禾谷縊管蚜act1內(nèi)參基因部分序列、克隆方法及應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及“禾谷縊管蚜ACT1內(nèi)參基因部分序列、克隆方法及應用”屬分子生物學領域，具體地，涉及禾谷縊管蚜內(nèi)參基因ACT1，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。本發(fā)明所獲得的禾谷縊管蚜內(nèi)參基因ACT1（1131bp）的核苷酸序列可作為今后研究禾谷縊管蚜功能基因或在不同發(fā)育時期基因表達，以及作為傳毒介體時病毒在其體內(nèi)表達的相對水平的內(nèi)參基因。
【專利說明】禾谷縊管蚜ACT1內(nèi)參基因部分序列、克隆方法及應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學【技術領域】，尤其涉及禾谷縊管蚜參照基因ACTl基因部分序列、克隆方法及其作為內(nèi)參基因在RT-qPCR中的應用。
【背景技術】
[0002]禾谷纟益管姆(Rhopalosiphum padi L., RP)隸屬于同翅目姆科(Homoptera:Aphididae)。這種姆蟲在世界范圍廣泛分布,是禾本科植物重要的害蟲之一。除了能通過吸食植株營養(yǎng)而直接影響谷物產(chǎn)量外，它主要是做為禾本科作物和雜草病毒病的傳播介體造成危害。禾谷縊管蚜以持久性非增殖方式傳播黃矮病毒，是黃癥病毒科黃癥病毒屬多種大麥黃矮病毒的優(yōu)勢傳毒介體。
[0003]在禾谷縊管蚜刺吸取食受黃矮病感染的植株韌皮部汁液的同時，它也取食到了存在于韌皮部病毒粒體。在介體蚜蟲的中腸和/或后腸以及唾液腺中發(fā)生受體介導的胞吞胞吐。黃矮病在寄主植物體內(nèi)的增殖一般地采用絕對和相對定量的方法，但是還沒有關于在獲毒期，接毒期以及影響傳毒效率、傳毒周期田間植物病毒流行的所有關鍵時期的介體體內(nèi)病毒的滴度和積累變化的研究報道。病毒進入介體蚜蟲體內(nèi)后，伴隨著無數(shù)的基因表達呈上調(diào)或下調(diào)，許多蛋白通過一種轉(zhuǎn)胞吞的方式被整合成與病毒傳播相關。應用反轉(zhuǎn)錄實時定量PCR(RT-qPCR)，我們能迅速地評價分子功能和生物學過程中病毒的影響以及病毒的實時濃度。
[0004]近年來，定量PCR(qPCR)中相對定量的方法較為流行，它消除了在實驗處理間、RNA提取效率及RNA完整性方面等系統(tǒng)誤差，應用到了分子研究工作的許多方面。在生物體中，看家基因(House-keeping gene)在所有細胞中都是保守的,在正?；蚍钦Ｇ闆r下都是持續(xù)表達的。因此，在RT-qPCR實驗中，選擇適合的、可信的看家基因作為內(nèi)參基因是必不可少的。隨著果妮(Drosophi`la melanogaster)和小菜蛾(Plutella xylostella L.)等不同的昆蟲全基因組序列的發(fā)表，尋找看家基因作為內(nèi)參基因成為這些完全變態(tài)昆蟲的研究重點之一。在運用RT-qPCR分析昆蟲基因表達的實驗中通常用下列內(nèi)參基因，如18S rRNA，ACT I, EF-1 a，GAPDH, UBI, RPSs, RPLs和TUB等。對于不完全變態(tài)昆蟲，特別是傳播多種植物病毒的姆蟲，近年來開展了大豆姆(Aphis glycines)看家基因的研究。對于監(jiān)測介體禾谷縊管蚜體內(nèi)病毒基因的變化，用RT-qPCR確定病毒基因表達的相對水平，還沒有找到有效適用的看家基因。盡管有研究中ACTl基因已被用來作為檢測禾谷縊管蚜中兩種植物病毒的內(nèi)參基因，但這個基因?qū)嶋H上是參考家蠶(Bombyx mori)的、并不是禾谷縊管蚜自身的ACTl基因，而本發(fā)明的結(jié)果也證實了兩個物種的ACTl基因在核苷酸序列上確實存在一定的差異。所以在定量禾谷縊管蚜體內(nèi)的病毒含量時，使用其它物種的基因作為內(nèi)參基因的做法是不準確的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供禾谷縊管蚜ACTl基因片段，可作為禾谷縊管蚜內(nèi)參基因的應用。[0006]并同時提供克隆禾谷縊管蚜的ACTl的特異性引物，建立基于SYBR Green I染料技術的RT-qPCR方法，從而為禾谷縊管蚜的ACTl作為內(nèi)參基因，在利用qPCR對禾谷縊管蚜功能基因或作為傳毒介體病毒在體內(nèi)增殖變化的研究中提供有用的方法。
[0007]禾谷縊管蚜ACTl基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0008]一種禾谷縊管蚜ACTl基因的部分序列的克隆方法，提取禾谷縊管蚜基因組總RNA，采用引物ACTlR進行RT-PCR擴增，以產(chǎn)物第一鏈cDNA作為模板、以引物對ACTlF/ACTlR進行PCR擴增，得到陽性克隆，最后經(jīng)測序驗證。其中引物序列為:
[0009]ACT1F:5' -ATGTGTGACGAAGAAGTAGC-3'；
[0010]ACT1R:5/ -TTAGAAGCACTTTCTGTGC-3'。
[0011]所獲得的目的片段大小為1131bp。
[0012]所述PCR 擴增的反應條件如下:94°C 3min、[94°C 45s,56°C lmin、72°C lmin]30 個循環(huán)、72°C延長10min，4°C保存。
[0013]本發(fā)明還提供一種qPCR擴增ACTl基因部分序列的方法，抽提禾谷縊管蚜基因組總RNA，以試劑盒中自帶的引物混合物為引物進行RT反應，然后以產(chǎn)物第一鏈cDNA作為模板進行定量PCR擴增，熒光染料為SYBR Green I，其中定量PCR擴增中的禾谷縊管蚜的定量引物，其序列為:
[0014]QACTlF:5/ -AACGGAAGCACCTTTGAACC-3'；
[0015]QACTlR:5/ -GGAAGAAGCAGCAGTAGCCAT-3'。
[0016]所獲得的目的片段大小為385bp。
[0017]所述定量PCR擴增采用兩步法，即在95 °C預變性15min之后，先運行40個循環(huán)的 95°C 10sec,59.2°C 32sec，72°C 32sec，再運行溶解曲線階段的 95°C 15sec，60°C lmin,95°C 30sec,60°C 15sec。
[0018]禾谷縊管蚜ACTl基因片段作為內(nèi)參基因應用于禾谷縊管蚜功能基因或介體內(nèi)黃矮病毒基因表達定量PCR檢測的應用。
[0019]本發(fā)明根據(jù)NCBI其它昆蟲的核苷酸序列，克隆了禾谷縊管蚜的ACTl看家基因的部分序列。設計相應的特異性的定量引物，建立基于SYBR GreenI染料技術的RT-qPCR方法，從而為禾谷縊管蚜的ACTl作為內(nèi)參基因，在利用qPCR對禾谷縊管蚜功能基因或作為傳毒介體病毒在體內(nèi)增殖變化的研究中提供有用的方法。
[0020]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點:
[0021]1.本發(fā)明首次克隆得到禾谷縊管蚜的ACTl基因片段。
[0022]2.本發(fā)明首次提出在禾谷縊管蚜定量PCR檢測中建立通用的內(nèi)參基因；
[0023]3.本發(fā)明首次提出將禾谷縊管蚜的ACTl基因作為內(nèi)參基因在禾谷縊管蚜不同發(fā)育時期的定量PCR檢測；
[0024]4.本發(fā)明提出的禾谷縊管蚜的ACTl基因作為內(nèi)參基因可以相對定量黃矮病毒的基因在介體中的相對表達水平；
[0025]5.本發(fā)明提出的檢測引物具有特異性，優(yōu)化了 PCR擴增程序，大大的提高了檢測效率、縮短了檢測時間，提高了檢測結(jié)果的可信度。 【專利附圖】

【附圖說明】[0026]圖1.禾谷縊管蚜ACTl內(nèi)參基因的PCR電泳圖；
[0027]其中M 代表 DL2000DNA Marker,從上到下依次為 2000bp, 1000bp, 750bp, 500bp, 250bp,
[0028]IOObp ; I~4泳道為4次重復。
[0029]圖2-1.禾谷縊管蚜ACTl內(nèi)參基因的溶解曲線(無翅成蚜)；
[0030]其中:橫坐標代表在溶解曲線擴增階段，從60°C到95°C之間的溫度范圍；縱坐標代表SYBRGreen I熒光染料結(jié)合到18S rRNA目標片段的雙鏈DNA后，進入溶解曲線擴增階段，隨溫度升高，被ROX標準化后的SYBR Green I熒光信號值即Rn的導數(shù)值，峰值指在所對應的溫度下Rn急劇降低的拐點處的導數(shù)值。
[0031]圖2-2.禾谷縊管蚜ACTl內(nèi)參基因的溶解曲線(有翅成蚜)；
[0032]其中:橫坐標代表在溶解曲線擴增階段，從60°C到95°C之間的溫度范圍；縱坐標代表SYBRGreen I熒光染料結(jié)合到18S rRNA目標片段的雙鏈DNA后，進入溶解曲線擴增階段，隨溫度升高，被ROX標準化后的SYBR Green I熒光信號值即Rn的導數(shù)值，峰值指在所對應的溫度下Rn急劇降低的拐點處的導數(shù)值。
[0033]圖3-1.禾谷縊管蚜ACTl內(nèi)參基因的標準曲線(無翅成蚜)；
[0034]其中:橫坐標代表對cDNA模板不同稀釋濃度下的量化值，從左到右表示cDNA濃度按梯度依次升高；縱坐標代表在這些稀釋濃度下擴增ACT1，Rn超過閾值，開始進入指數(shù)增長期的循環(huán)數(shù)，即定量循環(huán)數(shù)Cq，曲線擬合方程為y= - 3.446X+31.119 (相關系數(shù)R2=0.999)，代表擴增效率E為95.067%。
[0035]圖3-2.禾谷縊管 蚜ACTl內(nèi)參基因的標準曲線(有翅成蚜)；
[0036]其中:橫坐標代表對cDNA模板不同稀釋濃度下的量化值，從左到右表示cDNA濃度按梯度依次升高；縱坐標代表在這些稀釋濃度下擴增ACT1，Rn超過閾值，開始進入指數(shù)增長期的循環(huán)數(shù)，即定量循環(huán)數(shù)Cq，曲線擬合方程為y= - 3.484X+30.220 (相關系數(shù)R2=0.999)，代表擴增效率E為93.665%。
[0037]圖4-1.禾谷縊管蚜ACTl內(nèi)參基因的擴增曲線(無翅成蚜)；
[0038]其中:橫坐標代表qPCR擴增ACTl時的循環(huán)數(shù)；縱坐標代表在對應循環(huán)數(shù)下的Rn值。
[0039]圖4-2.禾谷縊管蚜ACTl內(nèi)參基因的擴增曲線(有翅成蚜)；
[0040]其中:橫坐標代表qPCR擴增ACTl時的循環(huán)數(shù)；縱坐標代表在對應循環(huán)數(shù)下的Rn值。
[0041]圖5.BYDV-PAV CP基因在有翅成蚜中的相對表達量；
[0042]其中:橫坐標代表有翅成蚜取食帶毒植株的時間間隔，從左到右時間依次增長；縱坐標代表BYDV-PAV CP基因相對于ACTl的表達量，柱狀圖和誤差線代表每個時間間隔處3個重復樣品的相對表達量平均值M和平均值的標準誤(土SE)。
[0043]圖6.BYDV-PAV CP基因在無翅成蚜中的相對表達量；
[0044]其中:橫坐標代表無翅成蚜取食帶毒植株的時間間隔，從左到右時間依次增長；縱坐標代表BYDV-PAV CP基因相對 于ACTl的表達量，柱狀圖和誤差線代表每個時間間隔處3個重復樣品的相對表達量的平均值M和平均值的標準誤(土SE)?！揪唧w實施方式】
[0045]下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件。
[0046]實施例1.禾谷縊管蚜ACTl基因的克隆
[0047]1.1禾谷縊管蚜總RNA提取:
[0048]采用TRIzol (Amion, USA)法提取禾谷縊管蚜(無翅成蚜)的總RNA。
[0049]根據(jù)研磨樣品時所用的工具不同(使用無RNase/DNase的進口產(chǎn)品)，RNA的提取過程為:將約0.05~0.1g新鮮樣品或冰凍的禾谷縊管蚜在液氮中充分研磨成粉末，迅速轉(zhuǎn)移入液氮冷凍過的1.5mL離心管中，然后加入lmLTRIzol，劇烈搖晃混勻，冰上靜置5min ；4°C, 12, OOOrpm離心IOmin ;吸取上清到新的1.5mL離心管中，加入200 μ I氯仿,用力搖15s,冰上靜置5min。4°C, 12, OOOrpm離心IOmin ;將上層上清轉(zhuǎn)入到新的離心管,加入400 μ L氯仿上清,劇烈搖晃混勻,冰上靜置SminafC, 12, OOOrpm離心IOmin ;將上清轉(zhuǎn)入新的離心管，加入與上清等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻，4°C過夜沉淀；4°C，12，OOOrpm離心15min，去上清；加入ImL預冷的75%乙醇(滅菌的DEPC水配制)，洗滌沉淀。4°C，12，OOOrpm離心5min重復上述洗漆步驟，以徹底洗干凈鹽分；棄上清，4°C, 12，OOOrpm離心Imin,用槍頭盡量吸出上清。在通風廚中，開口朝上，干燥5~lOmin。用50 μ L滅菌的DEPC水溶解。取I μ LRNA用NanoDrop-2000紫外分光光度計測定RNA樣品的純度和濃度值。將I μ L原始樣品稀釋10倍或100倍后，取5yL進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA樣品的完整性檢測。并取I μ L RNA用NanoDrop-2000紫外分光光度計測定RNA樣品的純度和濃度值。合格樣品置于_70°C冰箱保存待用。
[0050]1.2.PCR擴增引物序列
[0051]ACTl 的上游引物(SEQ ID N02):5' -ATGTGTGACGAAGAAGTAGC-3'；
[0052]ACTl 的下游引物(SEQ ID N03):5' -TTAGAAGCACTTTCTGTGC-3'。
[0053]由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
[0054]1.3.反轉(zhuǎn)錄(RT)
[0055]以蚜蟲總RNA (濃度在0.05~I μ g/ μ L)為模板，利用目標基因的下游引物來合成第一鏈cDNA。25 μ L反轉(zhuǎn)錄體系設置和反應過程按以下步驟:首先加入DEPC水7 μ L，下游引物(5 μ Μ) 0.5 μ L，總RNAl μ L，短暫離心混勻后，75°C溫浴IOmin,迅速置于冰上5min。DEPC 水 3.5 μ L, dNTPs (2.5mM) 5 μ L，5 X RT reaction buffer5 μ L, M-MLV (200U/ μ L) 2 μ L，Recombinant RNaseInhibitor (RRI, 40U/ μ L) I μ L。混合物短暫離心混勻后，42°C溫浴 Ih,95°C失活5min，迅速置于冰上。所得到的第一鏈cDNA立即進行PCR或_20°C保存。
[0056]1.4.聚合酶鏈式反應(PCR)
[0057]以RT得到的第一鏈cDNA為模板進行PCR擴增。
[0058]PCR 采用以下 25μ L 反應體系:ddH2017y L，1`0XEX Taq PCR buffer2.5 μ L,dNTPs (2.5mM) 2μ L,上游引物(5 μ Μ) 0.25 μ L，下游引物(5 μ Μ) 0.25 μ L, ExTaq0.5 μ L,cDNA2.5 μ L。PCR反應程序設置為:94°C預變性3min，然后94°C變性45sec，56°C退火lmin，和72°C延伸lmin擴增，30個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后進行72°C補充延伸lOmin。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳來檢測目的片段(圖1)。
[0059]1.5.目的基因的獲得[0060]對目標片段進行切膠回收，純化后的DNA片段連接到pMD18T simple vector載體上，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌細胞中，經(jīng)過PCR檢測的陽性克隆進行測序，得到ACTl的核苷酸序列(具體序列見SEQ ID N0.1)。
[0061]實施例2.ACTl基因在禾谷縊管蚜兩種不同蟲態(tài)中的特異性RT-qPCR的檢測
[0062]2.1.樣品制備
[0063]分別以禾谷縊管蚜的兩種不同蟲態(tài)(有翅成蚜和無翅成蚜)提取的總RNA為模板，具體提取方法詳見實施例1中1.1所述。
[0064]2.2.PCR擴增弓丨物合成
[0065]qPCR 擴增上游引物(SEQ ID N04):5/ -AACGGAAGCACCTTTGAACC-3'；
[0066]qPCR 擴增下游引物(SEQ ID N05):5/ -GGAAGAAGCAGCAGTAGCCAT-3'。
[0067]由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(PAGE純化法)。
[0068]2.3.熒光定量 PCR (RT-qPCR)
[0069]利用兩步法來進行RT-qPCR,在 7500real time PCR 儀(Applied Biosystems)運行。RT部分利用北京天根(TIANGEN)公司的試劑盒FastQuant RT Kit (with gDNase),分別以禾谷縊管蚜的有翅成蚜和無翅成蚜材料提取的總RNA為模板，以試劑盒中自帶的引物混合物(包括Oigo dT Primer和Random6mers)為引物進行RT反應，來獲取第一鏈cDNA。再利用基于SYBR Green I染料的qPCR來檢測目標基因，所用反應體系和程序參考TIANGEN公司的SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)試劑盒的說明書。PCR反應體系為20 μ L，其中 2 X SuperReal PreMix PluslO μ L，上下游定量引物 10 μ mol/L 各 0.6 μ L，模板 cDNA(IOng/ μ L) 2 μ L, 50 X ROX Reference Dye0.4 μ L,用滅菌雙蒸水補齊至 20 μ L,其余按照說明書進行。定量PCR擴增采用兩步法，即在95°C預變性15min之后，先運行40個循環(huán)的 95°C 10sec,59.2°C 32sec，72°C 32sec，再運行溶解曲線階段的 95°C 15sec，60°C lmin,95°C 30sec,60°C 15sec。實驗得到熔解曲線(melting curve)(圖 2-1, 2-2)、定量循環(huán)數(shù)(quantification cycle, Cq)(圖 3_1、3_2)和擴增曲線(amplification plot)(圖 4-1,4-2)用于后期分析。
[0070]2.4.實驗結(jié)果
[0071]本發(fā)明按照定量PCR反應程序?qū)?0ng含量的禾谷縊管蚜的無翅成蚜和有翅成蚜總RNA樣品進行定量PCR擴增，并結(jié)合溶解曲線來判斷擴增產(chǎn)物的特異性。一般理想的熔解曲線應該是單峰型曲線，如果出現(xiàn)兩個或兩個以上的峰，說明有引物二聚體等非特異性擴增產(chǎn)生。從引物的溶解曲線分析得出，無翅成蚜和有翅成蚜基本都呈現(xiàn)單峰性曲線，且峰值都高于引物二聚體的峰值(750C左右)，在82V處開始起峰，85°C處峰值最高，87~88°C之間落峰，說明本發(fā)明涉及的定量擴增引物(SEQ ID No4和5)擴增條帶單一，特異性強，沒有非特異性擴增出現(xiàn)。本發(fā)明從兩組不同蟲態(tài)(無翅成蚜和有翅成蚜)的熒光定量PCR擴增曲線可以看出，該對引物在模板的不同稀釋濃度下進行擴增，DNA數(shù)量都經(jīng)歷了典型的擴增過程(包括基線、指數(shù)增長期、線性期和平臺期)，說明該對引物可以用于擴增無翅成蚜和有翅成蚜兩種蟲態(tài)體內(nèi)的ACTl基因。標準曲線的擬合方程分別為I二 - 3.446X+31.119 (相關系數(shù)R2=0.999)，和y= — 3.484x+30.220 (相關系數(shù)R2=0.999)，根據(jù)公式擴增效率E=IOh7#W)-1，得出該對引物對無翅成蚜和有翅成蚜兩種蟲態(tài)體內(nèi)的ACTl基因的擴增效率E分別為95.067%和93.665%，說明該對引物的擴增效率很高，已接近100%。[0072]實施例3.作為檢測帶毒蚜蟲體內(nèi)大麥黃矮病毒(BYDV-PAV)CP基因的內(nèi)參基因
[0073]3.1.樣品制備
[0074]無毒的禾谷縊管蚜有翅成蚜和無翅成蚜取食感染BYDV-PAV的燕麥植株，在取食時間間隔為12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h和96h時分別取樣。每個取食時間間隔處，每種翅型的蚜蟲取8頭，合在一起作為一個樣品提取RNA。整體實驗設3次重復。所有樣品的RNA提取方法詳見實施例1中1.1所述。
[0075]3.2.CP基因的qPCR擴增引物合成
[0076]qPCR 擴增上游引物(SEQ ID N06):5/ -CGGGGCTGAGGTATTCGTAT-3'；
[0077]qPCR 擴增下游引物(SEQ ID N07):5/ -AGGACTTTGAGGCGGATTTG-3'。
[0078]由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(PAGE純化法)。
[0079]3.3.RT-qPCR 擴增
[0080]ACTl基因的RT-qPCR擴增方法見實施例2中2.3所述，每個樣品的ACTlCq值(Cqre)用于相對定量分析。CP基因的RT-qPCR擴增使用引物對Q CP F和Q CP R，其它試劑的使用和RT-qPCR的反應程序與ACTl基因的RT-qPCR擴增方法完全一致，每個樣品的CPCq值(Cqtogrt)用于相對定量分析。
[0081 ] 3.4.BYDV-PAV CP基因的相對表達量
[0082]每個樣品中CP基因的相對表達量(Relative Quantification,RQ)使用一下系列公式進行計算得到。`
[0083]Δ Cqtarget=HiinCq


target

-SampleCqtarget I
[0084]Qtarget=Etarget' ^itarget 2
[0085]Δ Cqre=minCqre-sampIeCqre 3
[0086]Qre=Er； ACqre 4
η,飛OtaTget
[0087]K(J = ^^5
[0088]其中E，=E+1
[0089]通過上述公式計算，有翅成蚜在不同時間間隔內(nèi)取食帶毒植株，體內(nèi)的BYDV-PAVCP基因相對于ACTl的表達量如圖5 ;無翅成蚜在不同時間間隔內(nèi)取食帶毒植株，體內(nèi)的BYDV-PAV CP基因相對于ACTl的表達量如圖6。
[0090]3.5.實驗結(jié)果
[0091]隨著蚜蟲(禾谷縊管蚜有翅成蚜或無翅成蚜)在帶毒燕麥上取食時間間隔的增長，BYDV-PAV CP基因的相對表達量也逐漸增加，并且都在取食時間間隔為72h之后開始呈波動狀態(tài)。這種情況與BYDV植物病毒在蚜蟲體內(nèi)的積累和循環(huán)方式相一致:在飼毒初期(一般在蚜蟲飼毒48h左右)就可以傳毒，BYDV逐漸積累于蚜蟲的腸道，然后穿過腸道壁進入血淋巴和(副)唾液腺，此階段病毒在蚜蟲體內(nèi)都呈增長趨勢；飼毒后期(48h之后接著飼毒)，部分BYDV隨蚜蟲的唾液會再分泌到植物之內(nèi)，此階段病毒含量略降低；蚜蟲繼續(xù)取食帶毒植株，病毒含量又會增加，如此循環(huán)下去。最終表明，ACTl基因在禾谷縊管蚜體內(nèi)表達穩(wěn)定，可作為定量蚜蟲體內(nèi)植物病毒的內(nèi)參基因。
【權(quán)利要求】
1.禾谷縊管蚜ACTl基因片段，其核苷酸序列如SEQID N0.1所示。
2.一種禾谷縊管蚜ACTl基因的部分序列的克隆方法，提取禾谷縊管蚜基因組總RNA，采用引物ACTlR進行RT-PCR擴增，以產(chǎn)物第一鏈cDNA作為模板、以引物對ACT1F/ACT1R進行PCR擴增，得到陽性克隆，最后經(jīng)測序驗證。其中引物序列為:
ACTIF:5' -ATGTGTGACGAAGAAGTAGC-3'；
ACTIR:5' -TTAGAAGCACTTTCTGTGC-3，。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，所述PCR擴增的反應條件如下:94°C3min, [94°C 45s、56°C lmin、72°C lmin]30 個循環(huán)，72°C延長 10min，4°C保存。
4.一種qPCR擴增ACTl基因部分序列的方法，抽提禾谷縊管蚜基因組總RNA，以試劑盒自帶引物混合物為引物進行RT反應，然后以產(chǎn)物第一鏈cDNA作為模板進行定量PCR擴增，熒光染料為SYBR Green I，其中定量PCR擴增中的禾谷縊管蚜的定量引物，其序列為:
QACTlF:5' -AACGGAAGCACCTTTGAACC-3'；
QACTIR:5/ -GGAAGAAGCAGCAGTAGCCAT-3'。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，所述定量PCR擴增采用兩步法，即在95°C預變性15min之后，先運行40個循環(huán)的95°C 10sec,59.2°C 32sec，72°C 32sec，再運行溶解曲線階段的95°C 15sec,60°C lmin,95°C 30sec,60°C 15sec。
6.權(quán)利要求1所述的禾谷 縊管蚜ACTl基因片段作為內(nèi)參基因應用于禾谷縊管蚜功能基因或介體內(nèi)黃矮病毒基因表達定量PCR檢測的應用。
【文檔編號】C12N15/12GK103820462SQ201410088424
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年3月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月11日
【發(fā)明者】王錫鋒, 武科科, 劉艷 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所