基于tem-pcr和基因芯片檢測豬病毒性疾病的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于豬攝檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種基于TEM-PCR和基因忍片檢測豬病 毒性疾病的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 非洲豬攝病毒(ASFV)、豬水瘤病病毒（SVDV)、口蹄疫病毒(FMDV)、豬偽狂犬病毒 (PRV)是豬病的4種重要病原。目前我國雖無非洲豬攝發(fā)生的報道，但是，由于鄰國俄羅斯多 次報道該病的發(fā)生和其可能帶來的嚴重后果，能提早建立一種檢測方法對預(yù)防該病非常必 要，且能為將來研究該病提供一定的實驗基礎(chǔ)。豬水瘤病和口蹄疫在臨床表現(xiàn)上非常相似， 很難從臨床癥狀將它們區(qū)別開來，所W能建立一種快速、準確檢測和鑒別運兩種病的方法 對將來的治療和預(yù)后意義重大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種基于TEM-PCR和基因忍片檢測豬病毒性疾病的方法， 旨在建立一種快速、準確檢測和鑒別豬水瘤病和口蹄疫的方法。
[0004] 本發(fā)明是運樣實現(xiàn)的，一種基于TEM-PCR和基因忍片檢測豬病毒性疾病的方法，所 述基于TEM-PCR和基因忍片檢測豬病毒性疾病的方法依據(jù)祀序列富集多重PCR，采用4對特 異性的套式PCR引物和探針，并在各內(nèi)引物的5'端分別加上能被一對通用引物識別的標簽 序列，Primer Mix的濃度為0.2μΜ，反應(yīng)的退火溫度為50°C。
[000引進一步，所述基于TEM-PCR和基因忍片檢測豬病毒性疾病的方法包括：
[0006] DNA微陣列制備:通過原位合成法將寡核巧酸固定到基片上，采用玻片為基因忍片 的支持物，支持物，在聚合反應(yīng)之前，要使表面衍生出徑基或氨基；
[0007] 從細胞培養(yǎng)物或組織病料中提取核酸，通過PCR方法進行擴增，所有擴增產(chǎn)物用巧 光標記素對產(chǎn)物進行標記，將巧光素標記在下游引物的5 '末端；
[000引忍片的雜交；
[0009] 雜交反應(yīng)過后，各陣列將帶有不同濃度的巧光標記，借助激光共聚焦顯微掃描儀 或CCD成像設(shè)備，根據(jù)探針標記所用的巧光素種類選擇激發(fā)光波長進行掃描，然后應(yīng)用數(shù)據(jù) 分析軟件自動獲取基因忍片上的各種信息，并對信息進行處理獲得結(jié)果。
[0010] 進一步，所述PCR擴增根據(jù)ASFV P72序列、FMDV-0型序列、PRV gB序列W及SVDV序 列，通過DNAMAN比較同源性，選取保守序列。
[0011] 進一步，所述PCR擴增所用化和Ro為特異性外引物，F(xiàn)i和Ri為特異性內(nèi)引物，F(xiàn)s和 Rs為通用引物。
[001引進一步，所述PCR擴增中基因忍片探針在祀序列區(qū)段內(nèi)，設(shè)計FMDV-0型、ASFV、PRV、 SVDV的特異性探針，基因忍片探針序列及修飾方法：
[0013]每條探針的5'端均通過16個胸腺喀晚核巧酸連接有一個氨基，使用一段隨機序列 作為位置質(zhì)控，其5'端連接有一個氨基，3'端連接一個切3巧光基團；使用煙草花葉病毒的 一段基因作為雜交質(zhì)控其5'端連接有一個切3巧光基團，并使用它的互補序列作為雜交質(zhì) 控探針其5'端同樣通過16個胸腺喀晚核巧酸連接有一個氨基。
[0014] 進一步，所述基因忍片探針的序列為：
[0015] ASFV NH2-T1 e-CTTGCTATTCCCTCGGTATCCATTCCCTTCGGCG
[0016] PRV NH2-TI6-CGGTCCCTGGGCTCCTCCCTCGTGAGCAACAT
[0017] FMDV-0 NH2-TI6-CCTTTGCACGCCGTGGGACCATACAGGAGAAGTT
[0018] SVDV NH2-T1 6-GCAAGGCTCGCCAGGCTGGTGGTGGAAGTT
[0019] PC NH2-GCTGCCTCGGCAAGGAGT-切3
[0020] HC Cy3-CGACTATAACCTTCGCTGCCGTCATTGGGTCAA [00引]PC-p NH2-T16-TTGACCCAATGACGGCAGCGAAGGTTATAGTCG。
[0022] 進一步，所述PCR擴增的反應(yīng)體系：
[0023] 反應(yīng)體系50]iL:2XPremix rTaq 25?Α，2μΜ Primer Mix f5yL，10yM Fs 化L，10yM Rs aiL，RNase-free dd出0 1 化L。
[0024] 進一步，所述基因忍片的雜交
[0025] 將Tem-PCR產(chǎn)物祉1，雜交質(zhì)控（1μΜ)1μ1，2Χ樣品雜交液如1置于PCR儀中，在95°C 條件下變性5min，取出置于冰上，冰浴5min;
[0026] 打開忍片雜交盒，將雜交盒平放在桌面上，在雜交盒底部凹槽內(nèi)加入約500~1000 化超純水;將忍片正面朝上放入雜交盒內(nèi)兩個定位銷之間；放上忍片蓋片，注意有凸臺的一 面朝向忍片，上端先接觸忍片，再緩緩蓋下；
[0027] 然后用移液器通過蓋片加樣孔注入17化變性后的雜交液，雜交液會憑借液體表面 張力在蓋片下面的凸臺和忍片表面之間形成一道液膜，蓋緊雜交盒蓋。安裝上侶合金封條， 置42°C雜交盒中避光雜交化；
[0028] 雜交后，取出忍片放在42°C預(yù)熱好的洗液I中，42°C震蕩清洗4min，再用42°C預(yù)熱 好的洗液II，42°C震蕩清洗4min，最后用42°C預(yù)熱好的清水清洗一次，裝于塑料玻片盒，W lOOOg/min速度離屯、干燥5min后進行掃拭忍片信息。
[0029] 本發(fā)明提供的基于TEM-PCR和基因忍片檢測豬病毒性疾病的方法，與現(xiàn)有技術(shù)相 比，具有W下優(yōu)勢：
[0030] 1、本發(fā)明采用Tem-PCR(祀序列富集多重PCR,Target-Enriched Multiplex PCR) 擴增技術(shù)來擴增祀序列，克服了傳統(tǒng)PCR方法的諸多缺點，其兼容性、特異性、靈活性等都比 傳統(tǒng)PCR方法好得多；且本發(fā)明對Tem-PCR的反應(yīng)條件作了優(yōu)化，建立了一套準確高效，方便 快捷的檢測方法，臨床樣品可在短時間內(nèi)完成檢測，為疾病的早期診斷和治療提供了重要 的契機。
[0031] 2、基于Tem-PCR,用于基因忍片信號檢測的巧光標記切3只需要加在通用超級引物 下游(Rs)就能實現(xiàn)所有待檢祀序列都被加上巧光標記，降低了反應(yīng)的背景噪音，且大大的 節(jié)省了實驗經(jīng)費。
[0032] 3、本發(fā)明首次結(jié)合了先進的Tem-PCR多重擴增技術(shù)和基因忍片檢測技術(shù)，建立了 在一張忍片上可同時檢測45。￥、？3￥、5￥0￥、。10￥4種病原的體系，為^后的重要病原微生物 的分子生物學(xué)檢測奠定了基礎(chǔ)。
[0033] 4、在單管反應(yīng)中實現(xiàn)多種不同基因的高通量檢測，避免了多重PCR擴增效率因多 對引物不兼容而受到影響，沒有統(tǒng)一的反應(yīng)條件，存在引物擴增偏愛性。
【附圖說明】
[0034] 圖1是本發(fā)明實施例提供的基于TEM-PCR和基因忍片檢測豬病毒性疾病的方法流 程圖。
[0035] 圖2是本發(fā)明實施例提供的雜交結(jié)果圖；
[0036] 圖中：1 -8: PC、肥、ASFV、FMDV-0、PRV、SVDV、NC、PC。
[0037] 圖3是本發(fā)明實施例提供的雜交結(jié)果；
[0038] 圖中：1 -8: PC、肥、ASFV、FMDV-0、PRV、SVDV、NC、PC。
[0039] 圖4是本發(fā)明實施例提供的雜交結(jié)果圖；
[0040] 圖中：1 -8:PC、肥、ASFV、FMDV-0、PRV、SVDV、NC、PC。
[0041] 圖5是本發(fā)明實施例提供的雜交結(jié)果；
[0042] 圖中：1 -8:PC、肥、ASFV、FMDV-0、PRV、SVDV、NC、PC。
【具體實施方式】
[0043] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，W下結(jié)合實施例，對本發(fā)明 進行進一步詳細說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用W解釋本發(fā)明，并不用于 限定本發(fā)明。
[0044] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的應(yīng)用原理作詳細的描述。
[004引如圖1所示，本發(fā)明實施例的基于TEM-PCR和基因忍片檢測豬病毒性疾病的方法包 括W下步驟：
[0046] S101:DNA微陣列制備:通過原位合成法將寡核巧酸固定到基片上，采用玻片為基 因忍片的支持物，支持物，在聚合反應(yīng)之前，要使表面衍生出徑基或氨基；
[0047] S102:從細胞培養(yǎng)物或組織病料中提取核酸，通過PCR方法進行擴增，所有擴增產(chǎn) 物用巧光標記素對產(chǎn)物進行標記，將巧光素標記在下游引物的5'末端；
[004引 S103:忍片的雜交；
[0049] S104:雜交反應(yīng)過后，各陣列將帶有不同濃度的巧光