集物解集，(iii)檢測樣本中所述致病構象體是否存在和/或含量。步驟(i)和(ii)最好形成一個循環(huán)，該循環(huán)在進行步驟(iii)前至少重復兩次。步驟(i)和(ii)最好形成一個在進行步驟(iii)前重復5至40次的循環(huán)。
此外，本發(fā)明提供構象病標記物的測定方法，其特征在于潛伏蛋白在非致病和致病構象體之間進行構象轉換，所述測定方法包括下列步驟(i)使所述樣本與已知量非致病構象體接觸，(ii)使在步驟(i)中最終形成的聚集物解集，(iii)檢測樣本中所述致病構象體是否存在和/或含量。步驟(i)和(ii)最好形成一個循環(huán)，該循環(huán)在進行步驟(iii)前至少重復兩次。
本發(fā)明還提供一種調(diào)節(jié)潛伏蛋白在非致病構象體和致病構象體之間構象轉換的化合物的識別方法，其包括(i)在所述化合物存在或不存在的情況下，使已知量非致病構象體與已知量致病構象體接觸；(ii)使在步驟(i)中最終形成的聚集物解集；(iii)在所述化合物存在或不存在的情況下，檢測致病構象體的含量。
結合具體實施例業(yè)已對本發(fā)明進行敘述，但敘述內(nèi)容包括所有變換和取代，而在不超出本權利要求書的內(nèi)容和目的情況下，這些變換和取代可由本領域技術人員實現(xiàn)。
現(xiàn)在，結合下列實施例對本發(fā)明加以詳細說明，但這不構成對本發(fā)明的限制。實施例可參考以下附圖。
圖2所示為循環(huán)擴增步驟的圖解。該系統(tǒng)基于PrPSc在過量PrPC存在下進行培養(yǎng)循環(huán)，繼之以超聲波循環(huán)。在培養(yǎng)期間，寡聚物PrPSc通過將PrPC與生長聚集物合并而膨大，而在超聲波期間，聚集物被解集，目的是使轉化單元擴增。圖中示出超聲波/培養(yǎng)循環(huán)2次。
圖3所示為通過超聲波循環(huán)擴增PrPSc。小量含有PrPSc的羊瘙癢病腦勻漿與健康大鼠腦勻漿(條帶1，對照實驗)或與健康倉鼠腦勻漿(條帶2和3)一起培養(yǎng)。后一個樣本分成兩組，其中一組超聲波/培養(yǎng)循環(huán)5次(條帶3)。上述一半樣本直接裝在凝膠上，用考馬斯使全蛋白染色(A組)。另一半樣本以蛋白酶K處理，并用抗PrP抗體3F4免疫印跡(B組)。C組所示為健康腦勻漿單獨培養(yǎng)(條帶1和2)或與稀釋羊瘙癢病腦勻漿一起培養(yǎng)(條帶3和4)的一些對照。一半樣本(條帶2和4)超聲波/培養(yǎng)循環(huán)5次。條帶2、3和4以蛋白酶K處理。
圖4所示為循環(huán)擴增系統(tǒng)的靈敏度。通過連續(xù)稀釋羊瘙癢病腦勻漿，并與健康倉鼠腦勻漿在超聲波或無超聲波作用下一起培養(yǎng)，研究擴增后可用于檢測的最小PrPSc濃度。A組所示為對照實驗，其中羊瘙癢病倉鼠腦被連續(xù)稀釋在大鼠腦勻漿中。B組對應羊瘙癢病倉鼠腦的稀釋濃度與健康倉鼠腦一起培養(yǎng)，并超聲波/培養(yǎng)循環(huán)5次的實驗。C組所示為對A和B組免疫印跡進行的密度測定評估。以腦為初始材料，稀釋成以下濃度100(條帶1)、200(條帶2)、400(條帶3)、800(條帶4)、1600(條帶5)、3200(條帶6)。
圖5所示為PrPres信號與擴增循環(huán)次數(shù)之間的關系。稀釋的羊瘙癢病腦勻漿與過量健康倉鼠腦勻漿一起培養(yǎng)。使樣本超聲波/培養(yǎng)循環(huán)0、5、10、20或40次，用免疫印跡法評估PrPres信號。
圖6所示為血液樣本中PrPSc的擴增。用羊瘙癢病腦勻漿摻入肝素化大鼠血液，最后達到10∶1的稀釋濃度。該混合物在室溫下培養(yǎng)15分鐘。用肝素化大鼠血液將該材料以10倍濃度進行稀釋。這些樣本超聲波/培養(yǎng)循環(huán)11次，用免疫印跡法評估PrPres信號。
圖7所示為朊病毒蛋白存在于脂筏中。改變上述方案使脂筏(也稱去污劑抗性膜片段或DRM)分離。取100mg腦組織在1ml含有1％triton X-100和1倍蛋白酶抑制劑的全混合物的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中勻化(Boehringer)。通過22G注射器針頭利用10次傳代使組織勻化，在4℃搖床培養(yǎng)30分鐘。樣本以1∶2的比率在60％的蔗糖中稀釋，置于離心管底。將7ml 35％的蔗糖小心置于樣本上。試管面上置一層1.5ml 15％的蔗糖。試管在4℃以每分鐘150,000轉的轉速離心18小時。脂筏流向15％-35％的蔗糖界面(A組)。收集不同片段，用硝酸銀使全部蛋白染色進行分析(B組)，并用免疫印跡法來檢測PrP(C組)。為了除去樣本中的蔗糖，回收脂筏片段，用PBS清洗，在4℃以每分鐘28,000轉的轉速離心1小時。沉淀物洗滌后重新懸浮于含有0.5％Triton X-100、0.5％SDS和蛋白酶抑制劑的PBS中。所有PrPC都位于該片段中(D組)。
圖8所示為擴增所需的因子存在于脂筏中。如圖2所述使脂筏與健康倉鼠腦分離，并與自羊瘙癢病倉鼠腦高純化而來稀釋700倍的PrPSc混合。樣本冷凍(行3)或擴增20小時(行4)。行1和2表示采用的步驟相同，但擴增用的是全腦勻漿。
圖9所示為在倉鼠腦中PrPSc的癥狀前檢測。倉鼠用生理鹽水(對照組)或用稀釋100倍的羊瘙癢病腦勻漿在腦內(nèi)接種。每星期每組處死4只倉鼠，提取腦，并勻化。一半樣本立即冷凍(白色方塊)，另一半樣本培養(yǎng)/超聲波循環(huán)20次(黑色方塊)。所有樣本用蛋白酶K處理和免疫印跡。用密度測定法評估頻帶強度。每條方塊表示4只動物樣本的平均值。在任何一個對照腦樣本中，無論是否有擴增，都檢測不到PrPSc，圖中未示出這些結果。
圖10所示為人PrPSc的擴增。這些研究是用11例已確認的散發(fā)性CJD、5例家族性CJD及4例年齡相當?shù)陌ㄊ芷渌窠?jīng)性疾病影響的病人的對照腦樣本來進行的。勻化腦，分成20個擴增樣本。圖中示出一個對照組(A)和三個不同散發(fā)性CJD(B)病例(1、2、3)的典型結果。
圖11所示為制備血細胞空殼后測定血液中的PrPSc。如本文所述，從0.5ml來自健康(C)及感染羊瘙癢病(Sc)倉鼠的肝素化血液制備細胞空殼。一半樣本不擴增，另一半樣本與正常倉鼠腦勻漿混合，并擴增20個循環(huán)。然后，所有樣本用蛋白酶K處理及用免疫印跡法分析。圖中示出一個典型實驗。
圖12所示為用十二烷基肌氨酸鈉(Sarcosyl)提取后測定血液中的PrPSc。如本文所述，用Sarcosyl提取0.5ml來自健康(C)及感染羊瘙癢病(Sc)倉鼠的肝素化血液。一半樣本不擴增，另一半樣本與正常倉鼠腦勻漿混合，并擴增20個循環(huán)。然后，所有樣本用蛋白酶K處理及用免疫印跡法分析。圖中示出對照組動物一個典型樣本和感染羊瘙癢病動物的兩個典型樣本。
圖13所示為脂筏純化后測定血液中的PrPSc。如本文所述，從0.5ml來自健康(C)及感染羊瘙癢病(Sc)倉鼠的肝素化血液中提取脂筏。一半樣本不擴增，另一半樣本與正常倉鼠腦勻漿混合，并擴增循環(huán)20次。然后，所有樣本用蛋白酶K處理及用免疫印跡法分析。圖中示出對照組動物一個典型樣本和感染羊瘙癢病動物的兩個典型樣本。
圖14所示為制備血沉棕黃層(buffy coats)后測定血液中的PrPSc。通過離心從0.5ml來自健康(C)及感染羊瘙癢病(Sc)倉鼠的肝素化血液分離血液的血沉棕黃層片段。一半樣本不擴增，另一半樣本與正常倉鼠腦勻漿混合，并擴增20個循環(huán)。然后，所有樣本用蛋白酶K處理及用免疫印跡法分析。圖中示出一個典型實驗。
這種轉變?nèi)Q于是否有PrPSc，這是因為無論是否有超聲波作用，正常倉鼠腦勻漿在同樣條件下單獨培養(yǎng)時都檢測不到PrPres(圖3C，條帶2)。要消除轉移的假象，利用大鼠PrP以免疫印跡所用的抗體檢測不到的事實，將大鼠腦勻漿加到稀釋的羊瘙癢病樣本中，使裝在凝膠上的全蛋白質(zhì)保持不變(圖3A)。
用肝素化大鼠血液以10倍濃度連續(xù)稀釋這種混合物。每種稀釋濃度各取50μl，以每分鐘3,000轉的轉速離心10分鐘。將血漿從沉淀分離出來。取10μl血漿與50μl含有PrPC底物的健康倉鼠腦勻漿混合，用作轉變反應。樣本培養(yǎng)/超聲波循環(huán)11次。作為對照，取同樣的樣本與50μl健康倉鼠腦勻漿混合，保持在-20℃直至需要時才取出。取15μl經(jīng)超聲波振蕩的對照樣本，如以下“方法”部分所述那樣，用蛋白酶K消化，通過SDS-PAGE電泳分離，用蛋白印跡法分析以及檢測PrPSc。
實驗結果參看圖6。這些結果表明擴增后蛋白質(zhì)的檢測有明顯上升，特別當PrPSc濃度低(例如稀釋濃度為1280)的時候更加明顯。如果我們將這些結果與在受感染的腦組織上獲得的結果進行比較，我們可以肯定擴增過程同樣適用于血液。
到目前為止，還未能確定發(fā)病期間PrP轉變所發(fā)生的亞細胞部位。然而，據(jù)報導，PrPSc和PrPC均位于質(zhì)膜的特定區(qū)中，這個特定區(qū)由于有相對較高含量的膽固醇和鞘糖脂而抗柔和去污劑的處理(Vey等人，1996年；Harmey等人，1995年)。這些膜區(qū)被稱為脂筏或去污劑抗性膜(DRM)，它們富含信號蛋白、受體和GPI錨定蛋白。我們已經(jīng)確定，腦中100％的PrPC附在這個含有全蛋白小于2％的片段上(圖7)。因此，脂筏分離的簡單步驟可使PrPC顯著增加。在羊瘙癢病腦勻漿分離脂筏，回收脂筏的PrPSc中也得到類似結果。
為了評估脂筏是否含有擴增PrP所需的因子，我們自健康動物腦純化脂筏，并加入極少量自生病動物腦提取出來的高度純化PrPSc。在脂筏中擴增相當于用全腦提取物所進行的擴增(圖8)，這是因為兩種情形在擴增后所產(chǎn)生的PrPres量差不多。這個結果表明這個特定膜區(qū)含有PrP轉變和擴增所需的所有因子(包括所謂的“X因子”；(Telling等人，1995年))。所以，使蛋白質(zhì)與脂筏進一步分離，并通過循環(huán)擴增監(jiān)測其活性可識別和分離PrP轉變所需的因子。另外，脂筏可替換用作循環(huán)擴增步驟中的全腦勻漿，作為PrPC底物及其涉及轉變的內(nèi)源因子的來源。
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42.WHO/EMC/ZDI/98.9，Global Surveillance，Diagnosis and Therapy of HumanTransmissible Spongiform EncephalopathiesReport of a WHO Consultation，Geneva，Switzerl，9-11 February 1998，WHO.
權利要求
1.一種構象病的診斷或檢測方法，其特征在于潛伏蛋白在非致病和致病構象體之間進行構象轉換，測定樣本中所述疾病的標記物，所述方法包括(i)使所述樣本與一定量非致病構象體接觸；(ii)使在步驟(i)中最終形成的任何聚集物解集；以及(iii)檢測樣本中所述致病構象體是否存在和/或含量，致病構象體是患有所述疾病的標記物。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(i)包括培養(yǎng)所述樣本/非致病構象體的步驟(ia)。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于所述步驟(ia)和(ii)形成一個循環(huán)，該循環(huán)在進行步驟(iii)之前至少重復2次。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于所述循環(huán)在進行步驟(iii)之前重復5至40次。
5.如上述權利要求中任何一項所述的方法，其特征在于所述步驟(i)在生理條件下進行。
6.如上述權利要求中任何一項所述的方法，其特征在于所述步驟(i)的非致病構象體的含量是過量的。
7.如上述權利要求中任何一項所述的方法，其特征在于所述構象病是傳染性構象病。
8.如上述權利要求中任何一項所述的方法，其特征在于所述待分析樣本要經(jīng)預處理，以便選擇性濃縮樣本中的致病構象體。
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于所述致病構象體是PrPSc，預處理是在不溶于柔和去污劑的片段樣本進行提取。
10.一種構象病標記物的測定方法，其特征在于潛伏蛋白在樣本中的非致病和致病構象體之間進行構象轉換，所述測定方法包括以下步驟(i)使所述樣本與一定量非致病構象體接觸；(ii)使在步驟(i)中最終形成的任何聚集物解集；以及(iii)檢測樣本中所述致病構象體是否存在和/或含量，致病構象體是患有所述疾病的標記物。
11.如權利要求10所述的測定方法，其特征在于所述步驟(i)包括培養(yǎng)所述樣本/非致病構象體的步驟(ia)。
12.如權利要求11所述的測定方法，其特征在于所述步驟(ia)和(ii)形成一個循環(huán)，該循環(huán)在進行步驟(iii)之前至少重復2次。
13.一種在如權利要求10至12中任何一項所述測定方法中所用的的診斷試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括已知量的非致病構象體。
14.如權利要求13所述的診斷試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括多孔微滴定板和多孔超聲波振蕩器。
15.一種調(diào)節(jié)潛伏蛋白質(zhì)在非致病構象體和致病構象體之間進行構象轉換的化合物的識別方法，其特征在于所述方法包括(i)在所述化合物存在(a)和所述化合物不存在(b)的情況下，使一定量非致病構象體與一定量致病構象體接觸；(ii)使在步驟(i)中最終形成的任何聚集物解集；及(iii)在所述化合物存在(a)和所述化合物不存在(b)的情況下，檢測致病構象體的含量。
16.如權利要求1至9或15中任何一項所述的方法或如權利要求10至12中任何一項所述的測定方法，其特征在于所述致病構象體是PrPSc，所述非致病構象體是PrPC，而潛伏蛋白是朊病毒蛋白。
17.一種檢測樣本中有否致病型朊病毒蛋白的方法，其特征在于所述方法包括(i)使樣本與一定量非致病朊病毒蛋白接觸；(ia)培養(yǎng)樣本/非致病朊病毒蛋白；(ii)使在步驟(ia)中形成的任何聚集物解集；重復步驟(ia)至(ii)兩次或多次；然后(iii)檢測樣本中致病朊病毒蛋白是否存在和/或含量。
18.一種診斷病人CJD的方法，其特征在于所述方法包括在病人身上抽取樣本；(i)使樣本與一定量PrPC蛋白接觸；(ia)培養(yǎng)樣本/PrPC蛋白；(ii)使在步驟(ia)中形成的任何聚集物解集；重復步驟(ia)至(ii)兩次或多次；然后(iii)檢測樣本中PrPSc是否存在和/或含量。
19.一種檢測樣本中有否致病型β-淀粉蛋白的方法，其特征在于所述方法包括(i)使樣本與一定量非致病β-淀粉蛋白接觸；(ia)培養(yǎng)樣本/非致病β-淀粉蛋白；(ii)使在步驟(ia)中形成的任何聚集物解集；重復步驟(ia)至(ii)兩次或多次；然后(iii)檢測樣本中致病β-淀粉蛋白是否存在和/或含量。
20.一種診斷病人阿滋海默氏癥的方法，其特征在于所述方法包括在病人身上抽取樣本；(i)使樣本與一定量非致病β-淀粉蛋白接觸；(ia)培養(yǎng)樣本/非致病β-淀粉蛋白；(ii)使在步驟(ia)中形成的任何聚集物解集；重復步驟(ia)至(ii)兩次或多次；然后(iii)檢測樣本中致病β-淀粉蛋白是否存在和/或含量。
21.如權利要求1至9或15中任何一項所述的方法或如權利要求10至12中任何一項所述的測定方法中所用的裝置。
22.如權利要求1至9或15中任何一項所述的方法或如權利要求10至12中任何一項所述的測定方法所用中的裝置，其特征在于所述裝置包括微滴定板、多孔超聲波振蕩器及一定量非致病構象體。
全文摘要
本發(fā)明敘述了一種通過測定樣本中構象病的標記物(致病構象體)來診斷或檢測構象病的方法。該方法包括一種循環(huán)擴增系統(tǒng)，其用于增加引起這些疾病的致病構象體的水平。具體地說，這樣一些傳染性構象病可以是朊病毒(prion)腦病。本發(fā)明還揭示了基于這些方法所用的測定方法、診斷試劑盒及裝置。
文檔編號G01N33/68GK1449497SQ01814920
公開日2003年10月15日 申請日期2001年6月13日 優(yōu)先權日2000年7月7日
發(fā)明者C·索托, G·薩伯里歐 申請人:應用研究系統(tǒng)Ars股份公司