固定化細(xì)胞連續(xù)生產(chǎn)單葡萄糖醛酸基甘草次酸的工藝及裝置制造方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及利用產(chǎn)紫青霉Li-3（Penicillium?purpurogenum?Li-3）CGMCC?NO.5446固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化甘草酸連續(xù)生產(chǎn)單葡萄糖醛酸基甘草次酸的工藝及裝置，屬于生物化工領(lǐng)域。用硅藻土和海藻酸鈣共同固定化產(chǎn)紫青霉Li-3，固定化細(xì)胞在具隔離篩填充床反應(yīng)器內(nèi)轉(zhuǎn)化甘草酸連續(xù)生產(chǎn)單葡萄糖醛酸基甘草次酸；本發(fā)明中的具隔離篩填充床反應(yīng)器是在常規(guī)填充床反應(yīng)器內(nèi)添加隔離篩裝置，使填充床分層負(fù)載固定化細(xì)胞珠體，以此來(lái)降低珠體自身重力引起的破損；本發(fā)明能長(zhǎng)時(shí)間保持細(xì)胞活力，延長(zhǎng)固定化細(xì)胞珠體壽命，提高了產(chǎn)物純度，大大降低了生產(chǎn)成本，使大規(guī)模連續(xù)生產(chǎn)單葡萄醛酸基甘草次酸成為可能。
【專利說(shuō)明】固定化細(xì)胞連續(xù)生產(chǎn)單葡萄糖醛酸基甘草次酸的工藝及裝
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域，涉及一種利用產(chǎn)紫青霉L1-3CGMCC N0.5446固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化甘草酸連續(xù)生產(chǎn)單葡萄糖醛酸基甘草次酸的工藝及其所用裝置。
【背景技術(shù)】
[0002]單葡萄醒酸甘草次酸(Glycyrrhetinicacid monoglucuronide, GAMG)是甘草酸(Glycyrrhizin, GL)改性去掉一個(gè)葡萄糖醒酸基的衍生物,它是一種高甜度低熱量的天然功能性甜味劑，甜度是蔗糖的1000多倍。單葡萄糖醛酸基甘草次酸的性質(zhì)穩(wěn)定，具有顯著的耐高溫、耐酸和耐高壓及甜感滯后、較好的乳化性和起泡性等優(yōu)點(diǎn)。單葡萄醛酸甘草次酸在保有甘草酸的抗炎癥、抗病毒、抗腫瘤的療效外，因其極性適中，在體內(nèi)具有良好的溶解度和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的能力，較甘草酸具有更好的生物利用度。且單葡萄糖醛酸基甘草次酸的半致死量為5000mg/kg,遠(yuǎn)大于甘草酸的805mg/kg,無(wú)致畸變作用。
[0003]單葡萄醛酸甘草次酸的制備方法有化學(xué)法和生物酶法，化學(xué)法主要是通過(guò)在酸性條件下水解甘草酸分子結(jié)構(gòu)中的糖苷鍵，但是酸對(duì)甘草酸分子結(jié)構(gòu)中的兩個(gè)糖苷鍵選擇性不強(qiáng)，經(jīng)常造成副產(chǎn)物甘草次酸的大量產(chǎn)生?；瘜W(xué)法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，產(chǎn)物難以獲得，而且會(huì)產(chǎn)生大量的污水，造成環(huán)境污染，是一種非環(huán)境友好型技術(shù)。相比之下，生物酶法具有反應(yīng)速率高、底物特異性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫及對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。目前生物法轉(zhuǎn)化甘草酸合成單葡萄糖醛酸基甘草次酸所用的催化劑主要為微生物細(xì)胞或通過(guò)微生物細(xì)胞提取的酶，但往往存在的問(wèn)題是作為催化劑的酶或菌體細(xì)胞壽命短，產(chǎn)物雜質(zhì)多，造成后續(xù)分離純化步驟操作復(fù)雜，成本高。
[0004]固定化細(xì)胞就是被限制自由移動(dòng)的細(xì)胞，即細(xì)胞受到物理化學(xué)等因素約束或限制在一定的空間界限內(nèi)，但細(xì)胞內(nèi)的酶仍保留催化活性并且具有能被反復(fù)或連續(xù)使用的活力。固定化細(xì)胞它不需要破碎細(xì)胞而直接能利用胞內(nèi)酶，酶在細(xì)胞內(nèi)比較穩(wěn)定，固定化細(xì)胞密度大、吸附量高，反應(yīng)`速度加快，提高了生產(chǎn)能力，從而降低了生產(chǎn)成本，并且在分離純化過(guò)程中菌體細(xì)胞易分離，固定化細(xì)胞可以重復(fù)使用。填充床反應(yīng)器(packed bedreactor, PBR)是固定化細(xì)胞技術(shù)中使用最普遍、應(yīng)用最廣泛的一種反應(yīng)器。填充床反應(yīng)器具有單位反應(yīng)器容積的催化劑顆粒裝填密度高，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，建造費(fèi)用低，操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)速度快，易于擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模，可實(shí)現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)。
[0005]產(chǎn)紫青霉Li_3(Penicilliumpurpurogenum Li_3)CGMCC N0.5446其表達(dá)的 β-葡萄糖醛酸苷酶具有嚴(yán)格的底物特異性，水解甘草酸非還原端的葡萄糖醛酸基生成單葡萄糖醛酸基甘草次酸。利用生物法轉(zhuǎn)化連續(xù)生產(chǎn)單葡萄糖醛酸基甘草次酸可以通過(guò)產(chǎn)紫青霉L1-3CGMCCN0.5446固定化細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提高單葡萄糖醛酸基甘草次酸的生產(chǎn)效率,降低其生產(chǎn)成本。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明利用海藻酸鈉包埋和硅藻土吸附共固定化產(chǎn)紫青霉L1-3CGMCC N0.5446，優(yōu)化固定化條件后，以一定柱孔隙率裝柱，以裝柱后的固定化細(xì)胞為催化劑，將一定濃度的甘草酸底物溶液，以一定流速流經(jīng)填充柱，在最佳的反應(yīng)條件下轉(zhuǎn)化生成單葡萄糖醛酸基甘草次酸；針對(duì)傳統(tǒng)的填充床反應(yīng)器中反應(yīng)不理想，填充床中底部的固定化顆粒更容易破裂的特點(diǎn)，對(duì)傳統(tǒng)的填充床反應(yīng)器進(jìn)行了改進(jìn)。在改進(jìn)型填充床反應(yīng)器中，添加了隔離篩裝置將顆粒分層鋪開，隔離篩(如附圖2所示)包括兩部分一個(gè)是底盤，由網(wǎng)格構(gòu)成；另一部分為支撐體。每層隔離篩都可以從反應(yīng)器一端取出。該反應(yīng)器相對(duì)于傳統(tǒng)的柱式填充床反應(yīng)器有以下優(yōu)點(diǎn):其一，避免了上面顆粒對(duì)下面顆粒的擠壓，每層顆粒都有支撐點(diǎn)，從而減緩了反應(yīng)過(guò)程中顆粒的變形。其二，固定化細(xì)胞顆粒能夠更有效的與反應(yīng)液接觸，從而更有利于酶的催化和反應(yīng)過(guò)程中物質(zhì)的傳遞。其三，便于清洗和更換顆粒，若處于不同層的顆粒強(qiáng)度變化不一致，則可以單獨(dú)替換，從而降低反應(yīng)成本。
[0008]本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
[0009](I)種子液培養(yǎng)和發(fā)酵罐培養(yǎng)制備產(chǎn)紫青霉Li_3 (Penicillium purpurogenumL1-3) CGMCC N0.5446 細(xì)胞；
[0010](2)固定化產(chǎn)紫青霉 Li_3 (Penicillium purpurogenum L1-3)CGMCC N0.5446 細(xì)胞的制備:將細(xì)胞懸浮液與1-6%的硅藻土混合，加入海藻酸鈉溶液，滴入氯化鈣中，制得凝膠珠；
[0011](3)固定化細(xì)胞填充到填充床反應(yīng)器中；
[0012](4)連續(xù)生產(chǎn) 單葡萄糖醛酸基甘草次酸:用乙酸鈉-乙酸緩沖液配置濃度為0.5-3.0g/L的甘草酸溶液，并加入吐溫-80，以0.3-1.0mL/min的流速流經(jīng)整個(gè)填充床反應(yīng)器，進(jìn)行單葡萄糖醛酸基甘草次酸的連續(xù)生產(chǎn)。
[0013]本發(fā)明具有的有益效果:
[0014](I)固定化細(xì)胞使用壽命長(zhǎng)，以固定化細(xì)胞填充床為催化劑，可以連續(xù)催化合成單葡萄醛酸基甘草次酸長(zhǎng)達(dá)15-30天，是游離細(xì)胞(5天)的3-6倍，這不但降低了原料消耗，而且節(jié)約了能耗，大大降低生產(chǎn)成本。
[0015](2)產(chǎn)物純度高，利用固定化細(xì)胞填充床催化合成單葡萄糖醛酸基甘草次酸，一方面可以避免游離細(xì)胞在催化過(guò)程中因破碎、死亡所產(chǎn)生的蛋白和其他氨基酸雜質(zhì)；另一方面，可以避免細(xì)胞與反應(yīng)液直接混合，給后續(xù)產(chǎn)物分離純化帶來(lái)困難。
[0016](3)生產(chǎn)可連續(xù)化，本發(fā)明所采用的填充床反應(yīng)器，反應(yīng)液從柱的底端流入頂端流出，出來(lái)的反應(yīng)液中有催化生成的單葡萄糖醛酸基甘草次酸，整個(gè)過(guò)程簡(jiǎn)化了反應(yīng)步驟，大大提聞了生廣效率。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017]附圖1、固定化產(chǎn)紫青霉Li_3CGMCC N0.5446細(xì)胞連續(xù)生產(chǎn)單葡萄糖醛酸基甘草次酸的填充床反應(yīng)器示意圖。
[0018]附圖2、隔離篩裝置示意圖。
[0019]附圖3、固定化細(xì)胞裝柱過(guò)程示意圖。
[0020]附圖4、固定化細(xì)胞連續(xù)反應(yīng)流程示意圖。[0021]其中，(a)填充床反應(yīng)器；(b)底物溶液儲(chǔ)罐；(C)蠕動(dòng)泵；(d)產(chǎn)品收集罐【具體實(shí)施方式】
[0022]下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0023]實(shí)施例1
[0024]填充床反應(yīng)器的制作
[0025]本實(shí)施例中提供的填充床反應(yīng)器為有機(jī)玻璃柱，其內(nèi)徑為50mm，高度為500mm，反應(yīng)器容積為981mL，隔離篩底盤直徑為48mm，支撐柱高度為50mm。
[0026]實(shí)施例2
[0027](I)產(chǎn)紫青霉Li-3CGMCC N0.5446細(xì)胞的制備
[0028]將斜面培養(yǎng)的產(chǎn)紫青霉L1-3，接入到種子培養(yǎng)基中，32°C，170r/min培養(yǎng)72h，然后以1.5%的接種量轉(zhuǎn)入二級(jí)種子培養(yǎng)基，32°C，170r/min培養(yǎng)24h，得到二級(jí)種子液。將培養(yǎng)好的二級(jí)種子培養(yǎng)液按照10% (v/v)的接種量，接種至裝有300mL發(fā)酵培養(yǎng)基的1000mL三角瓶中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵溫度30°C，轉(zhuǎn)速為170r/min。將得到的產(chǎn)紫青霉Li_3，于12000rpm下離心10min,之后用蒸懼水洗漆菌體3次。
[0029]種子液培養(yǎng)基組成為每升水中含有5.0g葡萄糖，3.0g NaNO3,1.0g K2HPO4,
0.5gMgS04.7Η20，0.5g KC1，0.01g FeSO4.7Η20 ;發(fā)酵罐培養(yǎng)基組成為每升水中含有4.5g甘草酸，3.0g NaNO3,1.0g K2HPO4,0.5g MgSO4.7Η20，0.5g KCl，0.01g FeSO4.7H20。
[0030](2)固定化產(chǎn)紫青霉Li_3CGMCC N0.5446的制備
[0031]將發(fā)酵得到的菌體，加入蒸餾水制備20%菌懸液，加入4%的硅藻土，攪拌均勻后并與兩倍體積121°C滅菌20min的2.5%海藻酸鈉溶液混勻。用注射器吸取海藻酸鈉菌懸液，滴入置于低速運(yùn)行的磁力攪拌器上的2%CaCl2溶液中進(jìn)行固定化，形成大小均勻的固定化凝膠珠，直徑最大差值≤0.5mm,固定化12h，制得直徑為3mm的凝膠珠，并用0.9%的生理鹽水中保存于4°C冰箱中。
[0032](3)固定化細(xì)胞裝柱
[0033]取440mL固定化細(xì)胞，裝入實(shí)施例1中制作的填充床反應(yīng)器內(nèi)，裝柱過(guò)程如附圖3所示，填充床反應(yīng)器孔隙率為0.54。
[0034](4)利用裝柱的固定化細(xì)胞連續(xù)轉(zhuǎn)化生產(chǎn)單葡萄糖醛酸基甘草次酸
[0035]用pH5.4的乙酸鈉-乙酸緩沖液配置甘草酸的濃度為0.72g/L，加入體積分?jǐn)?shù)
0.12%的吐溫-80，在水浴催化反應(yīng)溫度為35 °C條件下，底物溶液以0.34mL/min的流速自填充床底端流入頂端流出(如附圖4所示)。在此反應(yīng)條件下，能連續(xù)連續(xù)生產(chǎn)單葡萄醛酸基甘草次酸，其產(chǎn)量為0.193g/L，得率為34%，時(shí)空產(chǎn)率為336 μ mol/(L.d);固定化細(xì)胞可以連續(xù)使用30天。
[0036]實(shí)施例3
[0037](I)產(chǎn)紫青霉Li_3CGMCC N0.5446細(xì)胞的制備同實(shí)施例2中所述。
[0038](2)固定化產(chǎn)紫青霉Li_3CGMCC N0.5446的制備
[0039]將發(fā)酵得到的菌體 ，加入蒸餾水制備20%菌懸液，加入1%的硅藻土，攪拌均勻后并與兩倍體積121°C滅菌20min的2.5%海藻酸鈉溶液混勻。用注射器吸取海藻酸鈉菌懸液，滴入置于低速運(yùn)行的磁力攪拌器上的2%CaCl2溶液中進(jìn)行固定化，形成大小均勻的固定化凝膠珠，直徑最大差值≤0.5mm,固定化12h，制得直徑為3mm的凝膠珠，并用0.9%的生理鹽水中保存于4°C冰箱中。
[0040]( 3 )固定化細(xì)胞裝柱同實(shí)施例2中所述。
[0041](4)利用裝柱的固定化細(xì)胞連續(xù)轉(zhuǎn)化生產(chǎn)單葡萄糖醛酸基甘草次酸
[0042]用pH5.4的乙酸鈉-乙酸緩沖液配置甘草酸的濃度為1.35g/L，加入體積分?jǐn)?shù)
0.12%的吐溫-80，在水浴催化反應(yīng)溫度為35°C條件下，底物溶液以1.0mL/min的流速自填充床底端流入頂端流出(如附圖4所示)。在此反應(yīng)條件下，能連續(xù)連續(xù)生產(chǎn)單葡萄醛酸基甘草次酸，其產(chǎn)量為0.18g/L，得率為16.9%，時(shí)空產(chǎn)率為908 μ mol/(L.d);固定化細(xì)胞可以連續(xù)使用20天。
[0043]實(shí)施例4
[0044](I)產(chǎn)紫青霉Li_3CGMCC N0.5446細(xì)胞的制備同實(shí)施例2中所述。
[0045](2)固定化產(chǎn)紫青霉Li_3CGMCC N0.5446的制備
[0046]將發(fā)酵得到的菌體，加入蒸餾水制備20%菌懸液，加入6%的硅藻土，攪拌均勻后并與兩倍體積121°C滅菌20min的2.5%海藻酸鈉溶液混勻。用注射器吸取海藻酸鈉菌懸液，滴入置于低速運(yùn)行的磁力攪拌器上的2%CaCl2溶液中進(jìn)行固定化，形成大小均勻的固定化凝膠珠，直徑最大差值≤0.5mm,固定化12h，制得直徑為3mm的凝膠珠，并用0.9%的生理鹽水中保存于4°C冰箱中。
[0047]( 3 )固定化細(xì)胞裝柱同實(shí)施例2中所述。
[0048](4)利用裝柱的固定化細(xì)胞連續(xù)轉(zhuǎn)化生產(chǎn)單葡萄糖醛酸基甘草次酸
[0049]用pH5.4的乙酸鈉-乙酸緩沖液配置甘草酸的濃度為3.0g/L，加入體積分?jǐn)?shù)
0.12%的吐溫-80，在水浴催化反應(yīng)溫度為35°C條件下，底物溶液以0.66mL/min的流速自填充床底端流入頂端流出(如附圖4所示)。在此反應(yīng)條件下，能連續(xù)連續(xù)生產(chǎn)單葡萄醛酸基甘草次酸，其產(chǎn)量為0.2g/L，得率為8.5%，時(shí)空產(chǎn)率為666 μ mol/(L.d);固定化細(xì)胞可以連續(xù)使用15天。
【權(quán)利要求】
1.固定化細(xì)胞連續(xù)生產(chǎn)單葡萄糖醛酸基甘草次酸的工藝及裝置，其特征在于:用固定化產(chǎn)紫青霉 Li_3 (Penicillium purpurogenum Li_3)CGMCC N0.5446 細(xì)胞在具隔離篩填充床反應(yīng)器中轉(zhuǎn)化甘草酸連續(xù)生產(chǎn)單葡萄糖醛酸基甘草次酸，生產(chǎn)過(guò)程包括下列工藝步驟: (1)種子液培養(yǎng)和發(fā)酵罐培養(yǎng)制備產(chǎn)紫青霉Li_3(Penicillium purpurogenum L1-3)CGMCC N0.5446 細(xì)胞； (2)固定化產(chǎn)紫青霉Li_3 (Penicillium purpurogenum L1-3) CGMCC N0.5446 細(xì)胞的制備:將細(xì)胞懸浮液與1-6%的硅藻土混合，加入海藻酸鈉溶液，滴入氯化鈣中，制得凝膠珠; (3)固定化細(xì)胞填充到填充床反應(yīng)器中； (4)連續(xù)生產(chǎn)單葡萄糖醛酸基甘草次酸:用乙酸鈉-乙酸緩沖液配置濃度為0.5-3.0g/L的甘草酸溶液，并加入吐溫-80，以0.3-1.0mL/min的流速流經(jīng)整個(gè)填充床反應(yīng)器，進(jìn)行單葡萄糖醛酸基甘草次酸的連續(xù)生產(chǎn)。
2.如權(quán)利要求1所述的填充床反應(yīng)器，包括反應(yīng)器殼體、填充床、布水系統(tǒng)、曝氣系統(tǒng)及隔離篩，其特征在于:在常規(guī)填充床反應(yīng)器內(nèi)添加隔離篩裝置，隔離篩獨(dú)立于填充床反應(yīng)器，它由兩部分組 成，一部分是底盤，由網(wǎng)格組成，另一部分為支撐體。
【文檔編號(hào)】C12P19/56GK103865970SQ201410088328
【公開日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2014年3月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月11日
【發(fā)明者】李春, 肖玉清, 黃申, 呂波, 戴大章 申請(qǐng)人:北京理工大學(xué)