專利名稱：一種大鼠遠端肺動脈內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細胞培養(yǎng)方法，尤其是一種大鼠遠端肺動脈內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)方法， 屬生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
肺動脈內(nèi)皮細胞，尤其是遠端肺動脈為內(nèi)皮細胞，是研究肺循環(huán)相關(guān)疾病、尤其是 肺動脈高壓等疾病發(fā)病機制的重要細胞材料。目前培養(yǎng)肺動脈內(nèi)皮細胞的方法包括酶消 化法和組織塊貼片法，動物來源多為牛、豬等大型動物，成本較高、動物質(zhì)量難以控制 且來源較少，而且組織貼片法培養(yǎng)細胞尚有周期較長、成功率較低的缺點。而大鼠作為 目前生命科學(xué)研究領(lǐng)域最常見、最實用、最方便的實驗動物，關(guān)于以大鼠遠端肺動脈為 內(nèi)皮細胞來源的細胞培養(yǎng)方法卻鮮有報道，分析原因主要有以下原因1、大鼠體形較 小，心肺組織更小，用常規(guī)分離牛、豬等大型動物遠端肺動脈的方法來分離大鼠的遠端 肺動脈難度太大、不易成功2.分離到的大鼠遠端肺動脈太細，用常規(guī)的大血管酶灌注 消化法來培養(yǎng)大鼠遠端肺動脈內(nèi)皮細胞根本行不通。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種大鼠遠端肺動脈內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)方法。該培養(yǎng)方法技術(shù)穩(wěn) 定，重復(fù)性好，培養(yǎng)的細胞形態(tài)均一，生長良好，且具有典型的遠端肺動脈內(nèi)皮細胞形 態(tài)及特點。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的-
一種大鼠遠端肺動脈內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)方法，它包括以下步驟組成
(1) 獲取遠端肺動脈從健康大鼠心肺組織中獲取遠端肺動脈；
(2) 獲取原代培養(yǎng)的大鼠遠端肺動脈內(nèi)皮細胞從取得的遠端肺動脈中提取遠端肺 動脈內(nèi)皮細胞，并進行原代細胞培養(yǎng)，獲得原代培養(yǎng)的大鼠遠端肺動脈內(nèi)皮細胞；
(3) 獲取傳代培養(yǎng)的大鼠遠端肺動脈內(nèi)皮細胞:將步驟(2)中得到的原代細胞用PBS 溶液清洗后，加入0.3 0. 5ml 0. 1% 0.2%胰蛋白酶溶液20 37'C消化2 3分鐘， 當(dāng)細胞出現(xiàn)回縮、細胞間隙增大時，吸除胰蛋白酶溶液，加入3 5ml混合培養(yǎng)液，使之形成細胞懸浮液，接種于新的培養(yǎng)瓶中，每2天換液一次，至細胞生長至對數(shù)生長期, 即完成傳代細胞培養(yǎng)，獲得傳代培養(yǎng)的大鼠遠端肺動脈內(nèi)皮細胞。
所述步驟(3)中的混合培養(yǎng)液為含100U/ml的青霉素、100U/ml的鏈霉素和5% 10%胎牛血清的PMRI 1640培養(yǎng)基。
步驟(3)所述的胰蛋白酶溶液中含有0. 1%EDTA,所述的細胞接種密度為1 2X105 個/ml，以保持細胞生長有足夠的空間、營養(yǎng)。
所述的步驟(l)中從健康大鼠心肺組織中獲取遠端肺動脈的具體歩驟為
a、 取經(jīng)腹腔注射150mg/kg戊巴比妥鈉麻醉的大鼠心肺組織，用冊SS平衡鹽溶液 洗除血污；
b、 將步驟a所得的心肺組織置于顯微鏡下，用顯微鑷和顯微剪刀于顯微鏡下小心 分離遠端肺動脈；
c、 用鈍頭針灸針沿步驟b所得肺動脈的遠端開口縱向穿過肺動脈，當(dāng)遠端開口到 達針灸針柄時用顯微鑷從肺動脈的近端開口將肺動脈翻轉(zhuǎn)固定于針灸針柄，暴露內(nèi)皮， 兩端用細銅絲結(jié)扎，剪斷針灸針，獲取翻轉(zhuǎn)固定于針灸針柄上的遠端肺動脈。
其中，步驟a所述的朋SS平衡鹽溶液為1000ml三蒸水中加入7. 6g氯化鈉、0. 38g 氯化鉀、0. 25g氯化鎂、1.8g葡萄糖和2.24gHEPES (羥乙基哌嗪乙硫磺酸)配制而成。
步驟c中的針灸針的針體直徑為0. 22mm，針體長度為40mm。
所述的步驟(2)中獲得原代培養(yǎng)的大鼠遠端肺動脈內(nèi)皮細胞的具體步驟為
1) 將所得的肺動脈置于0. 3 0. 5ml消化液中，35 37'C消化3 5分鐘；
2) 向步驟1)的消化液中加入lml混合培養(yǎng)液后離心，800 1000r/min離心5-8 分鐘，分離出內(nèi)皮細胞團置于混合培養(yǎng)液T中，制成細胞懸浮液；
3) 將步驟2)所得細胞懸浮液調(diào)整細胞密度至1 5X104個/mi，用該細胞懸浮液 以懸浮液的細胞密度為接種密度接種于細胞培養(yǎng)瓶中，置于37'C、 5%二氧化碳孵箱中 培養(yǎng)，每2天換液一次，至細胞生長至對數(shù)生長期，即完成原代細胞培養(yǎng)，獲得原代培 養(yǎng)的大鼠遠端肺動脈內(nèi)皮細胞。
所述步驟l)中的消化液為5ml冊SS平衡鹽溶液中加入31mg I型膠原酶、2mg木 瓜酶、10mg牛血清白蛋白和0. 7mg 二硫蘇糖醇配制而成。
所述的步驟2)中的混合培養(yǎng)液為含lOOUAil的青霉素、100U/ml的鏈霉素和20 X胎牛血清的PMRI 1640培養(yǎng)基。
本發(fā)明方法與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下有益效果
(1) 是借助顯微鏡、顯微鑷、顯微剪及針灸針等精細工具突破了運用酶消化法培養(yǎng) 小動物遠端肺動脈內(nèi)皮細胞的技術(shù)難關(guān)，填補了該領(lǐng)域空白。
(2) 是動物來源為常見實驗動物大鼠，避免了以往使用牛、豬等大型動物而標(biāo)本不 易獲得、動物質(zhì)量難以控制、成本較高的缺點。
(3) 是肺動脈內(nèi)皮細胞的取材部位位于大鼠肺內(nèi)遠端肺動脈，避免了以往多取材于 牛、豬、兔等近端肺動脈的缺點。
(4) 是培養(yǎng)方法技術(shù)穩(wěn)定，重復(fù)性好，培養(yǎng)的細胞形態(tài)均一，生長良好。
(5) 獲得的細胞具有典型的遠端肺動脈內(nèi)皮細胞形態(tài)及特點，為進一步深入研究肺 循環(huán)相關(guān)疾病、小血管相關(guān)疾病，尤其是肺動脈高壓等疾病的發(fā)病機制奠定了條件，提 供了豐富的材料來源。


圖1是顯微鏡(100X)下遠端肺動脈內(nèi)皮細胞；
圖2是顯微鏡(200 X)下遠端肺動脈內(nèi)皮細胞；
圖3是共聚集熒光顯微鏡(200X)下遠端肺動脈內(nèi)皮細胞核周胞漿中出現(xiàn)黃綠色的 陽性熒光反應(yīng)；
圖4是透射電鏡(16000X)下遠端肺動脈內(nèi)皮細胞具有Webel-Palade小體(W-P小 體)、微絲及吞飲小泡等特征性結(jié)構(gòu)；
圖5是透射電鏡(20000X)下遠端肺動脈內(nèi)皮細胞具有Webel-Palade小體(W-P小 體)、微絲及吞飲小泡等特征性結(jié)構(gòu)。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于 此，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明
上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
實施例一-具體步驟
1、 主要實驗材料
(1) 、動物來源大鼠可用6 8周齡的SD大鼠。
(2) 、 HBSS平衡鹽溶液.-1000ml三蒸水中加入7.6g氯化鈉、0. 38g氯化鉀、0. 25g 氯化鎂、1.8g葡萄糖和2.24gHEPES，實驗前24小時配制并過濾除菌。
(3) 、消化液5mlHBSS平衡鹽溶液中加入31rag I型膠原酶、2mg木瓜酶、10mg 牛血清白蛋白和0. 7mg 二硫蘇糖醇配制而成。
(4) 、混合培養(yǎng)液I:含20% (ml胎牛血清/100ml培養(yǎng)基)胎牛血清(Gibco， USA) 的PMRI 1640培養(yǎng)基(Gibco， USA)，并含有100U/ml的青霉素和100U/ml的鏈霉素。
(5) 、混合培養(yǎng)液II:含5% 10% (ml胎牛血清/100ml培養(yǎng)基)胎牛血清(Gibco， USA)的PMRI 1640培養(yǎng)基(Gibco， USA),并含有100U/ml的青霉素和100U/ral的鏈霉 素。 .
(6) 、針灸針為國產(chǎn)(蘇州天一針灸器械有限公司)，針體直徑為0. 22mm，針體長 度為40mm。
2、 操作步驟
(1) 、獲取大鼠遠端肺動脈
1) 稱重大鼠，腹腔注射戊巴比妥鈉(150mg/kg)麻醉大鼠，無菌條件下取大鼠心 肺組織，用HBSS平衡鹽溶液洗除血污；
2) 將心肺組織置于外科顯微鏡下，用顯微鑷和顯微剪刀于顯微鏡下小心分離遠端 肺動脈； '
3) 用鈍頭針灸針沿肺動脈的遠端開口縱向穿過肺動脈，當(dāng)遠端開口到達針灸針柄 時用顯微鑷從肺動脈的近端開口將肺動脈翻轉(zhuǎn)固定于針灸針柄，暴露內(nèi)皮，兩端用細銅 絲結(jié)扎，剪斷針灸針，獲取翻轉(zhuǎn)固定于針灸針柄上的遠端肺動脈；
其中，歩驟1)中的朋SS平衡鹽溶液為
(2) 、獲取原代培養(yǎng)的大鼠遠端肺動脈內(nèi)皮細胞
1) 將翻轉(zhuǎn)后暴露內(nèi)皮的遠端肺動脈置于0.5ml消化液中，37'C消化5分鐘；
2) 消化液中加入lml混合培養(yǎng)液I后離心，1000r/min離心8分鐘，分離出內(nèi)皮 細胞團置于混合培養(yǎng)液I中，制成細胞懸浮液；
3) 調(diào)整細胞懸浮液細胞密度至1X104個/ml，并以該細胞密度為接種密度接種于 細胞培養(yǎng)瓶中，置于37'C、 5%二氧化碳孵箱中培養(yǎng)，每2天換液一次，至細胞生長至 對數(shù)生長期，獲得原代培養(yǎng)的大鼠遠端肺動脈內(nèi)皮細胞；
(3)、獲取傳代培養(yǎng)的大鼠遠端肺動脈內(nèi)皮細胞
當(dāng)原代細胞長滿瓶壁后，即可傳代。屆時，用2mlPBS溶液清洗細胞2次，加入0. 5ml 0.2X(m/v)胰蛋白酶溶液(含O. 1%EDTA) 37。C消化3分鐘，當(dāng)細胞出現(xiàn)回縮、細胞間 隙增大時，吸除胰蛋白酶溶液，加入5ml混合培養(yǎng)液I1，輕輕吹打瓶壁上的細胞，使之 形成細胞懸浮液，以2X105個/ml的細胞密度接種于新的培養(yǎng)瓶中，置于37t、 5%二 氧化碳孵箱中培養(yǎng)，每2天換液一次，至細胞生長至對數(shù)生長期，獲得傳代培養(yǎng)的大鼠 遠端肺動脈內(nèi)皮細胞。
3、培養(yǎng)結(jié)果
(1) 、在倒置相差顯微鏡下觀察，遠端肺動脈內(nèi)皮細胞呈扁平的短梭形或多角形， 細胞大小均一，胞核清晰，呈卵圓形。有核的區(qū)域較無核的區(qū)域突出，細胞呈典型的單 層"鵝卵石樣"或"鋪路石樣"鑲嵌狀排列生長。見圖1 (100X)和i 2 (200X)。
(2) 、第VI因子相關(guān)抗原的免疫熒光檢測將細胞接種在蓋玻片上，用免疫熒光方 法染色，遠端肺動脈內(nèi)皮細胞核周胞漿中出現(xiàn)黃綠色的陽性熒光反應(yīng)。見圖3 (200X )。
(3) 、透射電鏡檢測透射電鏡下觀察到遠端肺動脈內(nèi)皮細胞具有Webel-Palade小 體(W-P小體)、微絲及吞飲小泡等特征性結(jié)構(gòu)(箭頭所示)。見圖4 (16000X)和圖 5 (20000X)。
實施例二
與實施例一不同的是操作步驟中的步驟(2)和步驟(3)中的技術(shù)參數(shù)不同 (2)、獲取原代培養(yǎng)的大鼠遠端肺動脈內(nèi)皮細胞
1) 將翻轉(zhuǎn)后暴露內(nèi)皮的遠端肺動脈置于0.3ml消化液中，35'C消化3分鐘；
2) 消化液中加入lml混合培養(yǎng)液I后離心，800r/min離心5分鐘，分離出內(nèi)皮細胞團置于混合培養(yǎng)液I中，制成細胞懸浮液；
3)調(diào)整細胞懸浮液細胞密度至3X104個/ml，并以該細胞密度為接種密度接種于 細胞培養(yǎng)瓶中，置于37'C、 5%二氧化碳孵箱中培養(yǎng)，每2天換液一次'，至細胞生長至 對數(shù)生長期，獲得原代培養(yǎng)的大鼠遠端肺動脈內(nèi)皮細胞；
(3)、獲取傳代培養(yǎng)的大鼠遠端肺動脈內(nèi)皮細胞
當(dāng)原代細胞長滿瓶壁后，即可傳代。屆時，用2mlPBS溶液清洗細胞2次，加入0. 3ml 0. 1X(m/v)胰蛋白酶溶液(含O. 1%EDTA) 20'C消化3分鐘，當(dāng)細胞出現(xiàn)回縮、細胞間 隙增大時，吸除胰蛋白酶溶液，加入3ml混合培養(yǎng)液n，輕輕吹打瓶壁上的細胞，使之 形成細胞懸浮液，以1X105個/ml的細胞密度接種于新的培養(yǎng)瓶中，置于37。C、 5%二 氧化碳孵箱中培養(yǎng)，每2天換液一次，至細胞生長至對數(shù)生長期，獲得傳代培養(yǎng)的大鼠 遠端肺動脈內(nèi)皮細胞。 .
實施例三
與實施例一不同的是操作步驟中的步驟(2)和步驟(3)中的技術(shù)參數(shù)不同-
(2) 、獲取原代培養(yǎng)的大鼠遠端肺動脈內(nèi)皮細胞
1) 將翻轉(zhuǎn)后暴露內(nèi)皮的遠端肺動脈置于0.4ml消化液中，36'C消化4分鐘；
2) 消化液中加入lml混合培養(yǎng)液I后離心，900r/min離心7分鐘，分離出內(nèi)皮細 胞團置于混合培養(yǎng)液I中，制成細胞懸浮液；
3) 調(diào)整細胞懸浮液細胞密度至5Xl(T個/ml，并以該細胞密度為接種密度接種于 細胞培養(yǎng)瓶中，置于37'C、 5%二氧化碳孵箱中培養(yǎng)，每2天換液一次，至細胞生長至 對數(shù)生長期，獲得原代培養(yǎng)的大鼠遠端肺動脈內(nèi)皮細胞；
(3) 、獲取傳代培養(yǎng)的大鼠遠端肺動脈內(nèi)皮細胞
當(dāng)原代細胞長滿瓶壁后，即可傳代。屆時，用2mlPBS溶液清洗細胞2次，加入0. 4ml 0. 15% (m/v)胰蛋白酶溶液(含0. 1%EDTA) 35。C消化2分鐘，當(dāng)細胞出現(xiàn)回縮、細胞間 隙增大時，吸除胰蛋白酶溶液，加入4ml混合培養(yǎng)液n，輕輕吹打瓶壁上的細胞，使之 形成細胞懸浮液，以1.5XlCf個/ml細胞密度接種于新的培養(yǎng)瓶中，置于37'C、 5%二 氧化碳孵箱中培養(yǎng)，每2天換液一次，至細胞生長至對數(shù)生長期，獲得傳代培養(yǎng)的大鼠 遠端肺動脈內(nèi)皮細胞。 .
權(quán)利要求
1、一種大鼠遠端肺動脈內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)方法，它包括以下步驟組成(1)獲取遠端肺動脈從健康大鼠心肺組織中獲取遠端肺動脈；(2)獲取原代培養(yǎng)的大鼠遠端肺動脈內(nèi)皮細胞從取得的遠端肺動脈中提取遠端肺動脈內(nèi)皮細胞，并進行原代細胞培養(yǎng)，獲得原代培養(yǎng)的大鼠遠端肺動脈內(nèi)皮細胞；(3)獲取傳代培養(yǎng)的大鼠遠端肺動脈內(nèi)皮細胞將步驟(2)中得到的原代細胞用PBS溶液清洗后，加入0.3～0.5ml 0.1％～0.2％胰蛋白酶溶液20～37℃消化2～3分鐘，當(dāng)細胞出現(xiàn)回縮、細胞間隙增大時，吸除胰蛋白酶溶液，加入3～5ml混合培養(yǎng)液，使之形成細胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶中，每2天換液一次，至細胞生長至對數(shù)生長期，即完成傳代細胞培養(yǎng)，獲得傳代培養(yǎng)的大鼠遠端肺動脈內(nèi)皮細胞。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的大鼠遠端肺動脈內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)方法，其特征在于所 述步驟(3)中的混合培養(yǎng)液為含100U/ml的青霉素、100U/ml的鏈霉素和5 10%胎牛 血清的PMRI 1640培養(yǎng)基。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的大鼠遠端肺動脈內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)方法，其特征在于步 驟(3)所述的胰蛋白酶溶液中含有0. 1 %的EDTA。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的大鼠遠端肺動脈內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)方法，其特征在于步 驟(3)中所述的細胞接種密度為1 2X105個/ml。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的大鼠遠端肺動脈內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的步驟(l)中從健康大鼠心肺組織中獲取遠端肺動脈的具體步驟為a、 取經(jīng)腹腔注射150mg/kg戊巴比妥鈉麻醉的大鼠心肺組織，用HBSS平衡鹽溶液 洗除血污；b、 將步驟a所得的心肺組織置于顯微鏡下，用顯微鑷和顯微剪刀f顯微鏡下小心 分離遠端肺動脈；c、 用鈍頭針灸針沿步驟b所得肺動脈的遠端開口縱向穿過肺動脈，當(dāng)遠端開口到 達針灸針柄時用顯微鑷從肺動脈的近端開口將肺動脈翻轉(zhuǎn)固定于針灸針柄，暴露內(nèi)皮， 兩端用細銅絲結(jié)扎，剪斷針灸針，獲取翻轉(zhuǎn)固定于針灸針柄上的遠端肺動脈。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的大鼠遠端肺動脈內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)方法，其特征在于步 驟a所述的HBSS平衡鹽溶液為1000ml三蒸水中加入7. 6g氯化鈉、0. 38g氯化鉀、0. 25g 氯化鎂、1. 8g葡萄糖和2. 24gHEPES配制而成。
7、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的大鼠遠端肺動脈內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)方法，其特征在于步 驟c中的針灸針的針體直徑為0. 22ram，針體長度為40mm。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的大鼠遠端肺動脈內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)方法，其特征在于所 述的步驟(2)中獲得原代培養(yǎng)的大鼠遠端肺動脈內(nèi)皮細胞的具體步驟為1) 將所得的肺動脈置于0. 3 0. 5ml消化液中，35 37'C消化3 5分鐘；2) 向步驟1)的消化液中加入lml混合培養(yǎng)液后離心，800 1000r/min離心5-8 分鐘，分離出內(nèi)皮細胞團置于混合培養(yǎng)液中，制成細胞懸液；3) 將步驟2)所得細胞懸液調(diào)整細胞密度至1 5Xl04個/ml，用該細胞懸浮液以 懸浮液的細胞密度為接種密度接種于細胞培養(yǎng)瓶中，置于37'C、 5%二氧化碳孵箱中培 養(yǎng)，每2天換液一次，至細胞生長至對數(shù)生長期，即完成原代細胞培養(yǎng)，獲得原代培養(yǎng) 的大鼠遠端肺動脈內(nèi)皮細胞。 .
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的大鼠遠端肺動脈內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)方法，其特征在于所 述步驟1)中的消化液為在5mlHBSS平衡鹽溶液中加入31mg I型膠原酶、2mg木瓜酶、 10mg牛血清白蛋白和0. 7mg 二硫蘇糖醇配制而成。
10、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的大鼠遠端肺動脈內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)方法，其特征在于所 述的步驟2)中的混合培養(yǎng)液為含100U/ml的青霉素、100U/ml的鏈霉素和20%胎牛 血清的PMRI 1640培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種大鼠遠端肺動脈內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)方法，其包括以下步驟(1)從健康大鼠心肺組織中獲取遠端肺動脈；(2)從該遠端肺動脈中提取遠端肺動脈內(nèi)皮細胞，并進行原代細胞培養(yǎng)，獲得原代培養(yǎng)的大鼠遠端肺動脈內(nèi)皮細胞；(3)將步驟(2)中得到的原代細胞用PBS溶液清洗后，加入0.3～0.5ml 0.1％～0.2％胰蛋白酶溶液20℃～37℃消化2～3分鐘，當(dāng)細胞出現(xiàn)回縮、細胞間隙增大時，吸除胰蛋白酶溶液，加入5ml混合培養(yǎng)液Ⅱ，輕輕吹燈瓶壁上的細胞，使之形成細胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶中，每2天換液一次，至細胞生長至對數(shù)生長期，即完成傳代細胞培養(yǎng)。本發(fā)明方法為進一步深入研究肺循環(huán)相關(guān)疾病、小血管等相關(guān)疾病發(fā)病機制奠定了條件，提供了豐富的材料來源。
文檔編號C12N5/06GK101195815SQ20071003211
公開日2008年6月11日 申請日期2007年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月5日
發(fā)明者冉丕鑫, 盧文菊, 彭公永, 幸 文, 冰 李, 李曉巖, 城 洪, 健 王, 胡錦興 申請人:廣州醫(yī)學(xué)院