一種?；o酶a合成酶及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種?；o酶A合成酶及其應用，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。進一步構建能夠分泌?；o酶A合成酶的基因工程菌，利用重組菌發(fā)酵生產酰基輔酶A合成酶。本發(fā)明提供的?；o酶A合成酶是迄今為止所發(fā)現的第一個對反式8-甲基-6-壬烯酸或8-甲基壬酸有活性的酶，可為克隆辣椒素合成酶基因提供直接底物。本發(fā)明提供的?；o酶A合成酶對中鏈脂肪酸有活性，還可用于生物柴油領域。
【專利說明】一種?；o酶A合成酶及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種?；o酶A合成酶及其應用，屬于酶工程【技術領域】。
【背景技術】
[0002]辣椒素，學名反式-8-甲基-N-香草基-壬烯酰胺，是辣胡椒(辣椒屬)的一種具有刺激性味道的次生代謝產物。辣椒素是由辣椒素合成酶(CS )合成的，辣椒素合成酶是一種酰基轉移酶。雖然編碼CS的基因目前尚未被破譯，但已知其主要作用是從8-甲基壬烯酰輔酶A上將8-甲基壬烯?；D移到香草胺上，從而形成酰胺復合物。CS的底物，8-甲基壬烯酰是在?；o酶A合成酶(ACS)的作用下，由反式-8-甲基-6壬酰酸轉化而來。
[0003]ACS催化羧酸轉變?yōu)橄鄳；o酶A硫酯的過程共經歷兩個階段。第一階段，自由脂肪酸被轉變?yōu)橐环N可以釋放焦磷酸鹽的?；?AMP中間產物。第二階段，活化的酰基基團被連接到輔酶A的巰基上，并釋放AMP和酰基輔酶A產物(Groot et al.，1976)。ACS和一些相關蛋白被認為是具有一段高度保守的12氨基酸序列，這一序列可以形成連接AMP連接主體的核心(PR0SITTEPS00455)。在阿拉伯芥的植物模型中，約有44個假定的ACS基因已被鑒定(Shockey et al.，2003)。目前,約有一半的生物化學功能已被鑒定,其中包括長鏈?；o酶A合成酶，?；?ACP合成酶，4-香豆?；o酶A連接酶，乙?；o酶A合成酶，0PC-8:0輔酶A連接酶，琥珀酰苯甲酰輔酶A連接酶，丙二酰輔酶A合成酶，草酰輔酶A合成酶(Shockey et al., 2003;Ko0., 2005;Koo et al., 2006;Kim et al., 2008;Lin andOliver, 2008;Chen et al.，2011 ;Foster et al.，2012)。在甜辣椒中，三種全長的假定ACS基因已被克隆(Lee et al., 2001;Mazourek et al.，2009)。然而，上述蛋白質的生物化學功能尚未得到鑒定。
[0004]由于辣胡椒的基因組序列尚不可用， 申請人:使用RNA測序技術對印度鬼椒的綠色果實進行了轉錄物組分析。印度鬼椒是羊草與蓬蒿菊的一種雜交體。 申請人:通過對原RNA序列數據的重疊組裝獲得18987重疊群，其中有33種編碼與?；o酶A合成酶類似的蛋白質。在這些重疊群中，Comp2147-l顯示了與CaSIG4能夠很好地匹配。CaSIG4是一種來自甜辣椒的病原體誘導型的cDNA編碼的假定酰基輔酶A合成酶(Lee et al.，2001 )。除此以外，Comp66462 和 Comp79520 能夠與辣椒 ACSl (GenBank:EU616571)匹配，Compl67_c0, Comp 167_Cl和Comp46218能夠與辣椒ACS2 (GenBank:EU616572)匹配。ACSl和ACS2是兩種?；o酶A合成酶從質體中轉運脂肪酸的候選物(Mazourek et al.，2009)。
[0005]在本發(fā)明中， 申請人:提供的ACSl是一種中/長鏈?；o酶A合成酶，可以將反式-8-甲基-6-壬烯酸轉化到相關8-甲基壬烯基輔酶A上，是一種辣椒素生物合成途徑中關鍵的中間產物。

【發(fā)明內容】
[0006]本發(fā)明提供了一種?；o酶A合成酶，氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0007]本發(fā)明還提供了一種含有?；o酶A合成酶基因工程菌的構建方法，包含如下步驟:
[0008](I)利用ACSl-sumo-F和ACSl-sumo-R引物擴增印度鬼椒綠色果實的ACSl基因；
[0009](2)將步驟(1)所得基因PCR擴增并純化后，連接到線性化的pETite N-His SUMOKan表達載體上,得到重組質粒；
[0010](3)將步驟(2)所得的重組質粒,轉化至大腸桿菌H1-controllOG細胞中，得到基因工程菌。
[0011]本發(fā)明還提供了一種發(fā)酵生產?；o酶A合成酶的方法，是將?；o酶A合成酶在微生物中表達，收集發(fā)酵產物中的?；o酶A合成酶。
[0012]進一步，本發(fā)明提供的生產酰基輔酶A合成酶的方法，包含如下步驟:
[0013](I)利用ACSl-sumo-F和ACSl-sumo-R引物擴增印度鬼椒綠色果實的ACSl基因；
[0014](2)將步驟(1)所得基因PCR擴增并純化后，連接到線性化的pETite N-His SUMOKan表達載體上,得到重組質粒；
[0015](3)將步驟(2)所得的重組質粒,轉化至大腸桿菌H1-controllOG細胞中，得到基因工程菌；
[0016](4)利用步驟(3)所得的基因工程菌發(fā)酵生產?；o酶A合成酶。
[0017]本發(fā)明還提供了一種?；o酶A合成酶的應用，其特征在于，是將?；o酶A合成酶在微生物中表達，收集發(fā)酵產物中的酰基輔酶A合成酶，使底物轉化為酰基輔酶A。
[0018]所述底物為中長鏈脂肪酸。
[0019]所述底物為反式8-甲基-6-壬烯酸或8-甲基壬酸。
[0020]本發(fā)明提供了一種新的酰基輔酶A合成酶，可為辣椒素合成酶提供底物。所述新酶也可在生物燃料工業(yè)中用于制備中等鏈長的脂肪酸衍生物。
[0021]ACSl 一個重要性在于，通過轉基因技術可使其具有潛在的調節(jié)植物中辣椒素水平的作用。通過ACSl的過度表達實現提高辣椒植物中辣椒素含量水平。通過敲除或敲低ACSl基因，降低辣椒植物的辣椒素含量水平。
[0022]天然辣椒中除積累辣椒素，二氫辣椒素外，還生產其它許多不同側鏈長度的辣椒素類似物(7-11個碳原子)。ACSl可以為辣椒素合成酶(CS)提供不同鏈長的?；o酶A，從而控制辣椒素類似物的結構。在當今的生物燃料工業(yè)中，中鏈?；o酶A合成酶有廣泛的應用。因此，ACSl具有在生物燃料工業(yè)中應用的前景。
[0023]所述酰基輔酶A合成酶基因可以通過細菌或酵母的細胞體系表達。所述ACS基因可以來自鬼椒ACSl、擬南芥的LCAS4和LCAS5基因，或其他來源。
[0024]本發(fā)明有益效果:本發(fā)明所提供的?；o酶A合成酶對中鏈脂肪酸有活性可用于生物柴油領域，是迄今為止所發(fā)現的第一個對反式8-甲基-6-壬烯酸或8-甲基壬酸有活性的酶，可為克隆辣椒素合成酶基因提供直接底物。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1 為 His-SUMO-ACSl 在 BL21 (DE3)細胞中表達的 SDS-PAGE 圖；
[0026](0,20分別代表1PTG誘導前和誘導20小時后的總蛋白；C為IPTG誘導20小時后可溶性粗蛋白提取物；E1-E4為N1-NTA柱的分離組分)。
[0027]圖2為ACSl對不同羧酸的活性；[0028](C2，乙酸；C4, 丁酸；C6,己酸；C8,辛酸；C10,羊蠟酸；C12,月桂酸；C14,豆蘧酸；C16，棕櫚酸；C18，硬脂酸)。
[0029]圖3為反式8-甲基-6-壬烯酸或8-甲基壬酸作為底物的酶反應產物的HPLC譜圖。
[0030]圖4為陰離子模式下對純化后的反式8-甲基-6壬烯基輔酶A的MS/MS分析。
[0031]圖5為陰離子模式下對純化后的8-甲基壬基輔酶A的MS/MS分析。
[0032]圖6為-不同pH緩沖液對ACSl活性的影響；
[0033](- -:Acetate ；- -:Phosphate -:Tris ;_X_:Glycine)0【具體實施方式】
[0034]本發(fā)明公開了一種?；o酶A合成酶及其應用，具體實施方案包括構建含有?；o酶A合成酶的基因工程菌，微生物體系中?；o酶A合成酶的表達，以及在反應體系中加入酶作用底物，利用重組蛋白將底物轉化為酰基輔酶A。
[0035]底物為中/長鏈羧酸，其中長鏈羧酸一般為含有16或18個碳原子的羧酸，中等鏈則為含有10或12個碳原子的羧酸。
[0036]實施例1印度鬼椒ACSl基因工程菌的構建與表達
[0037]利用ACSl-sumo-F和ACSl-sumo-R引物擴增印度鬼椒綠色果實的cDNA的ACSl基因，上述兩個引物的序列分別為:CGC GAA CAG ATT GGA GGT GCAACAGATAAAITTATTATTG和GTG GCG GCC GCT CTA TTA TCACTTGGTACCCTTGTACAT。PCR 擴增產物用 1% 的瓊脂糖凝膠純化，并與線性化的pETite N-His SUMO Kan表達載體混合(Lucigen, Middleton, WI )。通過熱沖擊方法將DNA混合物轉化至大腸桿菌H1-controllOG細胞中(Lucigen)。對插入后的基因進行測序，保證其序列正確。其編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。將pETiet N-HisSUMO-鬼椒 ACSI 基因轉化至 H1-ControI BL21(DE31)細胞(1^(^8611)中，把8-5.0-4051 的表達使用0.5mM的IPTG在16°C下，誘導20小時。混合蛋白質通過N1-NTA柱進行純化(見圖1)。ACSl 的分子量約為 73.5KDa,His-SUMO tag 的約為 12KDa。His-SUMO-鬼椒的 ACSl混合蛋白質在SDS-PAGE中的遷移接近預測(85KDa，見圖1)。
[0038]實施例2ACS1活性測定
[0039]利用HPLC測定鬼椒ACSl的活性(Chen et al.，2011)。具體為，反應混合體系(400yL)包括 0.1M 的 Tris-HCl，pH7.5，2mM 的 DTT，5mM ATP, IOmM MgC12, 0.5mM CoA，0.1%的三硝基甲苯和200 μ M羧酸。反應通過添加20 μ L的純化酶開始，反應30分鐘后添加20 μ L 乙酸終止反應。HPLC 使用 Dioncx-UkiMatc1<:.3000LC 系統(tǒng)(Thermo Scientific),采
用 Acclaim? 120C18 反相色譜柱(Thermo Scientific ；3 μ , 120A, 150x3mm)。移動相的組成
有溶劑A (0.1%的三氟乙酸)和溶劑B (乙腈)。梯度洗脫的程序如下:0到5分鐘，5%溶劑B ；5到9分鐘，溶劑B濃度從5%到80%線性增加；9到11分鐘，溶劑B濃度80% ;11到12分鐘，溶劑B濃度5%。流速為0.6mL/min。二極管陣列檢測器的檢測范圍為200到400nm。底物和產物的定性定量通過計算257nm下譜峰的面積獲得。結果顯示:ACS1酶當以8-甲基壬酸為底物時的Km值為0.57mM，Vmax值為0.14 μ mol/min/mg; ACSl酶當以(6E)_8_甲基-6-壬烯酸為底物時的Km值為0.49mM, Vmax值為0.1214 μ mol/min/mg。
[0040]實施例3ACS作用底物的選擇[0041]在酶反應體系中分別添加5mM乙酸、丁酸、己酸、辛酸、羊蠟酸、月桂酸、豆蘧酸、棕櫚酸和硬脂酸。
[0042]如圖2所示，在不同底物中，印度鬼椒ACSl最高活性是羊蠟酸。相反地，ACSl對乙酸和丁酸沒有任何活性。
[0043]實施例4酰基輔酶A的生產
[0044]利用辣椒素生物合成途徑中內生的中間產物反式-8-甲基-6壬酸(6E)和8_甲基壬酸(8M)，作為底物，生產酰基輔酶A。
[0045]如圖3所示，ACSl在以上述兩物質為底物的測量中，對6E的活性較高。收集了相應的HPLC分離峰，利用SpeedVac集中器干燥后，用MS/MS做進一步分析。
[0046]每個干燥樣品使用40 μ L甲醇:水:乙腈比例為1: 1:2的緩沖溶液。用TriVersa Nanomatcli (Advion, Ithaca, NY)直接注入 10 μ L。質譜儀(LTQ-QrbitrapVelo (Thermo Fisher Scientif ic, Waltham, MA))采用陰離子模式進行。質量掃描的范圍是300-2000m/zo分辨率設為60000@400m/z。CID破碎采用MS/MS，檢測采用分離窗口 1.5m/z的分離阱。破碎用歸一化碰撞能量的35%。如圖4和圖5所示，質譜數據與反式-8-甲基-6-壬烯基輔酶A和8-甲基壬基輔酶A的分子量相吻合。
[0047]實施例5?；o酶A合成酶的pH穩(wěn)定性
[0048]采用乙酸鹽，磷酸鹽，Tris和甘氨酸/NaOH緩沖溶液，調節(jié)pH4.0至10.5，測定生產的?；o酶A合成酶的p H穩(wěn)定性。結果如圖6所示，ACSl的最適pH為9.5。
【權利要求】
1.一種酰基輔酶A合成酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.一種含有權利要求1所述?；o酶A合成酶基因工程菌的構建方法，其特征在于，步驟如下: (1)利用ACSl-sumo-F和ACSl_sumo-R引物擴增印度鬼椒綠色果實的ACSl基因； (2)將步驟(1)所得基因PCR擴增并純化后，連接到線性化的pETiteN-His SUMO Kan表達載體上，得到重組質粒； (3)將步驟(2)所得的重組質粒，轉化至大腸桿菌H1-controllOG細胞中，得到基因工程菌。
3.—種權利要求1所述酰基輔酶A合成酶的生產方法，其特征在于，是將氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示的酰基輔酶A合成酶在微生物中表達，收集發(fā)酵產物中的酰基輔酶A合成酶。
4.權利要求3所述方法，其特征在于，步驟如下: (1)利用ACSl-sumo-F和ACSl_sumo-R引物擴增印度鬼椒綠色果實的ACSl基因； (2)將步驟(1)所得基因PCR擴增并純化后，連接到線性化的pETiteN-His SUMO Kan表達載體上，得到重組質粒； (3)將步驟(2)所得的重組質粒，轉化至大腸桿菌H1-controllOG細胞中，得到基因工程菌； (4)利用步驟(3)所得的基因工程菌發(fā)酵生產?；o酶A合成酶。
5.權利要求1所述?；o酶A合成酶的應用，其特征在于，是將?；o酶A合成酶在微生物中表達，收集發(fā)酵產物中的酰基輔酶A合成酶，使底物轉化為?；o酶A。
6.權利要求5所述方法，其特征在于，所述底物為中長鏈脂肪酸。
7.權利要求5所述方法，其特征在于，所述底物為反式8-甲基-6-壬烯酸或8-甲基壬酸。
【文檔編號】C12N15/70GK103725652SQ201310728420
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年12月25日 優(yōu)先權日:2013年12月25日
【發(fā)明者】陳輝, 王泓雪, 余曉丹 申請人:無錫新和源發(fā)酵技術研究院有限公司