一種固定化脂肪酶的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種固定化脂肪酶的方法，以氨基官能化的磁性Fe3O4@C納米粒子作為載體通過共價結(jié)合將脂肪酶固定在其表面。具體分為兩種方法：一是先利用親核反應將戊二醛一端醛基與氨基官能化的磁性Fe3O4@C納米粒子表面的氨基相結(jié)合后，再將固定在磁性Fe3O4@C納米粒子表面的戊二醛另一端醛基與脂肪酶的氨基相結(jié)合；二是利用丁二酸酐將磁性Fe3O4@C納米粒子表面的氨基轉(zhuǎn)化為羧基，再經(jīng)物質(zhì)的量比為1:0.5~2的N,N-二環(huán)己基碳二亞胺和N-羥基丁二酰亞胺混合物活化作用后，利用酰胺化反應在Fe3O4@C納米粒子表面固定脂肪酶。本發(fā)明的制備方法簡單、溫和，脂肪酶固載量多，且固定化脂肪酶酶活和酶活回收率高、穩(wěn)定性好、可簡便地循環(huán)再使用，有效降低實際生產(chǎn)成本，具有廣泛的應用前景。
【專利說明】一種固定化脂肪酶的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種固定化脂肪酶的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]脂肪酶是一類應用廣泛的酰基水解酶，它能催化酯類的水解、醇解、合成和交換等反應，現(xiàn)已廣泛應用于制藥、化工、食品加工、污水處理等行業(yè)。與傳統(tǒng)工業(yè)催化劑相比，月旨肪酶也存在許多缺陷，如:提取純化過程繁瑣，價格昂貴；對熱、強酸、強堿、有機溶劑等均不穩(wěn)定；在反應中易失活，反應后不能被回收再利用；脂肪酶中常含有雜蛋白及有色物質(zhì)，影響反應產(chǎn)物的分離純化。為了克服脂肪酶的上述不足，人們將游離脂肪酶與不溶性載體聯(lián)結(jié)起來，使之成為固定化脂肪酶，實現(xiàn)了脂肪酶的回收再利用。因此，脂肪酶催化技術(shù)的工業(yè)化很大程度上取決于脂肪酶的固定化技術(shù)的發(fā)展。
[0003]Fe3O4納米粒子是一種重要的磁性分離材料，它具有特殊的磁響應性,可借助外磁場從反應體系中快速簡便地富集、分離、回收固定化生物酶，甚至能利用外部磁場控制Fe3O4納米粒子的運動方式和方向，避免傳統(tǒng)的攪拌對酶蛋白結(jié)構(gòu)的機械損傷，有利于提高酶制劑的穩(wěn)定性，在生物工程領(lǐng)域具有極大的應用價值。盡管已有磁性Fe304、Fe304@Si02、Fe304(gchitosan納米粒子固定脂肪酶的文獻報道(Chem.Asian J., 2013, 8，1447-1454 J.Mater.Chem., 2012，22，8385-8393 ；Catal.Commun.，2011，12，717-720.)，但目前文獻報道磁性納米粒子固定脂肪酶的脂肪酶在固定化過程中損失部分催化活性，導致固定化脂肪酶酶活的回收率小 于100%，且其固定化制備過程不溫和，不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種利用氨基官能化的磁性Fe3O4OC納米粒子為載體固定脂肪酶的方法，該方法簡單、溫和，脂肪酶的固載量多，且固定化脂肪酶酶活高和酶活回收率高、穩(wěn)定性好、可簡便地循環(huán)再使用。
[0005]本發(fā)明固定化脂肪酶的制備方法，使用氨基官能化的磁性Fe3O4OC納米粒子作為載體，通過共價結(jié)合將脂肪酶固定在其表面。
[0006]上述方法包括2種具體的實現(xiàn)方式。
[0007]方式一:先利用親核反應將戊二醛一端的醛基與氨基官能化的磁性Fe3O4OC納米粒子表面的氨基相結(jié)合后，再將固定在磁性Fe3O4OC納米粒子表面的戊二醛另一端的醛基與脂肪酶的氨基相結(jié)合。
[0008]具體包括以下步驟:
1)將氨基官能化的磁性Fe3O4OC納米粒子加入到戊二醛溶液中，于25~451:條件下反應:3~24 h，所得產(chǎn)品經(jīng)磁分離、洗滌、真空干燥；
2)將步驟I)所得的產(chǎn)品加入到脂肪酶溶液中，于25~35°C條件下反應0.5~3 h，所得產(chǎn)品經(jīng)磁分離、洗滌即可。
[0009]所述的氨基官能化的磁性Fe3O4OC納米粒子與戊二醛質(zhì)量比為1: 1~5 ;所述的氨基官能化磁性Fe3O4OC納米粒子與脂肪酶的質(zhì)量比為1:0.1~0.5
[0010]所述的戊二醛溶液的濃度為10-100 g/L。
[0011]方式二:利用羧化試劑將磁性Fe3O4OC納米粒子表面的氨基轉(zhuǎn)化為羧基，再經(jīng)活化劑的作用后，利用酰胺化反應在Fe3O4OC納米粒子表面固定脂肪酶，所述的羧化劑為丁二酸酐，所述的活化劑為物質(zhì)的量比為1:0.5~2的N，N-二環(huán)己基碳二亞胺和N-羥基丁二酰亞胺混合物。
[0012]具體包括以下步驟:
1)將丁二酸酐溶于甲苯內(nèi)，再加入氨基官能化的磁性Fe3O4OC納米粒子，在氮氣氣氛中于70-100 °C條件下反應2~24 h，所得產(chǎn)品經(jīng)磁分離、洗滌、真空干燥；
2)將N，N-二環(huán)己基碳二亞胺和N-羥基丁二酰亞胺溶于二氯甲烷內(nèi)，將步驟I)所得的產(chǎn)品加入到其中，于25~50 °C條件下反應2~24 h，所得產(chǎn)品經(jīng)磁分離、洗滌、真空干燥；
3)將步驟2)所得的產(chǎn)品加入到脂肪酶溶液中，于25~35°C條件下反應0.5~3 h，所得產(chǎn)品經(jīng)磁分離、洗滌即可。
[0013]所述的氨基官能化的磁性Fe3O4OC納米粒子與丁二酸酐質(zhì)量比為1:1飛；所述的氨基官能化磁性Fe3O4OC納米粒子與N，N- 二環(huán)己基碳二亞胺的質(zhì)量比為1: f 5 ;所述的氨基官能化磁性Fe3O4OC納米粒子與脂肪酶的質(zhì)量比為1:0.1~0.5
[0014]本發(fā)明提供 的固定化脂肪酶的制備方法中，所述的脂肪酶溶液由Sigma或阿拉丁公司購買的來源于皺褶假絲酵母或豬胰腺的凍干脂肪酶粉采用ρΗ=7.0磷酸緩沖溶液配置--? 。
[0015]本發(fā)明提供的固定化脂肪酶的制備方法中，所述的氨基功能化的磁性Fe3O4OC納米粒子由下列方法所合成:
稱取2 mmol乙酰丙酮鐵加入到60 mL聚乙二醇200中，在氮氣氣氛中于270 °C反應3h后，自然冷卻至室溫，加入4 mmol葡萄糖,超聲5 min,獲得混合溶液；將上述混合溶液轉(zhuǎn)移到熱壓反應釜中，加入I mL氨水(NH3質(zhì)量百分含量，28%)后，旋緊熱壓反應釜，于240 V反應24 h;待反應結(jié)束后，自然冷卻到室溫，所得沉淀經(jīng)磁分離、洗滌、干燥后得氨基功能化的磁性Fe3O4OC納米粒子。
本發(fā)明有益效果:
1.利用氨基官能化的磁性Fe3O4OC納米粒子固定脂肪酶的制備方法簡單，條件溫和，經(jīng)濟環(huán)保；
2.磁性Fe3O4OC納米粒子在固定化過程中能穩(wěn)定脂肪酶的活性結(jié)構(gòu)，因而所得到磁性Fe3O4OC納米粒子固定化脂肪酶的酶活高，且固定化脂肪酶酶活回收率達到1349^172% ；
3.磁性Fe3O4OC納米粒子表面有豐富的氨基，可固載大量脂肪酶，因而脂肪酶的固載
量高；
4.脂肪酶通過共價結(jié)合固定在磁性Fe3O4OC納米粒子表面，因而固定化脂肪酶的穩(wěn)定性好，且可循環(huán)使用次數(shù)多，循環(huán)使用10次后，固定化脂肪酶的酶活仍然能保持50%以上；
5.固定化脂肪酶具有磁響應性，可借助外磁場從反應體系中快速簡便地富集、分離、回收固定化脂肪酶，可有效降低實際生產(chǎn)成本，具有廣泛的應用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】[0016]圖1為氨基功能化的磁性Fe3O4OC納米粒子的高分辨透射電子顯微鏡檢測圖；(a)為原始圖，(b)為局部放大圖；
圖2為固定化脂肪酶與游離脂肪酶的熱穩(wěn)定性圖。在圖2中，橫坐標為時間Time (h)，縱坐標為相對活性Relative activity (%);固定化脂肪酶和游離脂肪酶均在45 °C環(huán)境中保持相同時間((TlO h)；
圖3為固定化脂肪酶的循環(huán)使用效果圖。在圖3中，橫坐標為循環(huán)次數(shù)Number ofcycles,縱坐標為相對活性 Relative activity (%)。
具體實施例
[0017]下面結(jié)合具體詳細實施例對本發(fā)明采用的固定化方法及其所帶來的效果做進一步說明，但本發(fā)明的保護范圍不僅限于此。
[0018]本發(fā)明提供的固定化脂肪酶的制備方法中，所述的氨基功能化的磁性Fe3O4OC納米粒子由下列方法所合成: 稱取2 mmol乙酰丙酮鐵加入到60 mL聚乙二醇200中，在氮氣氣氛中于270 °C反應3h后，自然冷卻至室溫，加入4 mmol葡萄糖,超聲5 min,獲得混合溶液；將上述混合溶液轉(zhuǎn)移到熱壓反應釜中，加入I mL氨水(NH3質(zhì)量百分含量，28%)后，旋緊熱壓反應釜，于240 V反應24 h ;待反應結(jié)束后，自然冷卻到室溫，所得沉淀經(jīng)磁分離、洗滌、干燥后得氨基功能化的磁性Fe3O4OC納米粒子，圖1為所制得氨基功能化的磁性Fe3O4OC納米粒子的高分辨透射電子顯微鏡檢測圖。
實施例1
步驟1.將來源于皺褶假絲酵母的的凍干脂肪酶粉采用pH=7.0磷酸緩沖溶液配制為Img/mL的脂肪酶溶液，至于4 1:冰箱中保存?zhèn)溆茫?br> 步驟2.稱取100 mg氨基官能化的磁性Fe3O4OC納米粒子，加入到5 ml 100g/L的戊二醛溶液中，于45 °C條件下反應3 h，所得產(chǎn)品經(jīng)磁分離、洗滌、真空干燥；
步驟3.取10 mL步驟I所配置的脂肪酶溶液，將步驟2所得的產(chǎn)品加入到其中，于25°C條件下反應3 h，所得產(chǎn)品經(jīng)磁分離、洗滌，即可獲得所述固定化脂肪酶。
[0019]檢測所述產(chǎn)品中脂肪酶在磁性Fe3O4OC納米粒子上的固載量為192.7 mg/g ;所述的固定化脂肪酶的酶活為1895.6 U/g ;所述的固定化脂肪酶的酶活回收率為164% ;在45°〇條件下放置10 h后，如圖2所示，所述的固定化脂肪酶的活性仍能保持71.5%，是游離脂肪酶的2.3倍；如圖3所示，所述的固定化脂肪酶循環(huán)使用10次后，磁性Fe3O4OC納米粒子固定脂肪酶的活性仍能保持50.1%。
[0020]實施例2
步驟1.將來源于豬胰腺的凍干脂肪酶粉采用pH=7.0磷酸緩沖溶液配制為I mg/mL的脂肪酶溶液，至于4 1:冰箱中保存?zhèn)溆茫?br> 步驟2.稱取100 mg氨基官能化的磁性Fe3O4OC納米粒子，加入10 ml 10g/L的戊二醛溶液中，于25 °C條件下反應24 h，所得產(chǎn)品經(jīng)磁分離、洗滌、真空干燥；
步驟3.取50 mL步驟I所配置的脂肪酶溶液，將步驟2所得的產(chǎn)品加入到其中，于35°C條件下反應0.5 h，所得產(chǎn)品經(jīng)磁分離、洗滌，即可獲得所述固定化脂肪酶。
[0021]檢測所述產(chǎn)品中胰脂肪酶在磁性Fe3O4OC納米粒子上的固載量為68.3 mg/g ;所述的固定化脂肪酶的酶活為3839 U/g ;所述的固定化脂肪酶的酶活回收率為172% ;所述的固定化脂肪酶循環(huán)使用8次后，磁性Fe3O4OC納米粒子固定脂肪酶的活性仍能保持62.8%。
[0022]實施例3、
步驟1.將來源于皺褶假絲酵母的的凍干脂肪酶粉采用pH=7.0磷酸緩沖溶液配制為Img/mL的脂肪酶溶液，至于4 1:冰箱中保存?zhèn)溆茫?br> 步驟2.將1000 mg丁二酸酐溶于100 mL甲苯中，稱取200 mg磁性Fe3O4OC納米粒子，在氮氣氣氛中于70 °C條件下反應24 h，所得產(chǎn)品經(jīng)磁分離、洗滌、真空干燥； 步驟3.將1000 mg N, N-二環(huán)己基碳二亞胺、279 mg N-羥基丁二酰亞胺溶于5 ml 二氯甲烷中，將步驟2所得的產(chǎn)品加入到其中，于25 °C條件下反應24 h，所得產(chǎn)品經(jīng)磁分離、洗滌、真空干燥；
步驟4.取20 mL步驟I所配置的脂肪酶溶液，將步驟3所得的產(chǎn)品加入到其中，于25°C條件下反應3 h，所得產(chǎn)品經(jīng)磁分離、洗滌，即可獲得所述固定化脂肪酶。
[0023]檢測所述產(chǎn)品中脂肪酶在磁性Fe3O4OC納米粒子上的固載量為163.2 mg/g ;所述的固定化脂肪酶的酶活為1446 U/g ;所述的固定化脂肪酶的酶活回收率為134% ;所述的固定化脂肪酶循環(huán)使用8次后，磁性Fe3O4OC納米粒子固定脂肪酶的活性仍能保持61.8%。
[0024]實施例4、
步驟I來源于豬胰腺的凍干脂肪酶粉采用pH=7.0磷酸緩沖溶液配制為I mg/mL的脂肪酶溶液，至于4 °C冰箱中保存?zhèn)溆茫?br> 步驟2.將200 mg 丁二酸酐溶于100 mL甲苯中，稱取200 mg磁性Fe3O4OC納米粒子，在氮氣氣氛中于100 °C條件下反應4 h，所得產(chǎn)品經(jīng)磁分離、洗滌、真空干燥；
步驟3.將200 mg N, N-二環(huán)己基碳二亞胺和223 mg N-羥基丁二酰亞胺溶于5 ml 二氯甲烷中，將步驟3所得的產(chǎn)品加入到其中，于50 °C條件下反應2 h，所得產(chǎn)品經(jīng)磁分離、洗滌、真空干燥；
步驟4.取100 mL步驟I所配置的脂肪酶溶液，將步驟3所得的產(chǎn)品加入到其中，于35 °C條件下反應0.5 h，所得產(chǎn)品經(jīng)磁分離、洗滌，即可獲得所述固定化脂肪酶。
[0025]檢測所述產(chǎn)品中胰脂肪酶在磁性Fe3O4OC納米粒子上的固載量為95 mg/g ;所述的固定化脂肪酶的酶活為3312 U/g ;所述的固定化脂肪酶的酶活回收率為169% ;所述的固定化脂肪酶循環(huán)使用10次后，磁性Fe3O4OC納米粒子固定脂肪酶的活性仍能保持52.3%。
【權(quán)利要求】
1.一種固定化脂肪酶的制備方法，其特征在于，使用氨基官能化的磁性Fe3O4OC納米粒子作為載體，通過共價結(jié)合將脂肪酶固定在其表面。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化脂肪酶的制備方法，其特征在于，所述的通過共價結(jié)合將脂肪酶固定在氨基官能化的磁性Fe3O4OC納米粒子表面的具體方法為:先利用親核反應將戊二醛一端的醛基與氨基官能化的磁性Fe3O4OC納米粒子表面的氨基相結(jié)合后，再將固定在磁性Fe3O4OC納米粒子表面的戊二醛另一端的醛基與脂肪酶的氨基相結(jié)合。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的固定化脂肪酶的制備方法，其特征在于，具體包括以下步驟: 1)將氨基官能化的磁性Fe3O4OC納米粒子加入到戊二醛溶液中，于25~451:條件下反應:3~24 h，所得產(chǎn)品經(jīng)磁分離、洗滌、真空干燥； 2)將步驟I)所得的產(chǎn)品加入到脂肪酶溶液中，于25~35°C條件下反應0.5~3 h，所得產(chǎn)品經(jīng)磁分離、洗滌即可。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的固定化脂肪酶的制備方法，其特征在于，所述的氨基官能化的磁性Fe3O4OC納米粒子與戊二醛質(zhì)量比為1: f 5，所述的氨基官能化磁性Fe3O4OC納米粒子與脂肪酶的質(zhì)量比為1:0.0.5ο
5.根據(jù)權(quán)利要求 3所述的固定化脂肪酶的制備方法，其特征在于，所述的戊二醛溶液的濃度為10-100 g/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化脂肪酶的制備方法，其特征在于，所述的通過共價結(jié)合將脂肪酶固定在氨基官能化的磁性Fe3O4OC納米粒子表面的具體方法為:利用羧化試劑將氨基官能化的磁性Fe3O4OC納米粒子表面的氨基轉(zhuǎn)化為羧基，再經(jīng)活化劑的作用后，利用酰胺化反應在Fe3O4OC納米粒子表面固定脂肪酶，所述的羧化試劑為丁二酸酐，所述的活化劑為物質(zhì)的量比為1:0.5^2的N，N- 二環(huán)己基碳二亞胺和N-羥基丁二酰亞胺混合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的固定化脂肪酶的制備方法，其特征在于具體包括以下步驟: 1)將丁二酸酐溶于甲苯內(nèi)，再加入氨基官能化的磁性Fe3O4OC納米粒子，在氮氣氣氛中于70-100 °C條件下反應24 h，所得產(chǎn)品經(jīng)磁分離、洗滌、真空干燥； 2)將N，N-二環(huán)己基碳二亞胺和N-羥基丁二酰亞胺溶于二氯甲烷內(nèi)，將步驟I)所得的產(chǎn)品加入到其中，于25飛O °C條件下反應疒24 h，所得產(chǎn)品經(jīng)磁分離、洗滌、真空干燥； 3)將步驟2)所得的產(chǎn)品加入到脂肪酶溶液中，于25~35°C條件下反應0.5~3 h，所得產(chǎn)品經(jīng)磁分離、洗滌即可。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的固定化脂肪酶的制備方法，其特征在于所述的氨基官能化的磁性Fe3O4OC納米粒子與丁二酸酐質(zhì)量比為1: 1~5，所述的氨基官能化磁性Fe304@C納米粒子與N，N-二環(huán)己基碳二亞胺的質(zhì)量比為1:1飛；所述的氨基官能化磁性Fe3O4OC納米粒子與脂肪酶的質(zhì)量比為1:0.0.5ο
【文檔編號】C12N11/14GK103937778SQ201410194401
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年5月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月9日
【發(fā)明者】陳志明, 吳之傳, 徐文惠 申請人:安徽工程大學