一種分離純化大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的方法
【專利摘要】一種大鼠肺組織中分離、純化微血管內(nèi)皮細(xì)胞的方法，其特征在于將胸膜下肺邊緣組織用酶消化處理為單細(xì)胞懸液，CD31免疫磁珠分選得到目標(biāo)細(xì)胞。取大乳鼠胸膜下肺邊緣組織，先用膠原酶II和中性蛋白酶混合液消化制備單細(xì)胞懸液，然后與CD31免疫磁珠孵育結(jié)合，再利用磁珠分選純化系統(tǒng)篩選CD31+細(xì)胞，磁珠釋放液去除CD31+細(xì)胞結(jié)合的磁珠，獲得高純度的大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞。本發(fā)明的優(yōu)點是通過酶消化制備單細(xì)胞懸液和CD31免疫磁珠分選，可以從大鼠肺組織中分離提取到高純度的微血管內(nèi)皮細(xì)胞。
【專利說明】一種分離純化大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種從大鼠肺組織中分離提取高純度微血管內(nèi)皮細(xì)胞的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 微血管內(nèi)皮細(xì)胞位于微血管內(nèi)表面，是營養(yǎng)物質(zhì)、致病因子、細(xì)胞因子和藥物等由 血液循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)入血管外組織的必經(jīng)屏障，功能具有多樣性，是凝血、充血、瘀血、水腫、炎 癥、免疫、腫瘤發(fā)生等基本病理變化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)點。微血管內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)為深入了解 其生物學(xué)特性提供了重要途徑，對研究開發(fā)保護(hù)和治療微血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙所致疾的 途徑和藥物病具有重要意義。
[0003] 不同組織器官的微血管內(nèi)皮細(xì)胞表型和功能有顯著異質(zhì)性，某一臟器相關(guān)生理病 理機(jī)制的研究需要培養(yǎng)相應(yīng)的微血管內(nèi)皮細(xì)胞。盡管當(dāng)前已有多種動物心、肺、皮膚、腦等 組織器官微血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)的報道，但由于微血管的管徑小、分散于組織器官內(nèi)部， 不能直接灌注消化液或有效分離出微血管段，微血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離純化技術(shù)仍是個難 題，難以避免非微血管內(nèi)皮細(xì)胞的污染。
[0004] 肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)當(dāng)前主要采取酶消化法和組織貼塊法，酶消化法易 于短期內(nèi)獲得大量微血管內(nèi)皮細(xì)胞，但非微血管內(nèi)皮細(xì)胞會均勻混雜其中，單純的手工操 作難以進(jìn)行純化；組織貼塊法也因組織樣品和處理方法的差異無法確定最佳的去塊時間， 難以避免肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的游出而污染。
[0005] 本發(fā)明將酶消化法和免疫磁珠技術(shù)相結(jié)合，可快速從大鼠肺組織中分離、純化到 高純度的微血管內(nèi)皮細(xì)胞。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種分離培養(yǎng)高純度大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的方法。
[0007] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的。
[0008] -種從大鼠肺組織分離培養(yǎng)高純度微血管內(nèi)皮細(xì)胞的方法，其步驟如下。
[0009] A.將大乳鼠斷頸處死，剖開胸腔，右心室灌注Hank' S液，無菌取出肺臟，剔除臟 胸膜，剪取肺邊緣組織，去除大血管，剪碎為小塊；所述右心室灌注Hank' s液于4°C預(yù)冷， 灌注至肺臟發(fā)白；所述剪碎為小塊的體積約為I mm3。
[0010] B.將所述肺組織小塊用Hank' s液漂洗，加入消化液中消化；所述的消化液為 0. 2%膠原酶！[和0. 1%中性蛋白酶混合溶液，消化溫度為37°C，消化時間為2(T30 min。將 所述消化后的溶液過200目細(xì)胞篩，收集濾液離心，沉淀細(xì)胞團(tuán)用0.01 M PBS重懸為單細(xì) 胞懸液；所述離心處理，轉(zhuǎn)速為80(Tl200 rpm，時間為5?10 min;所述0.01 M PBS含有0.1% 牛血清白蛋白、2 mM EDTA;所述的單細(xì)胞懸液密度為IX IO7個/mL。
[0011] C.將所述的單細(xì)胞懸液中加入⑶31免疫磁珠，孵育得到細(xì)胞-抗體-磁珠復(fù)合 物。所述的CD31免疫磁珠為CD31單克隆抗體與磁珠孵育結(jié)合獲得，溫度為4°C，時間為過 夜，密度為4 X IO8個/mL，每毫升單細(xì)胞懸液加⑶31免疫磁珠25 μ L ;所述的孵育處理，置 于旋轉(zhuǎn)搖床，溫度為15?25 °C，時間為3(T60 min。
[0012] D.將所述的細(xì)胞-抗體-磁珠復(fù)合物從未結(jié)合磁珠和細(xì)胞中分離；所述的分離處 理使用KingFisher 96磁珠分選純化系統(tǒng)，程序設(shè)置為：慢速混合30 s，收集2次，每次5 s ;重復(fù)4次，細(xì)胞-抗體-磁珠復(fù)合物釋放于含5%胎牛血清、I mM氯化鈣和4 mM氯化鎂 的DMHM培養(yǎng)基。
[0013] E.將所述的細(xì)胞-抗體-磁珠復(fù)合物懸浮液中加入釋放緩沖液去除細(xì)胞表面結(jié) 合的磁珠；所述釋放緩沖液為DNase I溶液，每毫升細(xì)胞懸液加4 μ L，溫度為室溫，作用時 間為1〇~20 min ;所述去除磁珠用KingFisher 96磁珠分選純化系統(tǒng)，程序設(shè)置為：中速混 合I min，收集2次、每次I s，中速釋放3 s ;重復(fù)1次。
[0014] F.將所述去除磁珠的⑶31+細(xì)胞離心，用完全培養(yǎng)基重懸，接種孵育培養(yǎng)；所述 的離心處理，轉(zhuǎn)速為80(Tl200 rpm，時間為5~10 min;所述的完全培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基，含 20%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、100 IU青霉素和100 μ g/mL鏈霉素；所述的接種培養(yǎng)細(xì) 胞密度為IX IO5個/mL。
[0015] G.所述的接種培養(yǎng)細(xì)胞每3天換一次完全培養(yǎng)基，至亞匯合狀態(tài)時傳代培養(yǎng)；所 述的傳代培養(yǎng)用含0.05%胰蛋白酶和0.005% EDTA的0.01 M PBS溶液消化脫壁，傳代密度 為 IX IO5 個/mL。

【具體實施方式】
[0016] 實施例一。
[0017] 1.主要實驗材料。
[0018] ( 1)實驗動物：7日齡SD大乳鼠。
[0019] (2) Hank' s 液：購自 GIBCO 公司，貨號 14170-112。
[0020] (3) 0· 01 M PBS :取 NaCl 8. 0 g、Na2HP04 2. 9 g、KH2P04 0· 2 g、KCl 0· 2 g，溶解于 1000 mL超純水中，0. 22 μ m過濾除菌，于4°C冰箱貯存。
[0021] (4)消化液：用0· 01 M PBS配制，含0· 2%膠原酶Π (購自Worthington公司，貨號 LS004176)和0. 1%中性蛋白酶Π (購自Sigma公司，貨號D4693-1G)，0. 22 μπι無菌濾器過 濾除菌。
[0022] (5)完全培養(yǎng)基：DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(購自GIBCO公司，貨號11960-044)，含20% 胎牛血清(購自GIBCO公司，貨號10099-141)、2 mM L-谷氨酰胺(購自GIBCO公司，貨號 25030-081 )、1%雙抗溶液（100 IU/ml青霉素和100 μ g/ml鏈霉素，購自GIBCO公司，貨號 15140-122)。
[0023] (6)小鼠抗大鼠 CD31單克隆抗體：購自AbD Serotec公司，貨號MCA 1334G，規(guī)格 為200 μ 1 (含200 μ g)，每25 μ 1磁珠使用0· 5 μ g抗體。
[0024] (7)小鼠 IgG磁珠試劑盒：包括5 ml密度為4X IO8個/mL包被抗小鼠 IgG的磁 珠，3管釋放緩沖液成分1 (每管為15000~20000 U凍干DNasel)，及2 ml釋放緩沖液成分 2。釋放緩沖液的配制為每管成分1加0. 3ml成分2溶解，分裝凍存，每毫升樣品加4 μ 1。
[0025] (8)樣品緩沖液：用0.01 M PBS配制，含有0. 1%牛血清白蛋白和2 mM EDTA，0. 22 μ m無菌濾器過濾除菌。
[0026] (9)磁珠清洗液：用0.01 M PBS配制，含有0. 1%牛血清白蛋白，0.22 μ m無菌濾 器過濾除菌。
[0027] (10) EDTA-胰蛋白酶溶液：用 0.01 M PBS 配制，含 0.005%。
[0028] 2.操作步驟。
[0029] 7日齡大乳鼠5只，斷頸處死，剖開胸腔，右心室灌注4°C預(yù)冷Hank's液至肺臟發(fā) 白，無菌取出肺臟，剔除臟胸膜，剪取肺邊緣組織，去除大血管，剪碎為I mm3小塊，Hank's液 漂洗，加入消化液37° C消化20 min，至無成形肺組織小塊。消化液過200目細(xì)胞篩，收集濾 液1000 rpm離心10 min，沉淀細(xì)胞團(tuán)用10 ml樣品緩沖液重懸，密度約為I X IO7個/mL。
[0030] 取250 μ 1包被抗小鼠 IgG的磁珠，參照說明書用磁珠清洗液洗滌，重懸于250 μ 1磁珠清洗液，加入5 μ 1小鼠抗大鼠⑶31單克隆抗體，置于旋轉(zhuǎn)搖床于4° C孵育過夜， 用磁珠清洗液洗去未結(jié)合抗體，將結(jié)合有CD31抗體的磁珠重懸于250 μ 1磁珠清洗液，力口 入所述的10 ml樣品緩沖液，置于旋轉(zhuǎn)搖床，于20° C孵育30 min，使細(xì)胞與⑶31免疫磁珠 結(jié)合為細(xì)胞-抗體-磁珠復(fù)合物。
[0031] 利用KingFisher 96磁珠分選純化系統(tǒng)將細(xì)胞-抗體-磁珠復(fù)合物與未結(jié)合的細(xì) 胞和磁珠分離，程序設(shè)置為：慢速混合30 s，收集2次，每次5 s ;重復(fù)4次，細(xì)胞-抗體-磁 珠復(fù)合物釋放于含5%胎牛血清、I mM氯化鈣和4 mM氯化鎂的DMEM培養(yǎng)基。每I ml毫升 細(xì)胞-抗體-磁珠復(fù)合物中加入4 μ L釋放緩沖液，室溫孵育15 min，利用KingFisher 96 磁珠分選純化系統(tǒng)除去釋放的磁珠，程序設(shè)置為：中速混合I min，收集2次、每次I s，中速 釋放3 s ;重復(fù)1次，獲得去除磁珠的⑶31+細(xì)胞，1000 rpm離心10 min,沉淀細(xì)胞團(tuán)重懸 于完全培養(yǎng)基重懸，按I X IO5個/mL密度接種培養(yǎng)。
[0032] 接種培養(yǎng)細(xì)胞每3天換一次完全培養(yǎng)基，至亞匯合狀態(tài)，用EDTA-胰蛋白酶溶液消 化脫壁和傳代，傳代密度為IX IO5個/mL。
[0033] 3.培養(yǎng)結(jié)果。
[0034] 原代培養(yǎng)的高純度⑶31+肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞在接種7天后生長至匯合狀態(tài)，細(xì)胞 呈短梭形或多角形，細(xì)胞核明顯，匯合后呈典型的"鵝卵石樣"外觀，單層鑲嵌狀排列生長， 見圖1。傳代培養(yǎng)后，5-7天再次生長至匯合狀態(tài)，具有良好的生長性能。
[0035] 圖1體外培養(yǎng)生長亞匯合狀態(tài)的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(標(biāo)尺為200 μ m)
【權(quán)利要求】
1. 一種從大鼠肺組織中分離、純化微血管內(nèi)皮細(xì)胞的方法，其特征在于：所述的方法 主要涉及動物肺組織的單細(xì)胞懸液的制備和⑶31+細(xì)胞的免疫磁珠分選，與傳統(tǒng)肺組織微 血管內(nèi)皮細(xì)胞分離純化方法比較具有純度高的特點。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從動物肺組織中分離、純化微血管內(nèi)皮細(xì)胞的方法，其 特征在于該方法包括以下步驟： A. 將大乳鼠斷頸處死，剖開胸腔，右心室灌注Hank' s液，無菌取出肺臟，剔除臟胸膜， 剪取肺邊緣組織，去除大血管，剪碎為小塊；所述右心室灌注Hank's液于4° C預(yù)冷，灌注至 肺臟發(fā)白；所述剪碎為小塊的體積約為I mm3 ; B. 將所述肺組織小塊用Hank's液漂洗，加入消化液中消化；所述的消化液為0. 2%膠 原酶II和0. 1%中性蛋白酶混合溶液，消化溫度為37°C，消化時間為2(T30 min ; 將所述消化后的溶液過200目細(xì)胞篩，收集濾液離心，沉淀細(xì)胞團(tuán)用0.01 M PBS重懸 為單細(xì)胞懸液；所述離心處理，轉(zhuǎn)速為80(Tl200 rpm，時間為5?10 min;所述0.01 M PBS含 有0. 1%牛血清白蛋白、2 mM EDTA ;所述的單細(xì)胞懸液密度為IX IO7個/mL ; C. 將所述的單細(xì)胞懸液中加入CD31免疫磁珠，孵育得到細(xì)胞-抗體-磁珠復(fù)合物； 所述的CD31免疫磁珠為CD31單克隆抗體與磁珠孵育結(jié)合獲得，溫度為4° C，時間為過 夜，密度為4 X IO8個/mL，每毫升單細(xì)胞懸液加⑶31免疫磁珠25 μ L ;所述的孵育處理，置 于旋轉(zhuǎn)搖床，溫度為15?25°C，時間為3(T60 min ; D. 將所述的細(xì)胞-抗體-磁珠復(fù)合物從未結(jié)合磁珠和細(xì)胞中分離；所述的分離處理使 用KingFisher 96磁珠分選純化系統(tǒng)，程序設(shè)置為：慢速混合30 s，收集2次，每次5 s ;重 復(fù)4次，細(xì)胞-抗體-磁珠復(fù)合物釋放于含5%胎牛血清、I mM氯化鈣和4 mM氯化鎂的DMEM 培養(yǎng)基； E. 將所述的細(xì)胞-抗體-磁珠復(fù)合物懸浮液中加入釋放緩沖液去除細(xì)胞表面結(jié)合的 磁珠；所述釋放緩沖液為DNase I溶液，每毫升細(xì)胞懸液加4 μ L，溫度為室溫，作用時間為 10~20 min ;所述去除磁珠用KingFisher 96磁珠分選純化系統(tǒng)，程序設(shè)置為：中速混合1 min，收集2次、每次I s，中速釋放3 s ;重復(fù)1次； F. 將所述去除磁珠的CD31+細(xì)胞離心，用完全培養(yǎng)基重懸，接種孵育培養(yǎng)；所述的離 心處理，轉(zhuǎn)速為80(Tl200 rpm，時間為5~10 min ;所述的完全培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基，含20% 胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、100 IU青霉素和100 μ g/mL鏈霉素；所述的接種培養(yǎng)細(xì)胞密 度為I X IO5個/mL ; G. 所述的接種培養(yǎng)細(xì)胞每3天換一次完全培養(yǎng)基，至亞匯合狀態(tài)時傳代培養(yǎng)；所述的 傳代培養(yǎng)用含〇. 05%胰蛋白酶和0. 005% EDTA的0. 01 M PBS溶液消化脫壁，傳代密度為 lX105f/mL。
【文檔編號】C12N5/071GK104371968SQ201410285772
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年6月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月25日
【發(fā)明者】張濤, 姜代勛, 穆祥 申請人:北京農(nóng)學(xué)院