一種提高聚酮類(lèi)化合物發(fā)酵產(chǎn)量的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種提高聚酮類(lèi)化合物發(fā)酵產(chǎn)量的方法。其包括步驟：在添加了天然油脂的培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)表達(dá)酰基輔酶A合成酶和?；d體蛋白的基因工程菌，從發(fā)酵產(chǎn)物中提取聚酮類(lèi)化合物，所述的基因工程菌為將含有表達(dá)?；o酶A合成酶和酰基載體蛋白的重組表達(dá)載體的重組大腸桿菌接合轉(zhuǎn)移放線菌制得的過(guò)表達(dá)?；o酶A合成酶和?；d體蛋白的重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體。該方法在于通過(guò)基因工程技術(shù)在聚酮類(lèi)化合物的產(chǎn)生菌中過(guò)量表達(dá)外源的?；o酶A合成酶和酰基載體蛋白，使之利用廉價(jià)的天然油脂為原料，提高聚酮類(lèi)化合物的發(fā)酵產(chǎn)量。該方法未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。該方法操作簡(jiǎn)單易行，且利用廉價(jià)的天然油脂為聚酮類(lèi)化合物提供合成前體，成本很低，便于推廣應(yīng)用。
【專(zhuān)利說(shuō)明】-種提高聚鋼類(lèi)化合物發(fā)酵產(chǎn)量的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種提高聚麗類(lèi)化合物發(fā)酵產(chǎn)量的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 聚麗類(lèi)化合物是一類(lèi)重要的次級(jí)代謝產(chǎn)物，它是由簡(jiǎn)單脂肪酸經(jīng)過(guò)類(lèi)似長(zhǎng)鏈脂肪 酸的合成途徑生成的，所得的化合物具有一系列復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)的多樣性導(dǎo)致了生物活 性的多樣性。在自然界中已發(fā)現(xiàn)的天然聚麗物質(zhì)約有2萬(wàn)種，大多數(shù)抗生素和一些其他的 重要藥物如抗癌藥、免疫抑制劑等均屬于該個(gè)大家族。作為治療藥用途的該類(lèi)化合物包括 臨床上應(yīng)用的紅霉素、四環(huán)素、利福霉素、兩性霉素、阿霉素、洛伐他了、雷帕霉素等重要抗 生素，W及農(nóng)牧業(yè)用的阿弗菌素和莫能星、泰樂(lè)菌素等。
[0003] 許多有生物活性的聚麗類(lèi)化合物由于其宿主不能進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)而受到限 巧1|(如海綿和腰鞭毛蟲(chóng)的共生菌)，或由于宿主菌難于培養(yǎng)而產(chǎn)率很低。目前有研究將該些 生物中合成聚麗類(lèi)化合物的途徑轉(zhuǎn)入合適的宿主，W提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)率，常用的宿主如 大腸桿菌、鏈霉菌W及植物等。
[0004] 但是，生物代謝通路在異源宿主中的復(fù)制并非一個(gè)簡(jiǎn)單的技術(shù)問(wèn)題，為了進(jìn)一步 提高聚麗類(lèi)化合物的發(fā)酵產(chǎn)量，有必要對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步研究，開(kāi)發(fā)新的方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有的聚麗類(lèi)化合物的發(fā)酵產(chǎn)量不夠高，難W 滿足實(shí)際應(yīng)用需求的現(xiàn)狀，提供一種提高聚麗類(lèi)化合物發(fā)酵產(chǎn)量的方法。本發(fā)明通過(guò)基因 工程技術(shù)改造放線菌，使之能夠利用廉價(jià)的原料增加胞內(nèi)醜基輔酶A的含量，為聚麗類(lèi)次 級(jí)代謝產(chǎn)物的合成提供前體，從而大大提高聚麗類(lèi)化合物的發(fā)酵產(chǎn)量。
[0006] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案之一是；一種提高聚麗類(lèi)化合物發(fā)酵產(chǎn)量的方法，其包括 步驟；在添加了天然油脂的培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)表達(dá)醜基輔酶A合成酶和醜基載體蛋白的基因 工程菌，從發(fā)酵產(chǎn)物中提取聚麗類(lèi)化合物，所述的基因工程菌為將含有表達(dá)醜基輔酶A合 成酶和醜基載體蛋白的重組表達(dá)載體的重組大腸桿菌接合轉(zhuǎn)移放線菌制得的過(guò)表達(dá)醜基 輔酶A合成酶和醜基載體蛋白的重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體。
[0007] 本發(fā)明中，所述的過(guò)表達(dá)醜基輔酶A合成酶和醜基載體蛋白的基因工程菌能夠過(guò) 表達(dá)外源的醜基輔酶A合成酶和醜基載體蛋白，使所述基因工程菌能夠利用廉價(jià)的原料增 加胞內(nèi)己醜輔酶A和丙醜輔酶A的含量，從而豐富聚麗類(lèi)化合物的直接合成前體，提高聚麗 類(lèi)化合物的產(chǎn)量。
[0008] 本發(fā)明中，所述的提高聚麗類(lèi)化合物發(fā)酵產(chǎn)量的方法還包括所述的基因工程菌的 制備步驟：將表達(dá)醜基輔酶A合成酶和醜基載體蛋白的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，然后 將所得的重組大腸桿菌接合轉(zhuǎn)移放線菌，所得的過(guò)表達(dá)醜基輔酶A合成酶和醜基載體蛋白 的重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體即為所述的基因工程菌。
[0009] 本發(fā)明中，所述的醜基輔酶A合成酶和醜基載體蛋白優(yōu)選來(lái)源于攻瑰抱鏈霉菌 (Str巧tomyces roseosporus)的醜基輔酶A合成酶和醜基載體蛋白，其分別由來(lái)源于攻瑰 抱鏈霉菌（Str巧tomyces roseosporus)的化巧和化tF基因編碼，所述的攻瑰抱鏈霉菌 更優(yōu)選攻瑰抱鏈霉菌NRRL11379菌株。其中，所述的來(lái)源于攻瑰抱鏈霉菌（Streptomyces roseosporus)的醜基輔酶A合成酶和醜基載體蛋白的氨基酸序列分別優(yōu)選如SEQ ID NO. 1 和SEQ ID NO. 2所示。所述的來(lái)源于攻瑰抱鏈霉菌（Streptomyces roseosporus)的Dp1:E 和化tF基因的核巧酸序列分別優(yōu)選如SEQ ID N03和SEQ ID N04所示。
[0010] 對(duì)于上述氨基酸序列分別如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示的醜基輔酶A合 成酶和醜基載體蛋白，本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，與其具有一定的同源性(較佳地為同源性大于 85%)的同源蛋白應(yīng)當(dāng)能夠?qū)崿F(xiàn)與其相同或基本相同的功能。對(duì)于上述核巧酸序列如SEQ ID N03和SEQ ID NO. 4所示的化巧和化tF基因，本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，與其具有一定的同源 性(較佳地為同源性大于85%)的同源基因應(yīng)當(dāng)能夠?qū)崿F(xiàn)與其相同或基本相同的功能。
[0011] 本發(fā)明中，所述的重組表達(dá)載體可通過(guò)本領(lǐng)域的常規(guī)方法獲得，即；將編碼所述醜 基輔酶A合成酶和醜基載體蛋白的基因連接于表達(dá)載體上構(gòu)建而成。所述的表達(dá)載體為本 領(lǐng)域常規(guī)，所述表達(dá)載體較佳地包括：各種質(zhì)粒、粘粒、瞻菌體或病毒載體等，優(yōu)選放線菌常 用的各種整合型或復(fù)制型載體，所述的整合型載體包括各種瞻菌體整合位點(diǎn)適用的載體， 如pSET152、pS0K804，pSAM2等，所述的復(fù)制型載體優(yōu)選pWhm3等，本發(fā)明中所述的表達(dá)載體 最優(yōu)選為質(zhì)粒PSET152,即所述的重組表達(dá)載體最優(yōu)選通過(guò)將編碼所述醜基輔酶A合成酶 和醜基載體蛋白的基因連接于質(zhì)粒PSET152構(gòu)建而成。
[0012] 其中，在所述的重組表達(dá)載體中，啟動(dòng)編碼所述醜基輔酶A合成酶和醜基載體蛋 白的基因表達(dá)的啟動(dòng)子可W為常規(guī)，只要其能啟動(dòng)目標(biāo)基因表達(dá)即可，較佳地，所述的啟動(dòng) 子為紅霉素抗性基因啟動(dòng)子erm*E，其編碼核巧酸序列如SEQ ID NO. 5所示。
[0013] 本發(fā)明中，所述的放線菌為本領(lǐng)域常規(guī)所述，只要其存在聚麗類(lèi)化合物或聚麗 NWS雜合化合物的合成途徑，且能滿足使所述的重組表達(dá)載體穩(wěn)定地自行復(fù)制，使所述重 組表達(dá)載體攜帶的編碼醜基輔酶A合成酶和醜基載體蛋白的基因能被有效表達(dá)即可。其 中較佳地，所述放線菌為游動(dòng)放線菌（Actinoplanes sp.)或者吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus),更優(yōu)選游動(dòng)放線菌（Actinoplanes sp. )N902-109(陽(yáng)RM BP-3832)菌株或 者吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus)ATCC29253菌株。將前述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化 至上述菌株中，即可得本發(fā)明優(yōu)選的基因工程菌株。
[0014] 本發(fā)明中，所述的培養(yǎng)基為本領(lǐng)域常規(guī)的適合放線菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。所述的天然 油脂為本領(lǐng)域常規(guī)，更佳的是天然植物油脂，優(yōu)選豆油、玉米油和花生油中的任一種或多 種。
[0015] 本發(fā)明中，所述的聚麗類(lèi)化合物為本領(lǐng)域常規(guī)所述，優(yōu)選雷帕霉素。
[0016] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案之二是；一種生產(chǎn)雷帕霉素的基因工程菌，其為將含有表 達(dá)醜基輔酶A合成酶和醜基載體蛋白的重組表達(dá)載體的重組大腸桿菌接合轉(zhuǎn)移放線菌制 得的過(guò)表達(dá)醜基輔酶A合成酶和醜基載體蛋白的重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體。
[0017] 所述的放線菌為本領(lǐng)域常規(guī)所述，只要其存在雷帕霉素的合成途徑，且能滿 足使編碼所述的醜基輔酶A合成酶和醜基載體蛋白的基因被有效表達(dá)即可。其中較 佳地，所述放線菌為游動(dòng)放線菌（Actinoplanes sp.)或者吸水鏈霉菌（Str巧tomyces hygroscopicus),更優(yōu)選游動(dòng)放線菌（Actinoplanes sp. )N902-109(陽(yáng)RM BP-3832)菌株或 者吸水鏈霉菌ATCC29253菌株。
[0018] 在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí) 例。
[0019] 本發(fā)明所用試劑和原料除特別說(shuō)明之外，均市售可得。
[0020] 本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：本發(fā)明的特點(diǎn)在于提供了一種新的提高聚麗類(lèi)化合 物發(fā)酵產(chǎn)量的方法。本發(fā)明的方法在于通過(guò)基因工程技術(shù)在聚麗類(lèi)化合物的產(chǎn)生菌中過(guò)量 表達(dá)醜基輔酶A合成酶和醜基載體蛋白，使之利用廉價(jià)的天然油脂為培養(yǎng)基原料，過(guò)量合 成聚麗類(lèi)化合物的上游合成底物己醜輔酶A和丙醜輔酶A，從而大幅度提高聚麗類(lèi)化合物 的發(fā)酵產(chǎn)量。本發(fā)明的方法尚屬首創(chuàng)，目前為止未見(jiàn)有公開(kāi)文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)。本發(fā)明的操作方 法簡(jiǎn)單易行，且利用廉價(jià)的天然油脂為聚麗類(lèi)化合物的合成提供前體物質(zhì)，成本很低，具有 很好的應(yīng)用前景。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0021] 圖1為本發(fā)明的質(zhì)粒構(gòu)建圖譜。
[0022] 圖2顯示過(guò)表達(dá)化tE和化tF基因?qū)着撩顾禺a(chǎn)量的影響，左邊為野生型的游動(dòng) 放線菌（Actinoplanes sp. )N902-109(陽(yáng)RM BP-3832)菌株，右邊為本發(fā)明過(guò)表達(dá)Dp巧和 化tF基因的基因工程菌。

【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面通過(guò)實(shí)施例的方式進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí) 施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商 品說(shuō)明書(shū)選擇。
[0024] 下述實(shí)施例中使用的菌株和質(zhì)粒信息如下：
[00巧]大腸桿菌D冊(cè)a (購(gòu)自TaKaRa公司），攻瑰抱鏈霉菌（Streptomyces roseosporus) NRRL11379 (購(gòu)自NRRL);大腸桿菌ET12567 (PUZ8002)(購(gòu)自Biovector中國(guó)質(zhì)粒載體菌 株細(xì)胞株基因保藏中也)、質(zhì)粒PSET152 (購(gòu)自Biovector中國(guó)質(zhì)粒載體菌株細(xì)胞株基因保 藏中也)、pIB139 (購(gòu)自Biovector中國(guó)質(zhì)粒載體菌株細(xì)胞株基因保藏中也)，pACK4aBS載體 (購(gòu)自盤(pán)古基因有限公司）。游動(dòng)放線菌（Actinoplanes sp. )N902-109(陽(yáng)RM BP-3832)菌 株，購(gòu)自日本IPOD國(guó)際專(zhuān)利菌種保藏中也（WTE)，其保藏編號(hào)是陽(yáng)RM BP-3832。
[0026] Kod肥0 plus DM聚合酶購(gòu)自Toyobo公司；
[0027] 限制性內(nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa公司或化rmentas公司；
[0028] T4DNA連接酶購(gòu)自TaKaRa公司；
[0029] Axygengel純化試劑盒和DNA膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司；
[0030] Eas^aq DNA聚合酶購(gòu)自全式金生物工程有限公司；
[0031] 其它常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分裝。
[0032] PCR 儀為 Bio-rad PTC200。
[003引 實(shí)施例1攻瑰抱鏈霉菌（Streptomyces roseosporus)基因組的抽提 [0034] 基因組抽提包括下述步驟：
[00巧](1)攻瑰抱鏈霉菌的培養(yǎng)：將攻瑰抱鏈霉菌接種于50ml液體YEME培養(yǎng)基中，所述 YEME培養(yǎng)基包括；0. 3%酵母提取物、0. 5%蛋白腺、0. 3%麥芽糖提取物、1%葡萄糖、10%藏糖 和5mM MgCls，所述的百分比為質(zhì)量體積百分比（W/V)，28°C (300巧m)培養(yǎng)，使菌體生長(zhǎng)至 對(duì)數(shù)中后期。
[0036] (2)攻瑰抱鏈霉菌的收集：取1ml培養(yǎng)物于1. 5ml EP管中，室溫、80(K)巧m離也 5min，棄上清，沉淀重新息浮于1ml TE (P服.0)緩沖液中。
[0037] (3)菌體裂解；加入6y 150mg/ml的溶菌酶，37C作用30分鐘。再加2mol/ LNaC150y l，10%SDS110y l，20mg/ml的蛋白酶K3y 1，50°C作用化或37°C過(guò)夜(此時(shí)菌液應(yīng) 為透明粘稠液體)。
[0038] (4)抽提：菌液均分到兩個(gè)1.5ml EP管，加等體積的酷：氯仿：異戊醇 (25 : 24 : 1)，混勻，室溫放置5?lOmin。12000巧m離也lOmin。抽提兩次。
[00測(cè) （5)沉淀；加0. 6倍體積的異丙醇，混勻，室溫放置lOmin。12000巧m離也lOmin。
[0040] (6)洗涂；沉淀用75%的己醇洗涂。
[0041] (7)抽（瞭)干后，溶于50 y 1 d地2〇中，取25 y 1電泳，結(jié)果顯示所提取的菌體基因 組質(zhì)量良好，適合作PCR模板用。
[0042] 實(shí)施例2重組表達(dá)載體pSET152erm*E-DptEF的構(gòu)建：
[004引 UDptEF基因的克?。?br> [0044] W實(shí)施例1所得的攻瑰抱鏈霉菌基因組為模板，利用引物pi和P2進(jìn)行高保真PCR 擴(kuò)增，得到約246化P的片段，該片段包含完整的化巧和化tF基因，其完整序列如SEQ ID NO. 6所示。其中，引物pi和p2的序列分別如SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 8所示。
[0045] (1)反應(yīng)體系（50y 1)包括；5y IIOXKOD 肥 0 plus 緩沖液，3y 125mM MgC12, 1.5yl2. 5mmol/L dNTP 溶液，2. 5yl DMS0,30pmol Pl，30pmol P2，1U K孤肥 0 plus DM 聚合酶，50ng基因組，加雙蒸水至50 y 1。
[0046] (2)PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5 °C 5min，30 個(gè)循環(huán)（94 °C 30s，56 °C 30s，72 °C 120s)， 72〇C lOmin。
[0047] PCR片段經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，膠回收試劑盒純化回收。
[004引將1 y L pACMaBS載體與3 y L純化片段混合，37C賠育15分鐘，置冰上1?2分 鐘，轉(zhuǎn)化大腸桿菌D冊(cè)a，涂布氨予LB平板。W引物pi和P2進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，能夠擴(kuò)增 出相應(yīng)條帶（246化P)的菌落為陽(yáng)性菌落。挑取陽(yáng)性菌落經(jīng)過(guò)LB液體培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，并經(jīng) 過(guò)限制性內(nèi)切酶（Ndel，甜al)酶切驗(yàn)證并測(cè)序，獲得正確的pACK4aBS-DptEF克隆。
[0049] 2、紅霉素啟動(dòng)子erm*E的克?。?br> [0050] W PIB139質(zhì)粒為模板，利用引物p3和p4進(jìn)行高可信度PCR擴(kuò)增，得到約IWbp 片段，其中，引物p3和p4的序列分別如SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 10所示。
[0051] (1)反應(yīng)體系（50y 1)包括；5y IIOXKOD 肥 0 plus 緩沖液，3y 125mM MgC12, 1.5yl2. 5mmol/L dNTP 溶液，2. 5yl DMS0,30pmol P3,30pmol P4，1U K孤肥 0 plus DM 聚合酶，50ng基因組，加雙蒸水至50 y 1。
[0052] (2)PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5 °C 5min，30 個(gè)循環(huán)（94 °C 30s，56 °C 30s，72 °C 120s)， 72〇C lOmin。
[005引 PCR片段經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，膠回收試劑盒純化回收。
[0054] 將1 y L pACMaBS載體與3 y L純化片段混合，37C賠育15分鐘，置冰上1-2分 鐘，轉(zhuǎn)化大腸桿菌D冊(cè)a,涂布氨予LB平板，W引物P3和p4進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，能夠擴(kuò)增出 相應(yīng)條帶（190bp)的菌落為陽(yáng)性菌落。挑取陽(yáng)性菌落經(jīng)過(guò)LB液體培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，并經(jīng)過(guò) 限制性內(nèi)切酶（BamHI，Ndel)酶切和測(cè)序驗(yàn)證，獲得正確的pACK4aBS-ermE克隆。
[00巧]3、構(gòu)建重組載體 pSET152erm*E-DptEF :
[0056] 將克隆有紅霉素啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒pACK4aBS-erm*E W BamHI，Ndel酶切得到啟 動(dòng)子片段約IWbp，將PSET152質(zhì)粒W BamHI、甜al酶切獲得載體片段約5. 7化，將重組質(zhì) 粒pACK4aBS-DptEF W Ndel、甜al酶切獲得DptEF片段約2. 46化，分別進(jìn)行凝膠純化，H個(gè) 片段W摩爾比5 ;1 ;5的比例在T4DNA連接酶的作用下16C連接過(guò)夜。取連接液5y L轉(zhuǎn)化 D冊(cè)a感受態(tài)細(xì)胞，之后涂布終濃度50 y g/血濃度的安普霉素LB平板，長(zhǎng)出的單克隆通過(guò)液 體LB培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，并利用Ndel，甜al酶切，得到預(yù)期大小的載體條帶和化tEF插入片段 條帶，進(jìn)一步通過(guò)測(cè)序，驗(yàn)證得到正確的pSET152erm*E-DptEF質(zhì)粒。本發(fā)明的載體構(gòu)建過(guò) 程如圖1所7]^。
[0057] 實(shí)施例3.向游動(dòng)放線菌中轉(zhuǎn)化pSET152erm*E-DptEF:
[0058] 制備游動(dòng)放線菌抱子息液；在結(jié)合轉(zhuǎn)移前5天左右，將游動(dòng)放線菌甘油保藏液取 3 y 1涂布I-Isp2固體培養(yǎng)基，所述的I-Isp2固體培養(yǎng)基包括1%麥芽糖提取物、0. 4%酵母 抽提物yeast extract、0. 4%葡萄糖，2%瓊脂粉，所述的百分比為質(zhì)量體積百分比（W/V)，其 抑為7. 0。28°C培養(yǎng)120小時(shí)左右，用無(wú)菌刮棒刮取表面菌體，用15-20ml無(wú)菌水洗并通過(guò) 玻璃珠在旋潤(rùn)振蕩器上震蕩10次，每次10砂鐘后，將息液通過(guò)棉花塞的無(wú)菌注射器針筒， 濾出液經(jīng)過(guò)7000轉(zhuǎn)/分離也后，棄去上清，用適量0. 4-1. 0ml無(wú)菌水重息即可得到抱子息 液。
[0059] 將重組表達(dá)載體pSET152erm*E-DptEF通過(guò)電擊法轉(zhuǎn)化入大腸桿菌ET12567 (PUZ8002)，涂布在含有終濃度50 y g/mL卡那霉素、50 y g/mL安普霉素、25 y g/mL氯 霉素的LB平板上，37C培養(yǎng)過(guò)夜，得到的的陽(yáng)性克隆為重組大腸桿菌，WET12567 (pSET152erm*E-Dpt邸，pUZ8002)表示。
[0060] 接合轉(zhuǎn)移前一天，接種 ET12567 (pSET152erm*E-DptEF，PUZ8002)重組大腸桿菌 單菌落到3mL LB試管中，加入抗生素卡那霉素（50 y g/mL)，安普霉素（50 y g/mL)，氯霉素 (25 yg/mL)培養(yǎng)過(guò)夜，次日W 1%接種量接入含有同濃度的H種抗生素的10血LB H角瓶 中，37C培養(yǎng)至0D0. 4-0. 6。保持無(wú)菌狀態(tài)，450化pm, 4°C離也收集菌體，棄上清，用同體積無(wú) 菌LB洗涂一次，重復(fù)離也和洗涂一次，重息在約200 y L LB中。將大腸桿菌菌液與制備好 的游動(dòng)放線菌抱子息液50 y L充分混合，涂布1-2塊含有終濃度lOmMMgCls的MS平板上，所 述MS平板的組成為；2%甘露醇、2%豆餅粉、2%瓊脂粉，所述的百分比為質(zhì)量體積百分比（W/ V)。
[0061] 28C培養(yǎng)20小時(shí)后，每板均勻平鋪混合了 0. 7ml無(wú)菌水、15y 1蔡巧麗酸（50mg/ ml溶解于0. IN的化OH中）和15y 1安普霉素（50mg/ml)的溶液。28°C繼續(xù)培養(yǎng)5-10天 至單克隆長(zhǎng)出。將單克隆在接合轉(zhuǎn)移平板上劃線分單菌落，使之與混雜的大腸桿菌分離，得 到純化后的重組單克隆菌株。將菌株接種I-Isp2液體培養(yǎng)基，所述的I-Isp2液體培養(yǎng)基 包括1%麥芽糖提取物、0. 4%酵母抽提物yeast extract、0. 4%葡萄糖，其抑為7. 0。28C 培養(yǎng)48-72小時(shí)后，抽提基因組，利用引物pi和p2進(jìn)行PCR驗(yàn)證重組單克隆的正確性，結(jié) 果能夠擴(kuò)增出預(yù)期的2. 46化DptEF條帶，確認(rèn)為整合了重組載體的重組表達(dá)轉(zhuǎn)化子。
[00的]引物序列
[0063]

【權(quán)利要求】
1. 一種提高聚酮類(lèi)化合物發(fā)酵產(chǎn)量的方法，其特征在于，其包括步驟：在添加了天然 油脂的培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)表達(dá)?；o酶A合成酶和?；d體蛋白的基因工程菌，從發(fā)酵產(chǎn)物 中提取聚酮類(lèi)化合物，所述的基因工程菌為將含有表達(dá)?；o酶A合成酶和?；d體蛋白 的重組表達(dá)載體的重組大腸桿菌接合轉(zhuǎn)移放線菌制得的過(guò)表達(dá)酰基輔酶A合成酶和?；?載體蛋白重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其還包括所述的基因工程菌的制備步驟：將 表達(dá)?；o酶A合成酶和?；d體蛋白的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，然后將所得的重組 大腸桿菌接合轉(zhuǎn)移放線菌，所得的過(guò)表達(dá)?；o酶A合成酶和?；d體蛋白的重組表達(dá)轉(zhuǎn) 化體即為所述的基因工程菌。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的重組表達(dá)載體通過(guò)將編碼所述酰基 輔酶A合成酶和?；d體蛋白的基因連接于質(zhì)粒pSET152構(gòu)建而成。
4. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，在所述的重組表達(dá)載體中，啟動(dòng)編碼所述酰 基輔酶A合成酶和?；d體蛋白的基因表達(dá)的啟動(dòng)子為紅霉素抗性基因啟動(dòng)子erm*E，其 序列如SEQIDNO. 5所示。
5. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的放線菌為游動(dòng)放線菌(Actinoplanes sp.)或者吸水鏈霉菌（Streptomyceshygroscopicus)。
6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的?；o酶A合成酶和酰基載體蛋白為 來(lái)源于玫瑰孢鏈霉菌（Streptomycesroseosporus)的?；o酶A合成酶和酰基載體蛋白， 其分別由來(lái)源于玫瑰孢鏈霉菌的DptE和DptF基因編碼。
7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的來(lái)源于玫瑰孢鏈霉菌的酰基輔酶A合 成酶和?；d體蛋白的氨基酸序列分別如SEQIDNO. 1和SEQIDNO. 2所示。
8. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的來(lái)源于玫瑰孢鏈霉菌的DptE和DptF 基因的核苷酸序列分別如SEQIDN03和SEQIDN04所示。
9. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的聚酮類(lèi)化合物為雷帕霉素；所述的天 然油脂為豆油、玉米油和花生油中的任一種或多種。
10. -種生產(chǎn)雷帕霉素的基因工程菌，其為將含有表達(dá)酰基輔酶A合成酶和?；d體 蛋白的重組表達(dá)載體的重組大腸桿菌接合轉(zhuǎn)移放線菌制得的過(guò)表達(dá)?；o酶A合成酶和 ?；d體蛋白的重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK104513840SQ201310461966
【公開(kāi)日】2015年4月15日 申請(qǐng)日期:2013年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月30日
【發(fā)明者】胡海峰, 黃鶴 申請(qǐng)人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院, 中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)研究總院