專利名稱：一種細(xì)胞色素P450基因dsRNA及其在抑制蚜蟲(chóng)生長(zhǎng)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種細(xì)胞色素P450基因dsRNA及其在抑制蚜蟲(chóng)生長(zhǎng)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
麥蚜(尤其是麥長(zhǎng)管蚜)是危害中國(guó)小麥生產(chǎn)的主要害蟲(chóng)之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國(guó)每年小麥蚜蟲(chóng)危害面積可高達(dá)O. 17億公頃，占小麥總種植面積的62%，造成減產(chǎn)15% — 30%，嚴(yán)重時(shí)可高達(dá)50%。桃蚜是廣食性害蟲(chóng)，寄主約有350多種，主要危害煙草、桃、李、梅、梨等果樹(shù)和白菜、蘿卜、辣椒、菠菜等蔬菜，造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失。近年來(lái)，由于全球氣候變暖、耕作制度變化等因素，使蚜蟲(chóng)的繁殖能力和適應(yīng)性顯著增強(qiáng)，其危害日趨嚴(yán)重。目前，蚜蟲(chóng)防治以噴灑農(nóng)藥為主，但大量使用農(nóng)藥，不僅對(duì)人畜有害，而且造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染。培育抗 蚜蟲(chóng)小麥和蔬菜品種是防止蚜蟲(chóng)危害的最有效途徑，但由于現(xiàn)有種質(zhì)資源中缺乏有效的抗蚜基因，抗性機(jī)制尚不明確，常規(guī)育種難以奏效。挖掘和利用新型抗蚜基因并通過(guò)基因工程培育小麥和蔬菜抗蚜新種質(zhì)具有重要意義。植物介導(dǎo)的RNAi技術(shù)已成為農(nóng)作物抗蟲(chóng)基因工程的熱點(diǎn)之一，通過(guò)寄主植物表達(dá)相應(yīng)昆蟲(chóng)特異基因的dsRNA，昆蟲(chóng)取食植物后沉默其相應(yīng)的基因從而達(dá)到控制害蟲(chóng)危害的目的。RNAi現(xiàn)象其作用過(guò)程是雙鏈RNA( dsRNA)進(jìn)入生物體內(nèi)，被Dicer酶切割成2l_23nt的siRNA，siRNA與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物結(jié)合，與互補(bǔ)序列的靶mRNA結(jié)合，被Dicer識(shí)別，造成靶基因表達(dá)量的下降。近年來(lái)，利用dsRNA體外飼喂或注射來(lái)篩選RNA靶標(biāo)基因，導(dǎo)致靶標(biāo)基因表達(dá)和沉默，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育關(guān)鍵基因的鑒定和功能分析。孟山都公司通過(guò)植物介導(dǎo)的昆蟲(chóng)腸道特異基因RNAi技術(shù)成功獲得了抗玉米根螟的轉(zhuǎn)基因玉米，有效緩解了長(zhǎng)期應(yīng)用Bt轉(zhuǎn)基因玉米誘發(fā)昆蟲(chóng)產(chǎn)生抗性等問(wèn)題，目前已完成生產(chǎn)性試驗(yàn)。棉鈴蟲(chóng)腸道中特異P450基因可提高棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)對(duì)棉花次生代謝物質(zhì)和棉酚的耐受性，試驗(yàn)表明，利用表達(dá)棉鈴蟲(chóng)P450基因dsRNA的轉(zhuǎn)基因煙草和棉花葉片飼喂棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)，可導(dǎo)致幼蟲(chóng)體內(nèi)P450基因的表達(dá)量下降，同時(shí)幼蟲(chóng)發(fā)育受阻，表現(xiàn)出抗棉鈴蟲(chóng)性能；Zha等從褐飛虱中腸中克隆了 3個(gè)高度表達(dá)的基因N1HT1、Nlcar和Nltry，構(gòu)建載體，轉(zhuǎn)化水稻，褐飛虱取食轉(zhuǎn)基因水稻后，體內(nèi)3種基因的mRNA表達(dá)水平下降了 40%到70%，并且在水稻的篩管部發(fā)現(xiàn)了 dsRNA和siRNA的存在。Pitino等將桃蚜的MpC002 (主要在唾液腺中表達(dá))和Rack-I(主要在腸道中表達(dá))2個(gè)基因分別導(dǎo)入煙草和擬南芥中，用轉(zhuǎn)基因植物飼喂桃蚜，導(dǎo)致桃蚜體內(nèi)的MPC002或Rack-I的表達(dá)量降低了高達(dá)60%，蚜蟲(chóng)的產(chǎn)仔數(shù)目減少。小麥和蔬菜抗蚜蟲(chóng)種質(zhì)資源缺乏，抗性機(jī)制尚不明確，常規(guī)育種難以奏效，每年給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。迫切需要挖掘和鑒定新型抗蚜基因并通過(guò)基因工程育種提高小麥和蔬菜抗蚜特性
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供了一種dsRNA。本發(fā)明提供的dsRNA，為如下I)或2):I)由序列表中序列4所示的核苷酸和其反向互補(bǔ)序列所示的核苷酸組成的雙鏈RNA ；2)由序列表中序列5所示的核苷酸和其反向互補(bǔ)序列所示的核苷酸組成的雙鏈RNA。上述dsRNA的編碼基因也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；所述編碼基因具體為如下I)或2):1)為序列表中序列I所示的核苷酸；2)為序列表中序列2所示的核苷酸。上述dsRNA或上述的編碼基因在防治蚜蟲(chóng)和/或制備防治蚜蟲(chóng)產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。 上述應(yīng)用中，所述防治蚜蟲(chóng)體現(xiàn)在促進(jìn)蚜蟲(chóng)死亡和/或抑制蚜蟲(chóng)生長(zhǎng)。上述應(yīng)用為將上述dsRNA導(dǎo)入蚜蟲(chóng)，實(shí)現(xiàn)促進(jìn)蚜蟲(chóng)死亡和/或抑制蚜蟲(chóng)生長(zhǎng)；所述導(dǎo)入具體為飼喂；所述蚜蟲(chóng)具體為麥長(zhǎng)管蚜或桃蚜；所述促進(jìn)蚜蟲(chóng)死亡和/或抑制蚜蟲(chóng)生長(zhǎng)具體通過(guò)抑制蚜蟲(chóng)體內(nèi)細(xì)胞色素P450的表達(dá)實(shí)現(xiàn)。上述dsRNA或上述的編碼基因在促進(jìn)蚜蟲(chóng)死亡和/或抑制蚜蟲(chóng)生長(zhǎng)中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；所述蚜蟲(chóng)具體為麥長(zhǎng)管蚜或桃蚜。上述dsRNA或上述的編碼基因在抑制蚜蟲(chóng)體內(nèi)細(xì)胞色素P450的表達(dá)中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；所述蚜蟲(chóng)具體為麥長(zhǎng)管蚜或桃蚜。含有上述dsRNA或上述的編碼基因的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或表達(dá)盒也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。上述重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或表達(dá)盒在如下1)-5)中至少一種中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍1)防治蚜蟲(chóng)；2)制備防治蚜蟲(chóng)產(chǎn)品；3)促進(jìn)蚜蟲(chóng)死亡；4)抑制蚜蟲(chóng)生長(zhǎng)；5)抑制蚜蟲(chóng)體內(nèi)細(xì)胞色素P450的表達(dá)；所述蚜蟲(chóng)具體為麥長(zhǎng)管蚜或桃蚜。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種防治蚜蟲(chóng)的產(chǎn)品或一種抑制蚜蟲(chóng)體內(nèi)細(xì)胞色素P450表達(dá)的物質(zhì)或所述抑制蚜蟲(chóng)體內(nèi)細(xì)胞色素P450表達(dá)的物質(zhì)的應(yīng)用。本發(fā)明提供的產(chǎn)品，其活性成分為如下A-C A、上述 dsRNA;B、上述的編碼基因；C、上述重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或表達(dá)盒。本發(fā)明提供的一種抑制蚜蟲(chóng)體內(nèi)細(xì)胞色素P450表達(dá)的物質(zhì)為上述A-C ；本發(fā)明提供的所述抑制蚜蟲(chóng)體內(nèi)細(xì)胞色素P450表達(dá)的物質(zhì)在如下I) -5)中至少一種中的應(yīng)用1)防治蚜蟲(chóng)；2)制備防治蚜蟲(chóng)產(chǎn)品；3)促進(jìn)蚜蟲(chóng)死亡；4)抑制蚜蟲(chóng)生長(zhǎng)；5)抑制蚜蟲(chóng)體內(nèi)細(xì)胞色素P450的表達(dá)；所述蚜蟲(chóng)具體為麥長(zhǎng)管蚜或桃蚜。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明得到麥長(zhǎng)管蚜和桃蚜的細(xì)胞色素P450cDNA的保守序列的dsRNA，采用體外飼喂dsRNA方法，進(jìn)行了利用RNAi技術(shù)沉默麥長(zhǎng)管蚜和桃蚜體內(nèi)細(xì)胞色素P450，導(dǎo)致麥長(zhǎng)管蚜和桃蚜產(chǎn)生致死效應(yīng)，并且隨著dsRNA濃度增大和飼喂時(shí)間延長(zhǎng)，麥長(zhǎng)管蚜和桃蚜的死亡率均逐漸增大。對(duì)飼喂后存活蚜蟲(chóng)體內(nèi)P450的實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究表明，細(xì)胞色素P450的表達(dá)明顯受到抑制。表明蚜蟲(chóng)細(xì)胞色素P450的保守序列可應(yīng)用于通過(guò)植物介導(dǎo)的RNAi技術(shù)提高小麥和蔬菜抗蚜性的研究。


圖I為細(xì)胞色素P450和GFP的PCR擴(kuò)增圖2為細(xì)胞色素P450和GFP的體外合成dsRNA圖3為飼喂8天后麥長(zhǎng)管蚜和桃蚜的生長(zhǎng)發(fā)育情況圖4為熒光定量PCR結(jié)果圖
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中麥長(zhǎng)管蚜(錢幼亭，周廣和，張淑香，張向才.麥長(zhǎng)管蚜有性世代的研究.植物保護(hù)，1982，01, 14-15.，公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得)由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供，飼養(yǎng)蚜蟲(chóng)的小麥品種為科農(nóng)199，將蚜蟲(chóng)接種到小麥幼苗上，放入人工氣候箱中(溫度(20±2) °C，濕度60%-80%，光周期L D=16 8)進(jìn)行繁殖。下述實(shí)施例中桃蚜(蔣玉文.瓜蚜與桃蚜.新農(nóng)業(yè)，2001，11,40-41.，公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得)采自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所溫室種植的煙草上。質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Biomega公司，內(nèi)切酶BamH I、EcoR V及Hiscribe T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自NEB公司，大腸桿菌菌株DH5 α、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自北京全式金公司，rTaqDNA 聚合酶購(gòu)自 TaKaRa 公司，MinElute PCR Cleaning Kit、MinElute Gel ExtractionKit、RNACleaningKit購(gòu)自Qiagen公司，各種氨基酸及其它試劑均購(gòu)自北京拜爾迪公司。實(shí)施例I、細(xì)胞色素P450dsRNA的獲得I、麥長(zhǎng)管蚜總RNA的提取和cDNA的合成分別取約20頭麥長(zhǎng)管蚜與桃蚜，按照北京全式金公司的Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA,用RNACleaningKit進(jìn)行純化,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈,操作步驟均參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。2、引物設(shè)計(jì)與基因克隆根據(jù)豌豆蚜和棉蚜細(xì)胞色素P450的序列(GenBank登錄號(hào)分別為NM_001163211. 2和JQ246416. I),用DNAman5. O進(jìn)行比對(duì),選擇保守序列，利用Primer Primer5. O軟件設(shè)計(jì)引物Pl (表1)，由北京華大基因公司合成。綠色熒光蛋白基因(GFP)片段從國(guó)家小麥改良中心實(shí)驗(yàn)室保存的GFP質(zhì)粒上擴(kuò)增,利用Primer Primer5. O軟件設(shè)計(jì)引物P4 (表I)。PCR 反應(yīng)體系為 10XPCR Buffer 5μ L.dNTP (2. 5mmol Γ1) 4μ L.rTaq O. 5 μ L,Forward primer (20 μ mol · L-1) I μ L> Reverse primer (20 μ mol · L-1) I μ L> cDNA/GFP M粒 I μ L，用 ddH20補(bǔ)足至 50 μ L。PCR 的反應(yīng)條件為 94。。4min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s,39 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin ;4°C保存。
以麥長(zhǎng)管蚜的cDNA為模板，用Pl作為引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到412bp PCR產(chǎn)物(含40bp的T7啟動(dòng)子序列)，經(jīng)過(guò)測(cè)序，該412bp PCR產(chǎn)物具有序列表中的序列1(可人工合成)所示的核苷酸；序列表中的序列I所示的核苷酸編碼122個(gè)氨基酸。以桃蚜的cDNA為模板，用Pl作為引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到422bp PCR產(chǎn)物(含40bp的T7啟動(dòng)子序列)，經(jīng)過(guò)測(cè)序，該422bp PCR產(chǎn)物具有序列表中的序列2 (可人工合成)所示的核苷酸；；序列表中的序列2所示的核苷酸編碼126個(gè)氨基酸。以GFP質(zhì)粒為模板，用P4作為引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到324bp PCR產(chǎn)物(含40bp的T7啟動(dòng)子序列)，其具有序列表中的序列3 (可人工合成)所示的核苷酸。將上述PCR電泳結(jié)果如圖I所不，M Trans2K DNA marker ；1 :麥長(zhǎng)管ife牙Sitobionavenae ；2 :桃姆Myzus persicae ；3 :GFP,可以看出得到目的片段。將上述412bp PCR產(chǎn)物(麥長(zhǎng)管蚜)編碼的氨基酸序列和422bp PCR產(chǎn)物(桃蚜)編碼的氨基酸序列提交到ExPASy數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www. uniprot. org/uniprot/)進(jìn)行BLAST 比對(duì)分析，ExPASy數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST得到250條序列信息，均為細(xì)胞色素P450的部分氨基酸序列，且核苷酸同源性為90. 1% ;因此認(rèn)為序列表中序列I所示的核苷酸編碼的氨基酸和序列表中序列2所示的核苷酸編碼的氨基酸為細(xì)胞色素P450中的保守序列。表I為細(xì)胞色素P450與GFP的PCR擴(kuò)增引物
權(quán)利要求
1.一種dsRNA，為如下I)或2): O由序列表中序列4所示的核苷酸和其反向互補(bǔ)序列所示的核苷酸組成的雙鏈RNA ； 2)由序列表中序列5所示的核苷酸和其反向互補(bǔ)序列所示的核苷酸組成的雙鏈RNA。
2.權(quán)利要求I所述dsRNA的編碼基因；所述編碼基因具體為如下I)或2):1)為序列表中序列I所示的核苷酸；2)為序列表中序列2所示的核苷酸。
3.權(quán)利要求I所述dsRNA或權(quán)利要求2所述的編碼基因在防治蚜蟲(chóng)和/或制備防治蚜蟲(chóng)產(chǎn)品中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述防治蚜蟲(chóng)體現(xiàn)在促進(jìn)蚜蟲(chóng)死亡和/ 或抑制蚜蟲(chóng)生長(zhǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用為將權(quán)利要求I所述dsRNA導(dǎo)入蚜蟲(chóng)，實(shí)現(xiàn)促進(jìn)蚜蟲(chóng)死亡和/或抑制蚜蟲(chóng)生長(zhǎng)；所述導(dǎo)入具體為飼喂； 所述蚜蟲(chóng)具體為麥長(zhǎng)管蚜或桃蚜； 所述促進(jìn)蚜蟲(chóng)死亡和/或抑制蚜蟲(chóng)生長(zhǎng)具體通過(guò)抑制蚜蟲(chóng)體內(nèi)細(xì)胞色素P450的表達(dá)實(shí)現(xiàn)。
6.權(quán)利要求I所述dsRNA或權(quán)利要求2所述的編碼基因在促進(jìn)蚜蟲(chóng)死亡和/或抑制蚜蟲(chóng)生長(zhǎng)中的應(yīng)用；所述蚜蟲(chóng)具體為麥長(zhǎng)管蚜或桃蚜。
7.權(quán)利要求I所述dsRNA或權(quán)利要求2所述的編碼基因在抑制蚜蟲(chóng)體內(nèi)細(xì)胞色素P450的表達(dá)中的應(yīng)用；所述蚜蟲(chóng)具體為麥長(zhǎng)管蚜或桃蚜。
8.含有權(quán)利要求I所述dsRNA或權(quán)利要求2所述的編碼基因的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或表達(dá)盒。
9.權(quán)利要求8重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或表達(dá)盒在如下I)-5)中至少一種中的應(yīng)用1)防治蚜蟲(chóng)；2)制備防治蚜蟲(chóng)產(chǎn)品；3)促進(jìn)蚜蟲(chóng)死亡；4)抑制蚜蟲(chóng)生長(zhǎng)；5)抑制蚜蟲(chóng)體內(nèi)細(xì)胞色素P450的表達(dá)； 所述蚜蟲(chóng)具體為麥長(zhǎng)管蚜或桃蚜。
10.一種防治蚜蟲(chóng)的產(chǎn)品，其活性成分為如下A-C A、權(quán)利要求I所述dsRNA； B、權(quán)利要求2所述的編碼基因； C、權(quán)利要求8重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或表達(dá)盒。
或一種抑制蚜蟲(chóng)體內(nèi)細(xì)胞色素P450表達(dá)的物質(zhì)為所述A-C ； 或所述抑制蚜蟲(chóng)體內(nèi)細(xì)胞色素P450表達(dá)的物質(zhì)在如下I)-5)中至少一種中的應(yīng)用O防治蚜蟲(chóng)；2)制備防治蚜蟲(chóng)產(chǎn)品；3)促進(jìn)蚜蟲(chóng)死亡；4)抑制蚜蟲(chóng)生長(zhǎng)；5)抑制蚜蟲(chóng)體內(nèi)細(xì)胞色素P450的表達(dá)； 所述蚜蟲(chóng)具體為麥長(zhǎng)管蚜或桃蚜。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種dsRNA及其在抑制蚜蟲(chóng)生長(zhǎng)中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的dsRNA，為如下1)或2)1)由序列表中序列4所示的核苷酸和其反向互補(bǔ)序列所示的核苷酸組成的雙鏈RNA；2)由序列表中序列5所示的核苷酸和其反向互補(bǔ)序列所示的核苷酸組成的雙鏈RNA。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明得到麥長(zhǎng)管蚜和桃蚜的細(xì)胞色素P450cDNA的保守序列的dsRNA，采用體外飼喂dsRNA方法，進(jìn)行了利用RNAi技術(shù)沉默麥長(zhǎng)管蚜和桃蚜體內(nèi)細(xì)胞色素P450，導(dǎo)致麥長(zhǎng)管蚜和桃蚜生長(zhǎng)發(fā)育受阻并產(chǎn)生致死效應(yīng)。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102776189SQ20121020560
公開(kāi)日2012年11月14日 申請(qǐng)日期2012年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月18日
發(fā)明者夏蘭琴, 張岷, 王暉 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所