Grmzm2g054655基因作為玉米內(nèi)參基因的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于玉米轉(zhuǎn)基因檢測(cè)內(nèi)參基因，涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地，涉及玉米GRMZM2G054655基因作為轉(zhuǎn)基因檢測(cè)內(nèi)參基因的應(yīng)用。所述內(nèi)參基因?yàn)镚RMZM2G054655玉米特異性無(wú)內(nèi)含子基因，所述GRMZM2G054655基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示，設(shè)計(jì)引物特異性擴(kuò)增GRMZM2G054655基因的302bp的DNA片段，用于玉米轉(zhuǎn)基因檢測(cè)過程中定性、定量PCR反應(yīng)的內(nèi)參基因。本發(fā)明首次提出在玉米轉(zhuǎn)基因PCR檢測(cè)中建立通用的內(nèi)參基因；首次提出將玉米特異無(wú)內(nèi)含子基因GRMZM2G054655作為內(nèi)參基因應(yīng)用于玉米轉(zhuǎn)基因檢測(cè)；本發(fā)明提出的內(nèi)參基因，具有不同玉米品系穩(wěn)定性和不同植物物種特異性，拷貝數(shù)恒定，檢測(cè)靈敏度高，在玉米轉(zhuǎn)基因定性、定量檢測(cè)中具有重要的運(yùn)用價(jià)值。
【專利說(shuō)明】GRMZM2G054655基因作為玉米內(nèi)參基因的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地，涉及GRMZM2G054655基因作為不同品系玉米中特異性穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]自從首例轉(zhuǎn)基因番茄“FLAVR SAVR”問世以來(lái)，隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)基因作物(Genetically Modified Plants, GMP)越來(lái)越多的應(yīng)用于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，促進(jìn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，提高農(nóng)業(yè)產(chǎn)量，降低成本，為解決全球糧食問題開辟了新的方法。近幾年來(lái)我國(guó)轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展迅速有十幾種正在進(jìn)行田間試驗(yàn)的轉(zhuǎn)基因作物，其中3個(gè)主要產(chǎn)品為水稻、玉米和小麥。與此同時(shí)，隨著全球轉(zhuǎn)基因植物在全球范圍的廣泛種植，大量的轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品涌入我國(guó)市場(chǎng)。
[0003]內(nèi)參基因，是某種植物中具有種間特異性，種內(nèi)非特異性，低拷貝數(shù)特征的一類基因。種間特異性指的是選定的基因?qū)τ诖宋锓N是特異的，而在其他物種中具有很低的同源性?？梢酝ㄟ^網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)的生物信息分析獲得初步的資料，選擇候選基因，然后通過實(shí)驗(yàn)的方法對(duì)候選基因進(jìn)行篩選，最后選定合適的種間特異的基因作為植物內(nèi)參基因。種內(nèi)非特異性指的是內(nèi)參基因在同一物種的不同栽培種中具有很高的同源性和相似性。
[0004]植物內(nèi)參基因因其種間特異性、種內(nèi)非特異性和恒定拷貝數(shù)的特點(diǎn)，在轉(zhuǎn)基因植物及其加工產(chǎn)品的定性、定量PCR檢測(cè)和轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)過程中外源基因拷貝數(shù)的測(cè)定方面發(fā)揮著及其重要的作用。
[0005]本發(fā)明選取的GRMZM2G054655內(nèi)參基因，通過PCR技術(shù)檢測(cè)表明其在B73、鄭22、中黃68等14種不同品系玉米中具有非特異性，拷貝數(shù)恒定；在擬南芥、水稻、高粱等14種植物物種中均具有種間特異性；檢測(cè)靈敏度高；為轉(zhuǎn)基因玉米中外源基因的定性、定量檢測(cè)奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供GRMZM2G054655基因作為轉(zhuǎn)基因玉米中外源基因的定性、定量檢測(cè)穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因的應(yīng)用，其中，所述GRMZM2G054655基因片段的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1的DNA序列所示。
[0007]根據(jù)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】，在檢測(cè)上述GRMZM2G054655基因是否作為內(nèi)參基因在不同品系玉米中具有非特異性，拷貝數(shù)恒定，在不同植物物種中具有特異性。GRMZM2G054655基因定性PCR反應(yīng)的檢測(cè)靈敏度為0.5ng，定量PCR反應(yīng)體系的檢測(cè)靈敏度為 0.04ng。
[0008]擴(kuò)增GRMZM2G054655基因的定性、定量PCR引物對(duì)也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0009]圖1GRMZM2G054655內(nèi)參基因在不同品系玉米中特異性的定性分析。M:DL2000Plus DNA Marker ；1:B73 ；2:農(nóng)大 178 ；3:沈 3336 ；4:冀 35 ；5:5213 ；6:PI143 ；7:鄭
22；8:鄭 30 ；9:7922 ；10:吉 4112 ；11:8902 ；12:中黃68 ；13:金黃 73 ；14:5311 ；15:空白對(duì)照。PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳顯示在14個(gè)不同品系玉米中都能擴(kuò)增出大小為302bp、專一的條帶，條帶大小與預(yù)期的一致。從而說(shuō)明GRMZM2G054655基因具有種內(nèi)的非特異性。
[0010]圖2GRMZM2G054655內(nèi)參基因在不同植物物種中特異性的定性分析，M:DL2000Plus DNA Marker ；1:水稻；2:高粱；3:大麥；4:小麥；5:擬南芥；6:大豆；7:綠豆；8:番茄；9:煙草；10:向日葵；11:楊樹；12:棉花；13:油菜73 ；14:谷子；15-17:玉米B73 ；18:空白對(duì)照。只有在玉米基因組中才能夠擴(kuò)增到302bp的目的條帶，其他物種中沒有目的條帶。說(shuō)明GRMZM2G054655基因具有玉米特異性。
[0011]圖3GRMZM2G054655內(nèi)參基因在不同品系玉米中拷貝數(shù)的定量分析，ID1:B73;ID2:農(nóng)大 178 ；ID3:沈 3336 ；ID4:冀 35 ；ID5:5213 ；ID6:PI143 ；ID7:鄭 22 ；ID8:鄭 30 ；ID9:7922 ；ID10:吉 4112 ；ID11:8902 ；ID12:中黃 68 ；ID13:金黃 73 ;皿4:5311。結(jié)果表明GRMZM2G054655基因在不同玉米品種中拷貝數(shù)恒定。
[0012]圖4GRMZM2G054655 定性檢測(cè)靈敏度分析。M:DL2000DNA Marker ; 1-2:模板濃度50ng/ μ L ;3_4:模板濃度 5ng/ μ L ;5_6:模板濃度 0.5ng/ μ L ;7_8:模板濃度 0.05ng/ μ L ；9-10:模板濃度0.01ng/ μ L0電泳結(jié)果顯示定性PCR反應(yīng)檢測(cè)靈敏度為0.5ng。
【具體實(shí)施方式】
[0013]本研究利用現(xiàn)有的基因組測(cè)序及PI⑶、NCBI公共數(shù)據(jù)庫(kù)信息，首先通過BLAST和BLINK序列比對(duì)來(lái)尋找玉米內(nèi)參基因的候選基因。然后從種內(nèi)一致性和穩(wěn)定性、種間特異性、拷貝數(shù)穩(wěn)定等方面進(jìn)行內(nèi)參基因的篩選，經(jīng)過非玉米物種(水稻、高粱、大麥、擬南芥等)及不同的玉米品種中的物種特異性定性、定量PCR檢測(cè)，拷貝數(shù)分析，最終選用以玉米GRMZM2G054655作為玉米轉(zhuǎn)基因檢測(cè)內(nèi)參基因。
[0014]實(shí)施例1:玉米特異性內(nèi)參基因GRMZM2G054655在不同品系玉米中非特異性和其他植物物種中特異性的定性分析
[0015]1、基因組DNA提取:準(zhǔn)備65°C的水?。蝗?0g材料在液氮中磨成粉末，將所得粉末移至預(yù)冷的50ml離心管中；加入20ml預(yù)熱至65°C的2 X CTAB提取緩沖液，充分混勻，65°C溫育45分鐘，期間輕輕搖動(dòng)混勻；加入100ul100mg/ml的蛋白酶K，混勻后于37°C溫育30分鐘；混合物冷卻后加入等體積的酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)混合溶液，顛倒混勻使管內(nèi)混合物成乳濁液；12000rpm離心10分鐘，重復(fù)數(shù)次直至抽提物變的清澈；取上清加入等體積的異丙醇，混勻，_20°C放置I小時(shí)；12000rpm離心10分鐘；去上清，沉淀用75%乙醇洗后室溫晾干；用IOOul TE溶解沉淀，加入Iul RNA酶溶液(5mg/ml)，37°C溫育30分鐘；加入等體積的酹:氯仿(I:1)混合溶液抽提，12000rpm離心5分鐘:取上清,加入1/10體積的3M的NaAc溶液和2倍體積的無(wú)水乙醇，_20°C放置30分鐘；12000rpm離心10分鐘；去上清，沉淀用75%乙醇洗后，晾干，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0016]2、玉米特異性內(nèi)參基因GRMZM2G054655的引物合成:
[0017]GRMZM2G054655的定性引物Fl如序列表SEQ ID NO:2所示，為:
[0018]5' -TCCGACAAGAAAGATGAG-3'；
[0019]GRMZM2G054655的定性引物Rl如序列表SEQ ID NO:3所示，為::[0020]5' -TGACGCAAGTGTAAGGTG-3'；
[0021]由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。
[0022]3、PCR擴(kuò)增反應(yīng)
[0023]PCR檢測(cè)體系和程序?yàn)?
【權(quán)利要求】
1.GRMZM2G054655基因作為玉米內(nèi)參基因的應(yīng)用，所述GRMZM2G054655基因的序列如序列表SEQ ID NO:1所示。
2.如權(quán)利要求1所述的GRMZM2G054655基因作為玉米內(nèi)參基因的應(yīng)用，其特征為:在14種玉米品種中具有種內(nèi)非特異性，拷貝數(shù)恒定；在14種不同植物物種中具有種間特異性。
3.如權(quán)利要求1所述的 GRMZM2G054655基因作為玉米內(nèi)參基因在玉米基因定性檢測(cè)中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的GRMZM2G054655基因作為玉米內(nèi)參基因在玉米基因定性檢測(cè)中的應(yīng)用，其特征為:在14種玉米品種中具有種內(nèi)非特異性，拷貝數(shù)恒定；在14種不同植物物種中具有種間特異性；定性檢測(cè)靈敏度達(dá)到0.5ng。
5.如權(quán)利要求1所述的GRMZM2G054655基因作為玉米內(nèi)參基因在玉米基因定量檢測(cè)中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求5所述的GRMZM2G054655基因作為玉米內(nèi)參基因在玉米基因定量檢測(cè)中的應(yīng)用，其特征為:在14種玉米品種中具有種內(nèi)非特異性，拷貝數(shù)恒定；在14種不同植物物種中具有種間特異性；定量檢測(cè)靈敏度達(dá)到0.04ng。
7.一種定性分析玉米內(nèi)參基因GRMZM2G054655的方法，其特征為包括以下步驟: (1)基因組DNA提取:準(zhǔn)備65°C的水??；取2(^材料在液氮中磨成粉末，將所得粉末移至預(yù)冷的50ml離心管中；加入20ml預(yù)熱至65°C的2 X CTAB提取緩沖液，充分混勻，65°C溫育45分鐘，期間輕輕搖動(dòng)混勻；加入100ul100mg/ml的蛋白酶K，混勻后于37°C溫育30分鐘；混合物冷卻后加入等體積的酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)混合溶液，顛倒混勻使管內(nèi)混合物成乳濁液；12000rpm離心10分鐘，重復(fù)數(shù)次直至抽提物變的清澈；取上清加入等體積的異丙醇，混勻，_20°C放置I小時(shí)；12000rpm離心10分鐘；去上清，沉淀用75%乙醇洗后室溫晾干；用IOOul TE溶解沉淀，加入Iul RNA酶溶液(5mg/ml)，37°C溫育30分鐘；加入等體積的酹:氯仿(I:1)混合溶液抽提，12000rpm離心5分鐘:取上清,加入1/10體積的3M的NaAc溶液和2倍體積的無(wú)水乙醇，_20°C放置30分鐘；12000rpm離心10分鐘；去上清，沉淀用75%乙醇洗后，晾干獲得基因組DNA，_20°C保存?zhèn)溆茫? (2)玉米特異性內(nèi)參基因GRMZM2G054655的引物合成: GRMZM2G054655的定性引物Fl如序列表SEQ ID NO:2所示，為: 5' -TCCGACAAGAAAGATGAG-3'； GRMZM2G054655的定性引物Rl如序列表SEQ ID NO:3所示，為:: 5' -TGACGCAAGTGTAAGGTG-3'； (3)PCR擴(kuò)增反應(yīng) PCR檢測(cè)體系和程序?yàn)?
8.一種定量分析玉米內(nèi)參基因GRMZM2G054655的方法，其特征為包括以下步驟: (1)基因組DNA提取:準(zhǔn)備65°C的水??；取20g材料在液氮中磨成粉末，將所得粉末移至預(yù)冷的50ml離心管中；加入20ml預(yù)熱至65°C的2 X CTAB提取緩沖液，充分混勻，65°C溫育45分鐘，期間輕輕搖動(dòng)混勻；加入100ul100mg/ml的蛋白酶K，混勻后于37°C溫育30分鐘；混合物冷卻后加入等體積的酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)混合溶液，顛倒混勻使管內(nèi)混合物成乳濁液；12000rpm離心10分鐘，重復(fù)數(shù)次直至抽提物變的清澈；取上清加入等體積的異丙醇，混勻，_20°C放置I小時(shí)；12000rpm離心10分鐘；去上清，沉淀用75%乙醇洗后室溫晾干；用IOOul TE溶解沉淀，加入Iul RNA酶溶液(5mg/ml)，37°C溫育30分鐘；加入等體積的酚:氯仿(I:1)混合溶液抽提，12000rpm離心5分鐘:取上清，加入1/10體積的3M的NaAc溶液和2倍體積的無(wú)水乙醇，_20°C放置30分鐘；12000rpm離心10分鐘；去上清，沉淀用75%乙醇洗后，晾干獲得基因組DNA，_20°C保存?zhèn)溆茫? (2)選取GRMZM2G054655基因的特異性區(qū)域進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物使用PrimerExpress3.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)；玉米特異性內(nèi)參基因GRMZM2G054655熒光定量引物合成: GRMZM2G054655的定量引物F2如序列表SEQ ID NO:4所示，為:: 5' -GCTACGCCCTTCCCCATT-3'； GRMZM2G054655的定量引物R2如序列表SEQ ID NO:5所示，為:: 5' -GGCTTGCATGGATCCAAAAA-3'； (3)定量PCR擴(kuò)增反應(yīng) 定量PCR反應(yīng)體系:
9.在如權(quán)利要求7所述的一種定性分析玉米內(nèi)參基因GRMZM2G054655的方法中使用的GRMZM2G054655的定性引物，其特征為: GRMZM2G054655的定性引物Fl如序列表SEQ ID NO:2所示，為: 5' -TCCGACAAGAAAGATGAG-3'； GRMZM2G054655的定性引物Rl如序列表SEQ ID NO:3所示，為:
5' -TGACGCAAGTGTAAGGTG-3'。
10.在如權(quán)利要求8所述的一種定量分析玉米內(nèi)參基因GRMZM2G054655的方法中使用的GRMZM2G054655的定量引物，其特征為: GRMZM2G054655的定量引物F2如序列表SEQ ID NO:4所示，為: 5' -GCTACGCCCTTCCCCATT-3'； GRMZM2G054655的定量引物R2如序列表SEQ ID NO:5所示，為:
5' -GGCTTGCATGGAT CCAAAAA-3'。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103981272SQ201410233167
【公開日】2014年8月13日 申請(qǐng)日期:2014年5月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月28日
【發(fā)明者】江海洋, 王兆明, 鄧琳, 程備久, 馬慶 申請(qǐng)人:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)