禾谷縊管蚜EF1-α內(nèi)參基因部分序列、克隆方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及“禾谷縊管蚜EF1-α內(nèi)參基因部分序列、克隆方法及應(yīng)用”屬分子生物學領(lǐng)域，具體地，涉及禾谷縊管蚜內(nèi)參基因EF1-α，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。本發(fā)明所獲得的禾谷縊管蚜內(nèi)參基因EF1-α（837bp）的核苷酸序列可作為今后研究禾谷縊管蚜功能基因或在不同發(fā)育時期基因表達，以及作為傳毒介體時病毒在其體內(nèi)表達的相對水平的內(nèi)參基因。
【專利說明】禾谷縊管蚜EF1-a內(nèi)參基因部分序列、克隆方法及其應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及禾谷縊管蚜參照基因EFl-a基因部分序列、克隆方法及其作為內(nèi)參基因在RT-qPCR中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]禾谷纟益管姆(Rhopalosiphum padi L., RP)隸屬于同翅目姆科(Homoptera:Aphididae)。這種姆蟲在世界范圍廣泛分布,是禾本科植物重要的害蟲之一。除了能通過吸食植株營養(yǎng)而直接影響谷物產(chǎn)量外，它主要是作為禾本科作物和雜草病毒病的傳播介體造成危害。禾谷縊管蚜以持久性非增殖方式傳播黃矮病毒，是黃癥病毒科黃癥病毒屬多種大麥黃矮病毒的優(yōu)勢傳毒介體。
[0003]在禾谷縊管蚜刺吸取食受黃矮病感染的植株韌皮部汁液的同時，它也取食到了存在于韌皮部病毒粒體。在介體蚜蟲的中腸和/或后腸以及唾液腺中發(fā)生受體介導的胞吞胞吐。黃矮病在寄主植物體內(nèi)的增殖一般地采用絕對和相對定量的方法，但是還沒有關(guān)于在獲毒期，接毒期以及影響傳毒效率、傳毒周期田間植物病毒流行的所有關(guān)鍵時期的介體體內(nèi)病毒的滴度和積累變化的研究報道。病毒進入介體蚜蟲體內(nèi)后，伴隨著無數(shù)的基因表達呈上調(diào)或下調(diào)，許多蛋白通過一種轉(zhuǎn)胞吞的方式被整合成與病毒傳播相關(guān)。應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄實時定量PCR(RT-qPCR)，我們能迅速地評價分子功能和生物學過程中病毒的影響以及病毒的實時濃度。
[0004]近年來，定量PCR (qPCR)中相對定量的方法較為流行，它消除了在實驗處理間、RNA提取效率及RNA完整性方面等系統(tǒng)誤差，應(yīng)用到了分子研究工作的許多方面。在生物體中，看家基因(House-keeping gene)在所有細胞中都是保守的,在正常或非正常情況下都是持續(xù)表達的?？梢酝ㄟ^目的基因與看家基因的比較來得出目的基因的表達水平和改變。因此，在RT-qPCR實驗中，選擇適合的、可信的看家基因作為內(nèi)參基因是必不可少的。隨著果妮(Drosophila melanogaster)和小菜蛾(Plutella xylostella L.)等不同的昆蟲全基因組序列的發(fā)表，尋找看家基因作為內(nèi)參基因成為這些完全變態(tài)昆蟲的研究重點之一。在運用RT-qPCR分析昆蟲基因表達的實驗中通常用下列內(nèi)參基因，如18S rRNA, ACTI, EFl-α
，GAPDH, UBI, RPSs, RPLs和TUB等。對于不完全變態(tài)昆蟲，特別是傳播多種植物病毒的蚜蟲，近年來開展了大豆姆(Aphis glycines)看家基因的研究。對于監(jiān)測介體禾谷纟益管姆體內(nèi)病毒基因的變化，用RT-qPCR確定病毒基因表達的相對水平，還沒有找到有效適用的看家基因。盡管有研究中ACTl基因已被用來作為檢測禾谷縊管蚜中兩種植物病毒的內(nèi)參基因，但這個基因?qū)嶋H上是來源于家蠶(Bombyx mori)的。作為姆蟲的核基因,EFl-α的部分基因序列已成為禾谷縊管蚜的群體遺傳多樣性的分類依據(jù)，但是作為看家基因用于研究其它基因的表達變化尚未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供禾谷縊管蚜EFl-α基因片段，可作為禾谷縊管蚜內(nèi)參基因的應(yīng)用。[0006]并同時提供克隆禾谷縊管蚜的EFl- α的特異性引物，建立基于SYBR GreenI染料技術(shù)的RT-qPCR方法，從而為禾谷縊管蚜的EFl-α作為內(nèi)參基因，在利用qPCR對禾谷縊管蚜功能基因或作為傳毒介體病毒在體內(nèi)增殖變化的研究中提供有用的方法。
[0007]禾谷縊管蚜EFl-α基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0008]一種禾谷縊管蚜EFl-α基因的部分序列的克隆方法，提取禾谷縊管蚜基因組總RNA，采用引物EFl - a R進行RT-PCR擴增，以產(chǎn)物第一鏈cDNA作為模板、以引物對EFl - a F/EFl-α R進行PCR擴增，得到陽性克隆，最后經(jīng)測序驗證。其中引物序列為:
[0009]EFl-α F:5/ -ATTGATATTGCTTTATGGAAATTCG-3'；
[0010]EFl-α R:5/ -ACCAGGGTGGTTCAATACAATAAC-3'。
[0011]所獲得的目的片段大小為837bp。
[0012]所述PCR 擴增的反應(yīng)條件如下:94°C 3min, [94°C 30s,56°C 45s,72°C lmin]，30 個循環(huán)，72°C延長lOmin，4°C保存。
[0013]本發(fā)明還提供一種qPCR擴增EFl_a基因部分序列的方法，抽提禾谷縊管蚜基因組總RNA,以試劑盒中自帶的引物混合物(包括Oigo dT Primer和Random6mers)為引物進行RT反應(yīng)，然后以產(chǎn)物第一鏈cDNA作為模板進行定量PCR擴增，熒光染料為SYBR GreenI，其中定量PCR擴增中的禾谷縊管蚜的定量引物，其序列為:
[0014]QEFl-a F:5/ -TAGACGCTATCCTACCCCCCA-3'；
[0015]QEFl-a R:5/ -GTGAAATCAGCAGCACCCTTG-3'。
[0016]所獲得的目的片段大小為328bp。
[0017]所述定量PCR擴增采用兩步法，即在95 °C預變性15min之后，先運行40個循環(huán)的 95°C 10sec,59.2°C 32sec，72°C 32sec，再運行溶解曲線階段的 95°C 15sec，60°C lmin,95°C 30sec,60°C 15sec。
[0018]禾谷縊管蚜EFl-α基因片段作為內(nèi)參基因應(yīng)用于禾谷縊管蚜功能基因或介體內(nèi)黃矮病毒基因表達定量PCR檢測的應(yīng)用。
[0019]本發(fā)明根據(jù)NCBI其它昆蟲的核苷酸序列，克隆了禾谷縊管蚜的EFl-α看家基因的部分序列。設(shè)計相應(yīng)的特異性的定量引物，建立基于SYBR GreenI染料技術(shù)的RT-qPCR方法，從而為禾谷縊管蚜的EFl-α作為內(nèi)參基因，在利用qPCR對禾谷縊管蚜功能基因或作為傳毒介體病毒在體內(nèi)增殖變化的研究中提供有用的方法。
[0020]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點:
[0021]1.本發(fā)明首次克隆得到禾谷縊管蚜的EFl-α基因片段。
[0022]2.本發(fā)明首次提出在禾谷縊管蚜定量PCR檢測中建立通用的內(nèi)參基因；
[0023]3.本發(fā)明首次提出將禾谷縊管蚜的EFl-α基因作為內(nèi)參基因在禾谷縊管蚜不同發(fā)育時期的定量PCR檢測；
[0024]4.本發(fā)明提出的禾谷縊管蚜的EFl-α基因作為內(nèi)參基因可以相對定量黃矮病毒的基因在介體中的相對表達水平；
[0025]5.本發(fā)明提出的檢測引物具有特異性，優(yōu)化了 PCR擴增程序，大大的提高了檢測效率、縮短了檢測時間，提高了檢測結(jié)果的可信度。
【專利附圖】

【附圖說明】[0026]圖1.禾谷縊管蚜EFl-α內(nèi)參基因的PCR電泳圖；
[0027]其中:M代表 DL2000DNA Marker,從上到下依次為 2000bp, 1000bp, 750bp, 500bp,250bp, IOObp ;1~4泳道為4次重復。
[0028]圖2-1.禾谷縊管蚜EFl-α內(nèi)參基因的溶解曲線(無翅成蚜)；
[0029]其中:橫坐標代表在溶解曲線擴增階段，從60°C到95°C之間的溫度范圍；縱坐標代表SYBRGreen I熒光染料結(jié)合到EFl-α目標片段的雙鏈DNA后，進入溶解曲線擴增階段，隨溫度升高，被ROX標準化后的SYBR Green I熒光信號值即Rn的導數(shù)值，峰值指在所對應(yīng)的溫度下Rn急劇降低的拐點處的導數(shù)值。
[0030]圖2-2.禾谷縊管蚜EFl-α內(nèi)參基因的溶解曲線(有翅成蚜)；
[0031]其中:橫坐標代表在溶解曲線擴增階段，從60°C到95°C之間的溫度范圍；縱坐標代表SYBRGreen I熒光染料結(jié)合到EFl-α目標片段的雙鏈DNA后，進入溶解曲線擴增階段，隨溫度升高，被ROX標準化后的SYBR Green I熒光信號值即Rn的導數(shù)值，峰值指在所對應(yīng)的溫度下Rn急劇降低的拐點處的導數(shù)值。
[0032]圖3-1.禾谷縊管蚜EFl-α內(nèi)參基因的標準曲線(無翅成蚜)；
[0033]其中:橫坐標代表對cDNA模板不同稀釋濃度下的量化值，從左到右表示cDNA濃度按梯度依次升高；縱坐標代表在這些稀釋濃度下擴增EFl-α，Rn超過閾值，開始進入指數(shù)增長期的循環(huán)數(shù)，即定量循環(huán)數(shù)Cq，曲線擬合方程為y= - 3.392X+24.679 (相關(guān)系數(shù)R2=0.999)，代表擴增效率E為97.157%。 [0034]圖3-2.禾谷縊管蚜EFl-α內(nèi)參基因的標準曲線(有翅成蚜)；
[0035]其中:橫坐標代表對cDNA模板不同稀釋濃度下的量化值，從左到右表示cDNA濃度按梯度依次升高；縱坐標代表在這些稀釋濃度下擴增EFl-α，Rn超過閾值，開始進入指數(shù)增長期的循環(huán)數(shù)，即定量循環(huán)數(shù)Cq，曲線擬合方程為y= - 3.424X+27.284 (相關(guān)系數(shù)R2=0.998)，代表擴增效率E為95.902%。
[0036]圖4-1.禾谷縊管蚜EFl-α內(nèi)參基因的擴增曲線(無翅成蚜)；
[0037]其中:橫坐標代表qPCR擴增EFl-α時的循環(huán)數(shù)；縱坐標代表在對應(yīng)循環(huán)數(shù)下的Rn值。
[0038]圖4-2.禾谷縊管蚜EFl-α內(nèi)參基因的擴增曲線(有翅成蚜)；
[0039]其中:橫坐標代表qPCR擴增EFl- α時的循環(huán)數(shù)；縱坐標代表在對應(yīng)循環(huán)數(shù)下的Rn值。
[0040]圖5.BYDV-PAV CP基因在有翅成蚜中的相對表達量；
[0041]其中:橫坐標代表有翅成蚜取食帶毒植株的時間間隔，從左到右時間依次增長；縱坐標代表BYDV-PAV CP基因相對于EFl-α的表達量，柱狀圖和誤差線代表每個時間間隔處3個重復樣品的相對表達量平均值M和平均值的標準誤(土SE)。
[0042]圖6.BYDV-PAV CP基因在無翅成蚜中的相對表達量；
[0043]其中:橫坐標代表無翅成蚜取食帶毒植株的時間間隔，從左到右時間依次增長；縱坐標代表BYDV-PAV CP基因相對于EFl-α的表達量，柱狀圖和誤差線代表每個時間間隔處3個重復樣品的相對表達量的平均值M和平均值的標準誤(土SE)。
【具體實施方式】[0044]下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件。
[0045]實施例1.禾谷縊管蚜EFl-α基因的克隆
[0046]1.1.禾谷縊管蚜總RNA提取:
[0047]采用TRIzol (Amion, USA)法提取禾谷縊管蚜(無翅成蚜)的總RNA。
[0048]根據(jù)研磨樣品時所用的工具不同(使用無RNase/DNase的進口產(chǎn)品)，RNA的提取過程為:將約0.05~0.1g新鮮樣品或冰凍的禾谷縊管蚜在液氮中充分研磨成粉末，迅速轉(zhuǎn)移入液氮冷凍過的1.5mL離心管中，然后加入ImL TRIzol，劇烈搖晃混勻，冰上靜置5min ；4°C, 12, OOOrpm離心IOmin ;吸取上清到新的1.5mL離心管中，加入200 μ I氯仿,用力搖15s,冰上靜置5min。4°C, 12, OOOrpm離心IOmin ;將上層上清轉(zhuǎn)入到新的離心管,加入400 μ L氯仿上清,劇烈搖晃混勻,冰上靜置SminafC, 12, OOOrpm離心IOmin ;將上清轉(zhuǎn)入新的離心管，加入與上清等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻，4°C過夜沉淀；4°C，12，OOOrpm離心15min，去上清；加入ImL預冷的75%乙醇(滅菌的DEPC水配制)，洗滌沉淀。4°C，12，OOOrpm離心5min重復上述洗漆步驟，以徹底洗干凈鹽分；棄上清，4°C, 12，OOOrpm離心lmin,用槍頭盡量吸出上清。在通風廚中，開口朝上，干燥5~lOmin。用50 μ L滅菌的DEPC水溶解。將I μ L原始樣品稀釋10倍或100倍后，取5 μ L進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA樣品的完整性檢測。并取I μ LRNA用NanoDrop-2000紫外分光光度計測定RNA樣品的純度和濃度值。合格樣品置于_70°C冰箱保存待用。
[0049]1.2.PCR擴增引物序列
[0050]EFl-α 的上游引物(SEQ ID N02):5' -ATTGATATTGCTTTATGGAAATTCG-3'；
[0051]EFl-a 的下游引物(SEQ ID N03):5' -ACCAGGGTGGTTCAATACAATAAC-3'。
[0052]由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
[0053]1.3.反轉(zhuǎn)錄(RT)
[0054]以蚜蟲總RNA (濃度在0.05~I μ g/μ L)為模板，利用目標基因的下游引物來合成第一鏈cDNA。25 μ L反轉(zhuǎn)錄體系設(shè)置和反應(yīng)過程按以下步驟:首先加入DEPC水7 μ L，下游引物(5 μ Μ) 0.5 μ L，總RNAl μ L，短暫離心混勻后，75°C溫浴IOmin,迅速置于冰上5min。DEPC 水 3.5 μ L, dNTPs (2.5mM) 5 μ L，5 X RT reaction buffer5 μ L, M-MLV (200U/ μ L) 2 μ L，Recombinant RNase Inhibitor (RRI, 40U/ μ L) I μ L?；旌衔锒虝弘x心混勻后，42°C溫浴 Ih,95°C失活5min，迅速置于冰上。所得到的第一鏈cDNA立即進行PCR或_20°C保存。
[0055]1.4.聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)
[0056]以RT得到的第一鏈cDNA為模板進行PCR擴增。
[0057]PCR 采用以下 25 μ L 反應(yīng)體系:ddH2017 μ L, 10XEX Taq PCR buffer2.5 μ L,dNTPs (2.5mM) 2 μ L，上游引物(5 μ Μ) 0.25 μ L，下游引物(5 μ Μ) 0.25 μ L, ExTaq0.5 μ L,cDNA2.5μ L。PCR反應(yīng)程序設(shè)置為:94°C預變性3min，然后94°C變性30sec，56°C退火45sec和72°C延伸lmin擴增，35個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后進行72°C補充延伸lOmin。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳來檢測目的片段(圖1)。
[0058]1.5.目的基因的獲得
[0059]對目標片段進行切膠回收,純化后的DNA片段連接到pMD18T simple vector載體上，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌細胞中，經(jīng)過PCR檢測的陽性克隆進行測序，得到EFl-α的核苷酸序列(具體序列見SEQ ID N0.1)。
[0060]實施例2.EFl-α基因在禾谷縊管蚜兩種不同蟲態(tài)中的特異性RT-qPCR的檢測
[0061]2.1.樣品制備
[0062]分別以禾谷縊管蚜的兩種不同蟲態(tài)(有翅成蚜和無翅成蚜)提取的總RNA為模板，具體提取方法詳見實施例1中1.1所述。
[0063]2.2.qPCR擴增弓丨物合成
[0064]qPCR 擴增上游引物(SEQ ID N04):5/ -TAGACGCTATCCTACCCCCCA-3'；
[0065]qPCR 擴增下游引物(SEQ ID N05):5/ -GTGAAATCAGCAGCACCCTTG-3'。
[0066]由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(PAGE純化法)。
[0067]2.3.RT-qPCR
[0068]利用兩步法來進行RT-qPCR,在 7500real time PCR 儀(Applied Biosystems)運行。RT部分利用北京天根(TIANGEN)公司的試劑盒FastQuant RT Kit (with gDNase),分別以禾谷縊管蚜的有翅成蚜和無翅成蚜材料提取的總RNA為模板，以試劑盒中自帶的引物混合物(包括Oigo dT Primer和Random6mers)為引物進行RT反應(yīng)，來獲取第一鏈cDNA。再利用基于SYBR Green I染料的qPCR來檢測目標基因，所用反應(yīng)體系和程序參考TIANGEN公司的SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)試劑盒的說明書。PCR反應(yīng)體系為20 μ L，其中 2XSuperReal PreMi x PluslO μ L，上下游定量引物 10 μ mol/L 各 0.6 μ L，模板 cDNA(IOng/ μ L) 2 μ L, 50 X ROX Reference Dye0.4 μ L,用滅菌雙蒸水補齊至 20 μ L,其余按照說明書進行。定量PCR擴增采用兩步法，即在95°C預變性15min之后，先運行40個循環(huán)的 95°C 10sec,59.2°C 32sec，72°C 32sec，再運行溶解曲線階段的 95°C 15sec，60°C lmin,95°C 30sec,60°C 15sec。實驗得到熔解曲線(melting curve)(圖 2_1、2_2)、定量循環(huán)數(shù)(quantification cycle, Cq)(圖 3_1、3_2)和擴增曲線(amplification plot)(圖 4-1、4-2)用于后期分析。
[0069]2.4.實驗結(jié)果
[0070]本發(fā)明按照定量PCR反應(yīng)程序?qū)?0ng含量的禾谷縊管蚜的無翅成蚜和有翅成蚜總RNA樣品進行定量PCR擴增，并結(jié)合溶解曲線來判斷擴增產(chǎn)物的特異性。一般理想的熔解曲線應(yīng)該是單峰型曲線，如果出現(xiàn)兩個或兩個以上的峰，說明有引物二聚體等非特異性擴增產(chǎn)生。從引物的溶解曲線分析得出，無翅成蚜和有翅成蚜基本都呈現(xiàn)單峰性曲線，且峰值都高于引物二聚體的峰值(75°C左右)，在82°C處開始起峰，85°C處峰值最高，87~88°C之間落峰，說明本發(fā)明涉及的定量擴增引物(SEQ ID No4和5)擴增條帶單一，特異性強，沒有非特異性擴增出現(xiàn)。本發(fā)明從兩組不同蟲態(tài)(無翅成蚜和有翅成蚜)的熒光定量PCR擴增曲線可以看出，該對引物在模板的不同稀釋濃度下進行擴增，DNA數(shù)量都經(jīng)歷了典型的擴增過程(包括基線、指數(shù)增長期、線性期和平臺期)，說明該對引物可以用于擴增兩種蟲態(tài)體內(nèi)的EFl-α基因。標準曲線的擬合方程分別為J= - 3.392Χ+24.679 (相關(guān)系數(shù)R2=0.999)，和y= - 3.424x+27.284 (相關(guān)系數(shù)R2=0.998)，根據(jù)公式擴增效率Ε=10Η/_°-1，得出該對引物對無翅成蚜和有翅成蚜兩種蟲態(tài)體內(nèi)的EFl-α基因的擴增效率E分別為97.157%和95.902%，說明該對引物的擴增效率很高，已接近100%。
[0071]實施例3.作為檢測帶毒蚜蟲體內(nèi)大麥黃矮病毒(BYDV-PAV)CP基因的內(nèi)參基因
[0072]3.1.樣品制備[0073]無毒的禾谷縊管蚜有翅成蚜和無翅成蚜取食感染BYDV-PAV的燕麥植株，在取食時間間隔為12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h和96h時分別取樣。每個取食時間間隔處，每種翅型的蚜蟲取8頭，合在一起作為一個樣品提取RNA。整體實驗設(shè)3次重復。所有樣品的RNA提取方法詳見實施例1中1.1所述。
[0074]3.2.CP基因的qPCR擴增引物合成
[0075]qPCR 擴增上游引物(SEQ ID N06):5/ -CGGGGCTGAGGTATTCGTAT-3'；
[0076]qPCR 擴增下游引物(SEQ ID N07):5/ -AGGACTTTGAGGCGGATTTG-3'。
[0077]由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(PAGE純化法)。
[0078]3.3.RT-qPCR 擴增
[0079]EFl-α基因的RT-qPCR擴增方法見實施例2中2.3所述，每個樣品的EFl-a Cq值(Cqre)用于相對定量分析。CP基因的RT-qPCR擴增使用SEQ ID N06和SEQ ID N07引物對，其他試劑的使用和RT-qPCR的反應(yīng)程序與EFl-α基因的RT-qPCR擴增方法完全一致，每個樣品的CP Cq值(Cqtawt)用于相對定量分析。
[0080]3.4.BYDV-PAV CP基因的相對表達量
[0081]每個樣品中CP基因的相對表達量(Relative Quantification,RQ)使用一下系列公式進行計算得到。
【權(quán)利要求】
1.禾谷縊管蚜EFl-α基因片段，其核苷酸序列如SEQID N0.1所示。
2.一種禾谷縊管蚜EFl-α基因的部分序列的克隆方法，提取禾谷縊管蚜基因組總RNA，采用引物EFl - a R進行RT-PCR擴增，以產(chǎn)物第一鏈cDNA作為模板、以引物對EFl - a F/EFl-a R進行PCR擴增，得到陽性克隆，最后經(jīng)測序驗證。其中引物序列為: EFl-α F:5/ -ATTGATATTGCTTTATGGAAATTCG-3'； EFl-α R:5/ -ACCAGGGTGGTTCAATACAATAAC-3'。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的克隆方法，所述PCR擴增的反應(yīng)條件如下:940C 3min, [94°C 30s,56°C 45s, 72°C lmin]30 個循環(huán)，72°C延長 10min，4°C保存。
4.一種qPCR擴增EFl-α基因部分序列的方法，抽提禾谷縊管蚜基因組總RNA，以試劑盒自帶混合引物為引物進行RT反應(yīng)，然后以產(chǎn)物第一鏈cDNA作為模板進行定量PCR擴增，熒光染料為SYBR Green I，其中定量PCR擴增中的禾谷縊管蚜的定量引物，其序列為: QEFl-a F:5/ -TAGACGCTATCCTACCCCCCA-3'； QEFl-a R:5/ -GTGAAATCAGCAGCACCCTTG-3'。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，所述定量PCR擴增采用兩步法，即在95°C預變性15min之后，先運行40個循環(huán)的95°C 10sec,59.2°C 32sec，72°C 32sec，再運行溶解曲線階段的95°C 15sec,60°C lmin,95°C 30sec,60°C 15sec。
6.權(quán)利要求1所述的禾谷縊管蚜EFl-α基因片段作為內(nèi)參基因應(yīng)用于禾谷縊管蚜功能基因或介體內(nèi)黃矮病毒基因表達定量PCR檢測的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/10GK103805610SQ201410088772
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年3月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月11日
【發(fā)明者】王錫鋒, 武科科, 劉艷 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所