擬南芥抗橡膠樹白粉菌基因roh1的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及擬南芥抗橡膠樹白粉菌基因 ROHl的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 橡膠樹白粉病是由橡膠樹白粉菌（Oidium heveae)引發(fā)的一種真菌病害。該病發(fā) 生時間，以每年春節(jié)前后橡膠樹開始萌芽或抽出古銅色葉開始，如遇氣溫偏涼、空氣濕度大 的天氣，若未及時采取噴藥防治，白粉病會在3~5天后造成大面積膠樹新抽葉感病。嫩葉 感病初期，葉正面或反背面出現(xiàn)銀白色蜘蛛網(wǎng)狀菌絲，而后逐漸擴大，在葉表面長出白色粉 狀物，形成大小不一的不規(guī)則粉斑（圖1)。發(fā)病嚴重時，葉片正反兩面布滿白色粉狀物，嚴 重的葉片主脈或側(cè)脈生長成畸形，整個葉片不能正常伸長，皺縮，遇到高溫時，葉變黃，最終 脫落（圖2)。不脫落的病葉會留下黃褐色壞死斑。如當年發(fā)生白粉病害較重又得不到有效 控制，將導致橡膠樹大量新抽葉片落葉，使橡膠樹不能正常開割，對當年膠乳產(chǎn)量有顯著影 響。
[0003] 在世界范圍內(nèi)，橡膠樹白粉病得不到有效的控制將對當年膠乳產(chǎn)量有顯著影響， 造成巨大的經(jīng)濟損失。當前，我國對橡膠樹白粉病的防治主要以化學防治為主，對環(huán)境造成 了嚴重污染。因而，從分子水平進行抗白粉病基因的篩選及抗病育種是一個非常有希望的 解決橡膠樹白粉病的途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的一個目的是提供ROHl蛋白或其編碼基因或含有其編碼基因的重組載體 的用途。
[0005] 本發(fā)明的一個目的是提供ROHl蛋白或其編碼基因或含有其編碼基因的重組載體 在調(diào)控植物抗病性中的應(yīng)用；
[0006] 所述ROHl蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2。
[0007] 上述應(yīng)用中，所述ROHl蛋白編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列1。
[0008] 上述應(yīng)用中，所述調(diào)控植物抗病性為提高植物抗病性。
[0009] 上述應(yīng)用中，所述病的病原菌為橡膠樹白粉菌；所述植物為單子葉植物或雙子葉 植物；所述雙子葉植物具體為十字花科植物。所述十字花科植物尤其具體為擬南芥突變體 N680465或擬南芥突變體N680496。
[0010] ROHl蛋白或其編碼基因或含有其編碼基因的重組載體在培育抗病轉(zhuǎn)基因植物中 的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍。
[0011] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種培育抗病轉(zhuǎn)基因植物的方法。
[0012] 本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：將ROHl蛋白編碼基因?qū)肽康闹参?，得到轉(zhuǎn) 基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的抗病性高于所述目的植物；
[0013] 所述ROHl蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2。
[0014] 上述方法中，所述ROHl蛋白編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列1。
[0015] 上述方法中，所述ROHl蛋白編碼基因通過重組載體導入目的植物；
[0016] 所述重組載體為將所述ROHl蛋白編碼基因插入表達載體，得到的表達ROHl蛋白 的重組載體。
[0017] 上述病的病原菌為橡膠樹白粉菌。
[0018] 上述方法或應(yīng)用中，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述雙子葉植物具體 為十字花科植物。所述十字花科植物尤其具體為擬南芥突變體N680465或擬南芥突變體 N680496。
[0019] 本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明從橡膠樹表達譜分析發(fā)現(xiàn)，橡膠樹含有大量 TIR-NB-LRR類抗性蛋白，由于擬南芥AtEDSl在橡膠樹上的同源基因 HbEDSl可以功能互補 擬南芥AtEDSl突變引起的抗性減弱，推測橡膠樹存在與擬南芥類似的抗性機制。本發(fā)明將 ROHl基因互補ROHl突變的擬南芥突變體，得到轉(zhuǎn)基因植物恢復野生型擬南芥的抗橡膠樹 白粉病表型。因此證明，ROHl為抗橡膠樹白粉病基因，可用于培育抗病育種奠定了非常好 的基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0020] 圖1為橡膠樹白粉菌在橡膠樹上的致病圖片。
[0021] 圖2為橡膠樹白粉菌在橡膠樹葉片上的后期致病圖片。
[0022] 圖3為橡膠樹白粉菌在擬南芥野生型和相應(yīng)突變體，以及橡膠樹GT-I品系上的致 病圖片。
[0023] 圖4為橡膠樹白粉菌在擬南芥野生型和相應(yīng)突變體上激活的細胞死亡結(jié)果Bar = IOOuM0
[0024] 圖5為橡膠樹白粉菌在擬南芥野生型和相應(yīng)突變體上激活的活性氧產(chǎn)生結(jié)果Bar =IOOuM0
[0025] 圖6為橡膠樹白粉菌在擬南芥野生型和相應(yīng)突變體上激活的胼胝體沉積結(jié)果 與Col-O相比進行統(tǒng)計學分析P〈0. 01)
[0026] 圖7為橡膠樹白粉菌在擬南芥野生型和相應(yīng)突變體上激活的致病相關(guān)基因 PRl表 達結(jié)果（**與Col-ο相比進行統(tǒng)計學分析P〈0. 01)。
[0027] 圖8為考馬斯亮藍染色橡膠樹白粉菌在擬南芥上及其相應(yīng)突變體上的侵染結(jié)果 Bar = lOOuM。
[0028] 圖9為橡膠樹白粉菌在擬南芥野生型和相應(yīng)突變體，以及橡膠樹GT-I品系上產(chǎn)生 的分生孢子計數(shù)結(jié)果（**與Col-O相比進行統(tǒng)計學分析P〈0. 01)。
[0029] 圖10為橡膠樹白粉菌在擬南芥野生型和突變體rohl以及ROHl轉(zhuǎn)基因植株上的 致病圖片，分生孢子產(chǎn)生結(jié)果（**與Col-ο相比進行統(tǒng)計學分析P〈0. 01)。
[0030] 圖11為ROHl轉(zhuǎn)基因植物蛋白檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0031 ] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0032] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0033] 實施例1、與橡膠白粉病菌抗性相關(guān)基因 ROHl的篩選
[0034] I、與橡膠白粉病菌抗性相關(guān)通路確定
[0035] 橡膠白粉病菌HO-73,記載在如下文獻中：橡膠樹白粉菌收集及DNA和RNA提取方 法比較，廣東農(nóng)業(yè)科學，2013年第11期，134-139.萬三連，梁鵬，宋風雅，張宇，劉文波，繆衛(wèi) 國，鄭服叢。
[0036] 橡膠樹白粉菌能否侵染模式植物擬南芥，在擬南芥上介導的是怎樣的一種相互作 用，以及擬南芥是否可以作為工具來研宄橡膠樹白粉菌的致病機理，目前仍然是未知的。
[0037] 通過將橡膠白粉病菌HO-73接種橡膠樹GT-I品系、擬南芥野生型Col-O以及擬南 芥突變體edsl，pad4, rarl，ndrl，nprl，NahG和sid2的葉片。接種10天后，發(fā)現(xiàn)在橡膠樹 GT-I葉片上出現(xiàn)了明顯的白粉病病斑，有趣的是，在擬南芥Col-O葉片上出現(xiàn)黃化，壞死的 表型，這種表型依賴于EDSl，PAD4, RARl和SA通路的相關(guān)基因 NPRl，NahG以及SID2,但不 依賴于NDRl (圖3)。進一步試驗發(fā)現(xiàn)，Oidium heveaeHNl 106在Col-O葉片上激發(fā)大量的 細胞死亡（圖4)，活性氧產(chǎn)生（圖5)，胼胝體沉積（圖6)和致病相關(guān)基因的劇烈表達（圖 7)，并且這些表型同樣依賴于EDSl，PAD4, RARl和SA通路，但不依賴于NDRl。
[0038] 通過顯微鏡觀察，接種Oidium heveae HN1106 10天后，在Col-O葉片上僅僅可 以看到散在的真菌孢子以及微量的菌絲生長，不能看到分生孢子的產(chǎn)生；在突變體edsl和 pad4上，可以觀察到大量的菌絲生長以及大量分生孢子的產(chǎn)生；在rarl突變體上可以看到 大量菌絲的生長，但不能看到分生孢子的產(chǎn)生；SA通路的突變體和ndrl突變體表現(xiàn)出與野 生型相同的表型（圖8,9)。
[0039] 上述結(jié)果表明，橡膠樹白粉菌可以被擬南芥識別激活抗病反應(yīng)，并且抗病基因的 功能依賴于EDSl，PAD4,但不依賴于NDRl。
[0040] 2、與橡膠白粉病菌抗性相關(guān)基因 ROHl的篩選
[0041] 提取86個依賴于EDS1，PAD4、但不依賴于NDRl信號通路的擬南芥突變體的基因 組DNA，PCR鑒定后，并且初步獲得了 58個基因的突變體純合系。將橡膠樹白粉菌分別接 種于58個突變體純合系上，篩選出1個對橡膠樹白粉菌感病擬南芥突變體N680465。進一 步訂購了該突變基因的另一個位點插入突變體N680496。出售公司：NASC，The European Arabido