豬圓環(huán)病毒2型SYBR Green熒光PCR診斷試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型的試劑盒及其應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。所述的特異性引物組包括：PCV2-Fgggctccagtgctgttattc?SEQIDNO：1；PCV2-Rtagcgggagtggtaggagaa?SEQIDNO：2。本發(fā)明應(yīng)用熒光PCR的原理，建立了豬圓環(huán)病毒2型的SYBR?Green熒光PCR檢測(cè)方法。該試劑盒具有特異性強(qiáng)、敏感性高、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，適合進(jìn)行高通量樣品的分析。
【專利說(shuō)明】豬圓環(huán)病毒2型SYBR Green熒光PCR診斷試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及是一種用于檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型的熒光PCR試劑盒及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus，PCV)為圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬的成員，根據(jù)PCV的致病性、抗原性及核苷酸序列可將其分為PCVl和PCV2兩個(gè)基因型。PCVl廣泛存在于豬源腎細(xì)胞中，人們廣泛認(rèn)為PCVl不具有感染性；而PCV2與斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)、豬皮炎-腎病綜合征(Porcinedermatitis and nephropathy syndrome, FONS)、母豬流產(chǎn)與繁殖障礙等密切相關(guān)，常發(fā)生混合感染造成豬的免疫失敗。目前，該病在世界各主要養(yǎng)豬國(guó)家均有發(fā)生，給養(yǎng)豬業(yè)造成了十分嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。迄今，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)建立了病毒分離鑒定、PCR、間接免疫熒光(IFA)、免疫組化(IHA)等多種方法用于PCV2的檢測(cè)，但以上方法都不能對(duì)PCV2進(jìn)行定量檢測(cè)。實(shí)時(shí)突光定量PCR技術(shù)(real-time fluorescence quantitative PCR)是近幾年發(fā)展起來(lái)的一種新的核酸 檢測(cè)技術(shù)，該技術(shù)可實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒的實(shí)時(shí)定量檢測(cè)，己在人類和畜禽傳染病的診斷中得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。
[0003]本專利依據(jù)熒光定量PCR技術(shù)的原理，針對(duì)豬圓環(huán)病毒2型CAP基因保守序列，通過(guò)各種條件的優(yōu)化和篩選，設(shè)計(jì)出I組引物，可用于樣品中豬圓環(huán)病毒2型的檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型的特異性引物組，其特征在于:
PCV2-F gggctccagtgctgttattc SEQ ID NO:1
PCV2-R tagcgggagtggtaggagaa SEQ ID NO:2
(O它是針對(duì)豬圓環(huán)病毒2型CAP基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)的。
[0005](2)可檢測(cè)出豬圓環(huán)病毒2型。
[0006]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供含有上述引物組的試劑盒。所述的試劑盒包括:
(I)熒光PCR反應(yīng)液:
每個(gè)反應(yīng)液中含有:Platinum? SYBR?Green qPCR SuperMix-UDG with ROX(2X) 12.5 μ L,
PCV2-F 引物(10 μ mol/L ) I μ L, PCV2-R 引物(10 μ mol/L) I μ L。
[0007](2)用于試劑盒的引物為:
PCV2-F gggctccagtgctgttattc SEQ ID NO:1
PCV2-R tagcgggagtggtaggagaa SEQ ID NO:2
(3)陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品:含有圓環(huán)病毒2型CAP基因的克隆質(zhì)粒PMD-18T-CAP，質(zhì)粒的最終濃度為I X IOltl拷貝/ yL;(4)陰性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品:豬圓環(huán)病毒2型陰性豬的組織DNA，通過(guò)PCR檢測(cè)為陰性的樣本。
[0008]本發(fā)明所述用于檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型SYBR Green熒光PCR診斷試劑盒的制備方法，其特征是包括下述步驟:
(1)待檢樣品的DNA提取
(2)熒光PCR檢測(cè):根據(jù)待檢樣品的數(shù)量將熒光定量PCR反應(yīng)液分裝到PCR管中，每管12.5 μ L ；PCR管中加入樣品DNA模板3~5 μ L，加水補(bǔ)充至25 μ L體系；并設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照的熒光PCR檢測(cè)。
[0009](3)擴(kuò)增反應(yīng)過(guò)程:PCR管放入熒光PCR儀，擴(kuò)增程序?yàn)?5°C預(yù)變性3min ;95°C變性10s，63°C退火/延伸30s，共40個(gè)循環(huán)。
[0010](4)結(jié)果判定:動(dòng)力學(xué)曲線呈指數(shù)擴(kuò)增，Ct值< 34，且陰性和空白對(duì)照無(wú)擴(kuò)增，陽(yáng)性對(duì)照成立，檢測(cè)樣品的Tm值在81°C至82°C之間，判定為豬圓環(huán)病毒2型陽(yáng)性。
[0011 ] 本試劑盒的熒光PCR優(yōu)化過(guò)程: Cl)引物濃度的優(yōu)化將引物PCV2-R，PCV2-F稀釋至濃度均為lOymol/L，分別取
0.25 μ L、0.5 μ L、0.75 μ L、1 μ L、l.25 μ L的上下游引物，以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒為模板，采用矩陣法，進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明:當(dāng)PCV2-F和PCV2-R均為I μ I時(shí)，對(duì)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)可獲得較小的Ct值和較大的Λ Rn值。
[0012](2)循環(huán)條件的優(yōu)化為了獲得熒光PCR引物的最佳工作條件，使用篩選的最佳引物工作濃度，分別按照以下程序進(jìn)行PCR反應(yīng)，每個(gè)樣品作3個(gè)平行重復(fù)，同時(shí)以無(wú)菌三蒸水作空白對(duì)照。
[0013]兩步法:95°C預(yù)變性IOs ;94°C變性5s，60°C退火/延伸20s，共40個(gè)循環(huán)。
[0014]三步法:95°C預(yù)變性IOs ;95°C變性5s，55°C退火20s，72°C延伸15s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)特異性較低時(shí)，可適當(dāng)提高退火/延伸溫度(~66℃)，擴(kuò)增效率較差時(shí)，可適當(dāng)延長(zhǎng)退火/延伸時(shí)間(~30s)。結(jié)果表明，雙溫循環(huán)及退火溫度為63°C為最佳的循環(huán)條件。
[0015]本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了用于檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型的特異性引物組在制備用于檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型SYBR Green熒光PCR診斷試劑盒中的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:所建立的熒光定量PCR檢測(cè)方法的檢出率比傳統(tǒng)PCR方法的檢出率高，說(shuō)明其敏感性更好。
[0016]本發(fā)明公開(kāi)的用于檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型SYBR Green熒光PCR診斷試劑盒與現(xiàn)有技術(shù)相比所具有的積極效果在于:
(I)本發(fā)明的試劑制備簡(jiǎn)單、方法簡(jiǎn)便快捷，特異性強(qiáng)，敏感性好，可以區(qū)分豬圓環(huán)病毒I型和2型。
[0017](2)本發(fā)明的豬圓環(huán)病毒2型熒光PCR試劑盒適用于臨床病例、病料、細(xì)胞培養(yǎng)物等樣品，可同時(shí)檢測(cè)多樣品高通量檢測(cè)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1為試劑盒特異性試驗(yàn)結(jié)果；自左向右，依次為從左至右的曲線依次為陽(yáng)性對(duì)照、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬藍(lán)耳病病毒(PRRSV)、豬圓環(huán)病毒I型(PCV1)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬流感病毒H3N2亞型(SIV)、豬瘟病毒(CSFV)及陰性對(duì)照，直線為空白對(duì)照水；
圖2為試劑盒敏感性試驗(yàn)結(jié)果；從左至右依次為6.84Χ109、6.84Χ108、6.84Χ107、6.84Χ106、6.84Χ105、6.84Χ1θ\6.84Χ 103,6.84Χ102、6.84X10 拷貝 /μ I 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，直線為6.84拷貝/ μ I質(zhì)粒準(zhǔn)品和空白對(duì)照；
圖3為常規(guī)PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果；從左至右依次為6.84Χ109、6.84Χ108、6.84Χ107、6.84Χ106、6.84Χ105、6.84Χ1θ\6.84Χ 103,6.84Χ102、6.84X10 拷貝 /μ I 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，直線為6.84拷貝/ μ I質(zhì)粒準(zhǔn)品B:空白對(duì)照，M =TaKaRa Marker IOObp0
【具體實(shí)施方式】
[0019]為了更充分地解釋本發(fā)明的實(shí)施方法，提供了用于檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型熒光定量PCR試劑盒的實(shí)施實(shí)例。這些實(shí)施實(shí)例僅僅是解釋、而不是限制本發(fā)明的范圍。其中所用的試劑原料均有市售。本發(fā)明所述的豬圓環(huán)病毒2型引物組序列見(jiàn)表1。
[0020]對(duì)照毒株包括:豬圓環(huán)病毒I型(PCV1)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、偽狂犬病毒(PRV)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬藍(lán)耳病病毒(PRRSV)、豬瘟病毒(CSFV)和豬流感病毒H3N2亞型(SIV.)
表1
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型的特異性引物組，其特征在于: PCV2-F gggctccagtgctgttattc SEQ ID NO:1
PCV2-R tagcgggagtggtaggagaa SEQ ID NO:2。
2.一種含有權(quán)利要求1所述豬圓環(huán)病毒2型的試劑盒，其特征在于它是由下述成分組成: (I)熒光PCR反應(yīng)液: 每個(gè)反應(yīng)液中含有:
Platinum? SYBR?Green qPCR SuperMix-UDG with ROX (2X) 12.5 μ L,
PCV2-F(10 μ mol/L ) I μ L，PCV2-R (10 μ mol/L)I μ L 陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品:含有圓環(huán)病毒2型CAP基因的克隆質(zhì)粒PMD-18T-CAP，質(zhì)粒的最終濃度為IX 101°拷貝/ μ L ; 陰性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品:豬圓環(huán)病毒2型陰性豬的組織DNA，通過(guò)PCR檢測(cè)為陰性的樣本。
3.一種采用權(quán)利要求2所述試劑盒進(jìn)行豬圓環(huán)病毒2型的檢測(cè)方法，其特征在于:按如下的步驟進(jìn)行:(1)擴(kuò)增反應(yīng)體系:在反應(yīng)體系中加入樣品DNA模板3飛μL，加水補(bǔ)充至25 μ L體系； (2)擴(kuò)增反應(yīng)過(guò)程:在熒光PCR儀上，95°C預(yù)變性3min;95°C變性10s，63°C退火/延伸30s，共40個(gè)循環(huán)； (3)擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束，根據(jù)熒光定量PCR分析軟件的數(shù)據(jù)確定檢測(cè)樣品是否含有豬圓環(huán)病毒2型。
4.權(quán)利要求1所述用于檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型的特異性引物組在制備用于檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型SYBR Green熒光PCR診斷試劑盒中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/70GK103952498SQ201410194405
【公開(kāi)日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2014年5月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月9日
【發(fā)明者】李秀麗, 張莉, 郭慧娟, 鄢明華, 孫英峰, 田向?qū)W, 王利麗, 任衛(wèi)華, 池晶晶, 路超, 李富強(qiáng), 楊春蕾 申請(qǐng)人:天津市畜牧獸醫(yī)研究所