一種橡膠樹開花調(diào)控蛋白HbTFL1-1及其編碼基因與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種橡膠樹開花調(diào)控蛋白HbTFLl-I及 其編碼基因與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] TFLl/CEN-like基因廣泛存在于開花植物中，是一類非常重要的開花抑制者。它們 通過抑制FT基因的下游花器官決定基因 APl和LFY基因，實(shí)現(xiàn)抑制開花的目的。
[0003] 在擬南芥tfll突變體中，擬南芥營養(yǎng)生長期顯著縮短，同時花序從無限花序 轉(zhuǎn)變?yōu)榻K端花序。因此證明擬南芥T F L1基因具有同時調(diào)控營養(yǎng)生長和花序發(fā)育的功 會泛(Bradley D, Ratcliffe 0，Vincent C, Carpenter R，Coen E(1997)Inflorescence commitment and architecture in Arabidopsis. Science 275:80 - 83)。在碗豆中，兩 個TFLl-Iike基因被證明調(diào)控豌豆兩個不同的發(fā)育階段，LF基因調(diào)控維持頂端分生組織 的不確定性，而DET基因則調(diào)控花序分生組織的不確定性。因此，在lf/DET植株中，開花 期提前，但是花序的發(fā)育沒有受到影響；在LF/det植株中，開花期沒有受到影響，但花序 由無限花序轉(zhuǎn)變?yōu)榻K端花序；在lf/det雙突變植株中，表型就像擬南芥tfll突變體一 樣，營養(yǎng)生長期和花序發(fā)育都受到嚴(yán)重影響（Foucher F，Morin J，Courtiade J，Cadioux S, Ellis N, Banfield M J, Rameau C(2003)DETERMINATE and LATE FLOWERING are two TERMINAL FL0WER1/CENTR0RADIALIS homologs that control two distinct phases of flowering initiation and development in pea. Plant Celll5:2742 - 2754)〇 而 CEN 基因，最早發(fā)現(xiàn)于模式植物金魚草中，它有非常強(qiáng)的組織表達(dá)特異性，當(dāng)花序分生組織形成 不久就開始表達(dá)，并隨著花序的發(fā)育而逐漸增強(qiáng)。金魚草cen突變體植株表現(xiàn)出花序從 無限花序轉(zhuǎn)變?yōu)榻K端花序，但營養(yǎng)生長沒有受到影響，由此說明CEN在金魚草中調(diào)控著花 序發(fā)育并維持花序分生組織不確定性（Bradley D，Carpenter R，Copsey L，Vincent C， Rothstein S，Coen E (1996)Control of inflorescence architecture in Antirrhinum. Nature379:791-797.)。而在另一個模式植物煙草中，CET2/CET4卻表現(xiàn)出不同的表達(dá) 模式，Amaya等（1999)研究表明它們只在處于營養(yǎng)生長的側(cè)芽中高表達(dá)，當(dāng)煙草進(jìn)入開 花時期，它們的表達(dá)受到NFL基因抑制并逐漸降低。說明CET2/CET4對營養(yǎng)器官發(fā)育的 維持有非常重要的作用（Amaya I，Ratcliffe 0 J，Bradley D J(1999)Expression of CENTRORADIALIS(CEN)and CEN-Iike genes in tobacco reveals a conserved mechanism controlling phase change in diverse species. Plant Cell 11:1405 - 1418)。
[0004] 以上研究結(jié)果表明，TFLl/CEN-like基因?qū)χ参餇I養(yǎng)生長和/或生殖發(fā)育的調(diào)控 起著非常重要的作用。巴西橡膠樹有著長達(dá)5-8年的營養(yǎng)生長期，研究不同TFLl/CEN-like 基因在橡膠樹中的機(jī)理有助于對橡膠樹生長期進(jìn)行有效調(diào)控。目前，在巴西橡膠樹中，尚未 有關(guān)TFLl/CEN-like基因的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種橡膠樹開花調(diào)控蛋白 HbTFLl-I及其編碼基因與應(yīng)用。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種橡膠樹開花調(diào)控蛋白HbTFLl-Ι，其氨 基酸序列如SEQ ID No. 3所示。
[0007] 本發(fā)明還提供了所述蛋白的編碼基因。
[0008] 進(jìn)一步地，其核苷酸序列為SEQ ID No. 1中的191bp~712bp所示。
[0009] 本發(fā)明還提供了一種來自橡膠樹的開花調(diào)控基因 HbTFLl-Ι，其cDNA序列如SEQ ID No. 1 所示。
[0010] 進(jìn)一步地，其DNA序列如SEQ ID No. 2所示。
[0011] 本發(fā)明還提供了含有前述編碼基因的載體。
[0012] 本發(fā)明還提供了含有前述載體的工程菌。
[0013] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了前述編碼基因與前述基因在延遲植株開花方面的應(yīng)用。
[0014] 進(jìn)一步地，所述應(yīng)用為將所述工程菌侵染植株，獲得開花期延遲的轉(zhuǎn)基因植株。
[0015] 主要特征表現(xiàn)在輪座葉和主枝節(jié)點(diǎn)數(shù)明顯增多，花器官出現(xiàn)缺失，導(dǎo)致角果異常， 結(jié)實(shí)率降低。最嚴(yán)重的可引起轉(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)不開花表型。
[0016] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0017] 本發(fā)明首次公開了 5個開花調(diào)控基因，即TFLl/CEN-like同源基因，它們在橡膠樹 營養(yǎng)器官中有著不同的表達(dá)模式：
[0018] 1)對于TFLl-Iike同源基因來說，HbTFLl-I主要在根和穩(wěn)定葉中表達(dá)，HbTFLl-2 主要在根中特異表達(dá)，而HbTFLl-3則在莖和頂端分生組織中表達(dá)。另外它們有一個共同的 表達(dá)特點(diǎn)，就是在開花期（每年的3月份），3個基因在處于生殖生長階段植株中的各自的 營養(yǎng)器官中的表達(dá)明顯低于處于童期營養(yǎng)生長的植株。在花序發(fā)育過程中，3個基因的表達(dá) 都隨著花序的發(fā)育而逐漸升高，但在開花的雄花和雌花中卻表現(xiàn)著不同的相對表達(dá)量，其 中，HbTFLl-I在雄花和雌花中表達(dá)差不多，HbTFLl-2在雌花中表達(dá)明顯高于在雄花中的表 達(dá)；而HbTFLl-3則在雄花中的表達(dá)非常顯著的高于雌花中的表達(dá)。
[0019] 2)對于CEN-Iike同源基因來說，它們在橡膠樹營養(yǎng)器官中有著類似的表達(dá)模式， 但不完全相同。在3個月大小苗中二者主要在根、莖和芽中表達(dá)。在生長發(fā)育過程中，二者 表現(xiàn)出的表達(dá)趨勢分為三種。第一，在根中，二者都隨著年齡增加表達(dá)逐漸降低，在2年樹 中降低為零。第二，在莖中，二者表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢；在芽中，HbCENl表現(xiàn)出先升 高后降低的表達(dá)趨勢，而HbCEN2則表現(xiàn)出隨著年齡增加逐漸降低的趨勢。在花序發(fā)育過程 中，二者表現(xiàn)出相似的表達(dá)模式，即隨著花序的發(fā)育它們的表達(dá)逐漸降低，尤其是HbCENl， 表達(dá)趨勢非常明顯。
[0020] 另外，分別將5個基因分別轉(zhuǎn)入野生型擬南芥中，轉(zhuǎn)基因植株比野生型植株在營 養(yǎng)生長期和花期都有明顯的延長。主要特征表現(xiàn)為輪座葉和主枝節(jié)點(diǎn)數(shù)明顯增多，花器官 出現(xiàn)缺失，導(dǎo)致角果異常，結(jié)實(shí)率降低。最嚴(yán)重的可引起轉(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)不開花表型。再將 5個基因分別轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)入tfll-Ι突變體中，結(jié)果，5個基因皆能有效地將tfll-Ι突變表型恢 復(fù)為野生型表型，有些還出現(xiàn)了嚴(yán)重的延遲營養(yǎng)生長期和花期的表型，更有甚者出現(xiàn)了不 開花現(xiàn)象。
[0021] 因此，這5個基因可作為巴西橡膠樹開花調(diào)控的重要候選基因，通過對巴西橡膠 樹的遺傳轉(zhuǎn)化有望實(shí)現(xiàn)對巴西橡膠樹花期調(diào)控。同樣，也可在其他農(nóng)作物中應(yīng)用，解決近緣 種或者不同品種雜交時花期不育帶來的一系列問題，另外也可對生育期進(jìn)行調(diào)控。
【附圖說明】
[0022] 圖1為3個TFLl-Iike基因組織特異性表達(dá)和時空表達(dá)分析。其中A為HbTFLl-I 基因時空表達(dá)模式分析；B為HbTFLl-2基因時空表達(dá)模式分析；C為HbTFLl-3基因時空表 達(dá)模式分析。
[0023] 圖2為2個CEN-Iike基因組織特異性表達(dá)和時空表達(dá)分析。其中A為HbCENl基 因時空表達(dá)模式分析；B為HbCEN2基因時空表達(dá)模式分析。
[0024] 圖3為3個TFLl-Iike基因在花序5個不同發(fā)育階段的表達(dá)分析。I，第一發(fā)育階 段的花序；II，第二發(fā)育階段的花序；III，第三發(fā)育階段的花序；IV，第四發(fā)育階段的花序； V，第五發(fā)育階段的花序；A為HbTFLl-I基因表達(dá)分析；B為HbTFLl-2基因表達(dá)分析；C為 HbTFL 1-3基因表達(dá)分析。
[0025] 圖4為2個CEN-Iike基因在花序5個不同發(fā)育階段的表達(dá)分析。I，第一發(fā)育階 段的花序；II，第二發(fā)育階段的花序；III，第三發(fā)育階段的花序；IV，第四發(fā)育階段的花序； V，第五發(fā)育階段的花序；A為HbCENl基因表達(dá)分析；B為HbCEN2基因表達(dá)分析。
[0026] 圖5為野生型擬南芥分別與轉(zhuǎn)3個TFLl-Iike基因植株開花表型比較。其中A為 野生型擬南芥與其轉(zhuǎn)HbTFLl-I基因開花表型比較；B為野生型擬南芥與其轉(zhuǎn)HbTFLl-2基 因植株開花表型比較；C為野生型擬南芥與其轉(zhuǎn)HbTFLl-3基因植株開花表型比較。
[0027] 圖6為野生型擬南芥分別與轉(zhuǎn)2個CEN-Iike基因植株開花表型比較。其中A為 野生型擬南芥與其轉(zhuǎn)HbCENl基因開花表型比較；B為野生型擬南芥與其轉(zhuǎn)HbCEN2基因植 株開花表型比較。
[0028] 圖7為擬南芥tf 11-1突變體轉(zhuǎn)化3個TFLl-Iike基因的恢復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。
[0029] 圖8為擬南芥tf 11-1突變體轉(zhuǎn)化2個CEN-Iike基因的恢復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0031 ] 實(shí)施例1巴西橡膠樹5個目標(biāo)基因的獲得
[0032] 根據(jù)中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所的橡膠樹基因組數(shù)據(jù)庫和葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù) 庫，通