一株高產(chǎn)雷帕霉素的游動放線菌誘變菌株的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株高產(chǎn)雷帕霉素的游動放線菌誘變菌株（Actinoplanes）CGMCC?NO.8430，屬于發(fā)酵工程【技術領域】。該菌是以從海南島的土壤樣品中篩選出的產(chǎn)雷帕霉素的游動放線菌hn-016（Actinoplanes）為出發(fā)菌株，經(jīng)過常壓室溫等離子體誘變產(chǎn)生的。本發(fā)明的誘變菌株BCStr-096，比常規(guī)誘變方法獲得的菌株遺傳穩(wěn)定性更高，雷帕霉素的生產(chǎn)能力更高，其產(chǎn)量比出發(fā)菌株hn-016的產(chǎn)量200mg/L，提高了175%，且在現(xiàn)有雷帕霉素最高的發(fā)酵水平上提高了37%左右，大大降低了生產(chǎn)成本。
【專利說明】一株高產(chǎn)雷帕霉素的游動放線菌誘變菌株
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于發(fā)酵工程【技術領域】，具體涉及一株高產(chǎn)雷帕霉素的游動放線菌誘變菌株 BCStr-096。
【背景技術】
[0002]雷帕霉素(rapamycin，RPM)又名西羅莫司，是具獨特作用機制的含氮三烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，具有抗真菌、抗增殖的作用，據(jù)報道，Luan FL等人的動物實驗發(fā)現(xiàn)雷帕霉素還具有抗腫瘤的作用。雷帕霉素是目前世界上最有前途的新型強效免疫抑制劑，其分子結構類似于FK506，是又一種 親免疫蛋白結合劑，可用于器官移植抗排斥作用，它的免疫抑制作用比環(huán)孢菌素強數(shù)十倍，是腎毒性最低的免疫抑制劑，還可用于治療類風濕性關節(jié)炎、紅斑狼瘡等自身免疫性疾病，目前發(fā)展為基因治療和抗腫瘤藥物，具有廣闊的應用前景。
[0003]最初，RPM作為低毒性抗真菌抗生素，1978年發(fā)現(xiàn)它對自身免疫性疾病有免疫抑制作用。受此啟發(fā)，1989年Mortis正式開始把RPM作為器官移植抗排斥的新型免疫抑制劑進行試用。1999年9月美國FDA正式批準雷帕霉素作為腎移植的抗排斥藥物投放市場，同時由Cordis公司研發(fā)的以雷帕霉素作為涂層藥物的血管支架Cypher已于2002年相繼在歐洲、美國和日本上市。2005年6月我國福建省微生物研究所研發(fā)的國產(chǎn)雷帕霉素經(jīng)SFDA批準投放市場，而由美國Wyeth公司開發(fā)的雷帕霉素作為抗癌藥現(xiàn)已進入臨床試驗階段。2006年前，雷帕霉素在美國市場的價格為6千美金I克，目前，雷帕霉素的銷量正在迅速增長，其市場售價也略有降低，估計它將和環(huán)孢菌素有效地競爭，逐漸地平分抗移植器官排異藥的市場，Pharmaprojects (在研新藥動態(tài))預測其銷售額達5_20億美元。雷帕霉素在國內(nèi)屬于六類新藥，2009年雷帕霉素在國內(nèi)市場的銷售額已超過5億元人民幣，具有廣闊的市場前景。
[0004]目前，雷帕霉素的工業(yè)化生產(chǎn)主要是通過微生物發(fā)酵方法生產(chǎn)，但目前該抗生素的發(fā)酵水平還相當?shù)停形墨I報道的最高發(fā)酵水平也僅達到400mg/L左右。因此，雷帕霉素生物發(fā)酵生產(chǎn)存在的不足主要在于雷帕霉素的生物發(fā)酵單位不高，不利于提取純化，不能充分滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求。
[0005]本發(fā)明利用常壓室溫等離子體誘變技術，篩選出一株雷帕霉素高產(chǎn)菌株，提高了雷帕霉素的產(chǎn)量，有效降低了生產(chǎn)成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的問題是利用常壓室溫等離子體誘變技術，篩選出一株新型雷帕霉素聞廣菌株。
[0007]本發(fā)明所提供的菌株為游動放線菌(Actinoplanes sp.)誘變菌株BCStr-096,該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC N0.8430，分類命名:游動放線菌Actinoplanes sp.;保藏地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101 ;保藏日期2013年11月05日。該菌株是以從海南島的土壤樣品中篩選出的產(chǎn)雷帕霉素的游動放線菌hn-016(Actinoplanes sp.)為出發(fā)菌株，經(jīng)多組復合誘變篩選得到的。
[0008]本發(fā)明游動放線菌，具體采用以下技術方案進行選育:
[0009]1.采用常壓室溫等離子體誘變技術選育雷帕霉素高產(chǎn)菌株
[0010](I)選擇生長良好的產(chǎn)雷帕霉素的游動放線菌hn-016斜面菌株，用生理鹽水洗下孢子，經(jīng)紗布過濾，制成IO6個/mL的孢子懸浮液；
[0011](2)將(I)中的孢子懸浮液,用移液槍吸取10μ L于直徑為Icm的圓形鐵片上,置于以氦氣為工作氣體， 功率110W，工作氣流量10L/min的常壓室溫等離子體誘變系統(tǒng)中，處理距離為 2mm，分別處理 0s、20s、40s、60s、80s、100s、120s、140s、160s、180s，將處理的孢子懸液進行梯度稀釋涂平板，制作致死率曲線；
[0012](3)根據(jù)(2)的致死率曲線，選擇高、中、低三個不同致死劑量的照射時間，對菌株hn-016的孢子懸液進行等離子體誘變；
[0013](4)將(3)中三個不同處理時間的孢子懸液混合于裝有生理鹽水的試管中，混合均勻；
[0014](5)將(4)中的誘變孢子懸液，進行梯度稀釋后，分別涂布于含有2mg/L氯霉素，0.8mg/L鏈霉素，4mg/L紅霉素，lmg/L慶大霉素的抗性平板上；
[0015](6)將(5)中各個抗性平板上長出的單菌落轉接斜面后，以1%的接種量，接種于種子培養(yǎng)基中，280C，220r/min,培養(yǎng)45_50h后，以10%的接種量將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，28 0C，220r/min 培養(yǎng) 7_8d ；
[0016](7)取(6)中的發(fā)酵液于離心管中，5000r/min離心lOmin，取菌體用甲醇萃取，倒入裝有10-15顆玻璃珠的三角瓶中，于180-200r/min的搖床上震蕩浸提lh，取抽提液，10000r/min離心lOmin，過有機濾膜后，利用高效液相色譜法測定雷帕霉素的產(chǎn)量，通過此方法篩選出雷帕霉素高產(chǎn)菌株BCStr-096。
[0017]2.游動放線菌BCStr-096的培養(yǎng)方法為:
[0018](I)菌種活化:將游動放線菌BCStr-096轉接至保藏分離斜面培養(yǎng)基，28°C恒溫培養(yǎng)7-15天;
[0019](2)種子培養(yǎng):選取生長良好的斜面，用滅菌的生理鹽水洗下孢子，制備濃度約IO6個/mL的孢子懸液，以1%的接種量接種于裝有60mL種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，28°C，220r/min,震蕩培養(yǎng) 45_50h ；
[0020](3)發(fā)酵培養(yǎng):將(2)中的種子培養(yǎng)液，以10%的接種量接種于裝有60mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，280C，220r/min,震蕩培養(yǎng)7_8d ；
[0021]3.游動放線菌BCStr-096誘變及培養(yǎng)過程所用培養(yǎng)基組成為:
[0022](I)保藏分離培養(yǎng)基:燕麥片3%，葡萄糖2%，酵母粉1%，蛋白胨1%，碳酸鈣0.25%，不足部分蒸餾水補足，PH7.0-7.2，121°C高壓蒸汽滅菌20min ；
[0023](2)種子培養(yǎng)基:可溶性淀粉2.8%，蛋白胨0.8%，葡萄糖2%，黃豆餅粉1%，碳酸鈣0.3%,不足部分蒸懼水補足，pH7.0-7.2,121 °C高壓蒸汽滅菌20min ；
[0024](3)發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米淀粉2%，葡萄糖2.5%，黃豆餅粉3%，蛋白胨0.8%，磷酸氫二鉀0.5%，磷酸二氫鉀0.5%，硫酸鎂0.2%，氯化鈉0.5%，甘油1%，碳酸鈣0.3%，泡敵0.2%，不足部分蒸懼水補足，pH7.0-7.2,121°C高壓蒸汽滅菌20min。[0025]有益效果:
[0026]本發(fā)明的誘變菌株BCStr-096是通過等離子體誘變方法獲得的，比常規(guī)誘變方法獲得的菌株遺傳穩(wěn)定性更高，雷帕霉素的生產(chǎn)能力更高，其產(chǎn)量比出發(fā)菌株hn-016的產(chǎn)量200mg/L，提高了 175%，且在現(xiàn)有雷帕霉素最高的發(fā)酵水平上提高了 37%左右，大大降低了生產(chǎn)成本。
【具體實施方式】
[0027]下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步詳述，以下實施例只是描述性的，不是限制性的，不能以此限定本發(fā)明的保護范圍。
[0028]實施例1
[0029]從土壤中篩選出的產(chǎn)雷帕霉素的菌株hn-016
[0030]1.菌體形態(tài):菌 體為革蘭氏陽性菌，無氣生菌絲，以孢子的方式進行繁殖，孢子渾圓，大部分具極生叢毛，能游動。
[0031]2.菌落形態(tài):在平板上，菌落的基絲表面呈顆粒狀，橙黃色，隨著培養(yǎng)時間的延長，菌落會由橙黃色變成黃褐色。
[0032]3.培養(yǎng)特征:此菌為高耗氧菌，最適生長溫度為28 V，最適生長pH為7.0-7.2 ；在搖床轉速為210-240r/min，培養(yǎng)7_8d時，雷帕霉素產(chǎn)量最高，發(fā)酵過程中溶氧對雷帕霉素的產(chǎn)生具有顯著作用。
[0033]實施例2
[0034]以游動放線菌hn-016為出發(fā)菌株，采用常壓室溫等離子體誘變技術篩選菌株BCStr-096
[0035]1.誘變菌株的獲得
[0036](I)選擇生長良好的產(chǎn)雷帕霉素的游動放線菌hn-016斜面菌株，用生理鹽水洗下孢子，經(jīng)紗布過濾，制成IO6個/mL的孢子懸浮液；
[0037](2)將(I)中的孢子懸浮液,用移液槍吸取10μ L于直徑為Icm的圓形鐵片上,置于以氦氣作為工作氣體，電源功率為110W，工作氣流量10L/min的常壓室溫等離子體誘變系統(tǒng)中，處理距離為 2mm,分別處理 0s、20s、40s、60s、80s、100s、120s、140s、160s、180s，將處理的孢子懸液進行梯度稀釋涂平板，制作致死率曲線；
[0038](3)根據(jù)(2)的致死率曲線，選擇40s、80s、100s三個不同致死劑量的照射時間,對菌株hn-016的孢子懸液進行等離子體誘變；
[0039](4)將(3)中三個不同處理時間的孢子懸液混合于裝有生理鹽水的試管中，混合均勻；
[0040](5)將(4)中的誘變孢子懸液，進行梯度稀釋KT1-1O'取ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ—6三個稀釋度的孢子懸液，分別涂布于含有2mg/L氯霉素，0.8mg/L鏈霉素，4mg/L紅霉素，lmg/L慶大霉素的抗性平板上；
[0041](6)將(5)中各個抗性平板上長出的單菌落轉接斜面后，以1%的接種量，接種于種子培養(yǎng)基中，280C，220r/min,培養(yǎng)45_50h后，以10%的接種量將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，28 0C，220r/min 培養(yǎng) 7_8d ；
[0042]所述種子培養(yǎng)基組成為:可溶性淀粉2.8%，蛋白胨0.8%，葡萄糖2%，黃豆餅粉1%，碳酸鈣0.3%，不足部分蒸餾水補足，pH7.0-7.2，121°C高壓蒸汽滅菌20min ；
[0043]所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:玉米淀粉2%，葡萄糖2.5%，黃豆餅粉3%，蛋白胨0.8%，磷酸氫二鉀0.5%，磷酸二氫鉀0.5%，硫酸鎂0.2%，氯化鈉0.5%，甘油1%，碳酸鈣0.3%，泡敵
0.2%,不足部分蒸懼水補足，pH7.0-7.2,121 °C高壓蒸汽滅菌20min。
[0044](7)取(6)中的發(fā)酵液于離心管中，5000r/min離心lOmin，取菌體用甲醇萃取，倒入裝有13顆玻璃珠的三角瓶中，于190r/min的搖床上震蕩浸提lh，取抽提液，10000r/min離心lOmin，過有機濾膜后， 利用高效液相色譜法測定雷帕霉素的產(chǎn)量，通過此方法即篩選出高產(chǎn)雷帕霉素的誘變菌株BCStr-096。
[0045]2.誘變菌株BCStr-096的特性
[0046](I)菌體形態(tài):菌體為革蘭氏陽性菌，無氣生菌絲，以孢子的方式進行繁殖，孢子渾圓，大部分具極生叢毛，能游動。
[0047](2)菌落形態(tài):在平板上，菌落的基絲表面呈顆粒狀，橙黃色，隨著培養(yǎng)時間的延長，菌落會由橙黃色變成黃褐色。
[0048](3)培養(yǎng)特征:此菌為高耗氧菌，最適生長溫度為28°C，最適生長pH為7.1 ;在搖床轉速為230r/min，培養(yǎng)7_8d時，雷帕霉素產(chǎn)量最高。
[0049](4)可以在含有0.8mg/L鏈霉素的培養(yǎng)基中進行生長，并生長良好。
[0050]實施例3
[0051 ] 游動放線菌BCStr-096的培養(yǎng)
[0052]1.培養(yǎng)基的配制
[0053](I)保藏分離培養(yǎng)基:燕麥片3%，葡萄糖2%，酵母粉1%，蛋白胨1%，碳酸鈣0.25%，不足部分蒸餾水補足，PH7.0-7.2，121°C高壓蒸汽滅菌20min ；
[0054](2)種子培養(yǎng)基:可溶性淀粉2.8%，蛋白胨0.8%，葡萄糖2%，黃豆餅粉1%，碳酸鈣
0.3%,不足部分蒸懼水補足，pH7.0-7.2,121 °C高壓蒸汽滅菌20min ；
[0055](3)發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米淀粉2%，葡萄糖2.5%，黃豆餅粉3%，蛋白胨0.8%，磷酸氫二鉀0.5%，磷酸二氫鉀0.5%，硫酸鎂0.2%，氯化鈉0.5%，甘油1%，碳酸鈣0.3%，泡敵0.2%，不足部分蒸懼水補足，pH7.0-7.2,121°C高壓蒸汽滅菌20min。
[0056]2.菌種活化
[0057]將甘油保存的菌種BCStr-096轉接至保藏分離培養(yǎng)基斜面，于恒溫培養(yǎng)箱中，28°C培養(yǎng) 7-15d ；
[0058]3.種子培養(yǎng)
[0059]選擇生長良好的活化斜面，接種于裝有上述I中制得的種子培養(yǎng)基中(500mL三角瓶內(nèi)裝60mL培養(yǎng)基)，于28°C，220r/min,培養(yǎng)45_50h。
[0060]4.發(fā)酵培養(yǎng)
[0061]將3中制得的種子液以10% (v/v)接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中(500mL三角瓶內(nèi)裝60mL培養(yǎng)基)，于28°C，220r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)8d。
[0062]檢測結果:游動放線菌(Actinoplanes) BCStr-096在發(fā)酵培養(yǎng)基上雷帕霉素的產(chǎn)量為 535— 565mg/L。
【權利要求】
1.一株高產(chǎn)雷帕霉素的游動放線菌誘變菌株，所述游動放線菌BCStr-096(Actinoplanes)，保藏編號為 CGMCC N0.8430。
2.根據(jù)權利要求1所述的高產(chǎn)雷帕霉素的游動放線菌誘變菌株，其特征在于，該菌是以游動放線菌hn-016 (Actinoplanes)為出發(fā)菌株,經(jīng)過常壓室溫等離子體誘變產(chǎn)生。
3.根據(jù)權利要求1所述的高產(chǎn)雷帕霉素的游動放線菌誘變菌株，其特征在于，該菌在發(fā)酵培養(yǎng)基上雷帕霉素的產(chǎn)量為535— 565mg/L.
4.根據(jù)權利要求3所述的高產(chǎn)雷帕霉素的游動放線菌誘變菌株，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:玉米淀粉2%，葡萄糖2.5%，黃豆餅粉3%，蛋白胨0.8%，磷酸氫二鉀0.5%，磷酸二氫鉀0.5%，硫酸鎂0.2%，氯化鈉0.5%，甘油1%，碳酸鈣0.3%，泡敵0.2%，不足部分蒸餾水補足，ρΗ7.0-7.2，121°C高壓蒸汽滅菌 20min。
5.根據(jù)權利要求1所述的高產(chǎn)雷帕霉素的游動放線菌誘變菌株，其特征在于，能在含有0.8mg/L鏈霉素的培養(yǎng)基中進行良好生長。
6.根據(jù)權利要求1所述的高產(chǎn)雷帕霉素的游動放線菌誘變菌株BCStr-096在發(fā)酵生產(chǎn)雷帕 霉素中的應用。
【文檔編號】C12N1/20GK103740614SQ201310728024
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年12月18日 優(yōu)先權日:2013年12月18日
【發(fā)明者】喬長晟, 石漫漫, 李雪, 朱明
申請人:天津北洋百川生物技術有限公司