含BMP-2和ZsGreen1基因的表達(dá)載體及其構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明適用于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種含BMP-2和ZsGreen1基因的表達(dá)載體及其構(gòu)建方法。該構(gòu)建方法包括：通過(guò)PCR方法將BMP-2基因擴(kuò)增，得擴(kuò)增產(chǎn)物；利用XhoI和BamHI酶將擴(kuò)增產(chǎn)物和pIRES2-ZsGreen1載體分別進(jìn)行雙酶切處理，將所得雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行粘性末端連接，其中所述BMP-2基因擴(kuò)增使用的引物對(duì)為SEQIDNO：1和SEQIDNO：2。本發(fā)明還提供由該構(gòu)建方法制備的含BMP-2和ZsGreen1基因的表達(dá)載體。該表達(dá)載體能同時(shí)表達(dá)BMP-2和ZsGreen1，并且兩種蛋白的空間構(gòu)象和功能不會(huì)相互影響。
【專利說(shuō)明】含BMP-2和ZsGreenI基因的表達(dá)載體及其構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及BMP-2表達(dá)載體及其構(gòu)建，尤其涉及一種含BMP-2和ZsGreenl基因的表達(dá)載體及其構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)包括一系列結(jié)構(gòu)和功能相似的多肽，其中BMP-1是骨生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子并屬于金屬肽鏈內(nèi)切酶家族，其余BMP均屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β超家族。ΒΜΡ-2是目前研究最為廣泛、誘導(dǎo)成骨活性最強(qiáng)的BMP之一。ΒΜΡ-2具有誘導(dǎo)未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞向成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞定向分化與增殖的能力，并具有促進(jìn)成骨細(xì)胞分化成熟功能，并參與骨和軟骨的生長(zhǎng)發(fā)育及重建過(guò)程。ΒΜΡ-2蛋白質(zhì)在細(xì)胞和動(dòng)物體內(nèi)的分布和定位，是目前在分子和細(xì)胞水平上研究ΒΜΡ-2促進(jìn)骨折愈合和骨組織修復(fù)的熱點(diǎn)。
[0003]目前，在目標(biāo)蛋白的定位技術(shù)方面的研究已經(jīng)取得很多進(jìn)展，不同的靶向蛋白的定位技術(shù)的原理也各不相同。目前用于ΒΜΡ-2蛋白定位的方法主要有免疫熒光定位、構(gòu)建融合蛋白載體和免疫膠體金標(biāo)記法等。其中免疫熒光定位方法主要利用抗原與抗體相互結(jié)合的原理，該方法主要步驟為:首先將ΒΜΡ-2抗體標(biāo)記上特定的熒光素制成抗體標(biāo)記物，然后利用該抗體標(biāo)記物作為探針，將其與細(xì)胞或者動(dòng)物體內(nèi)的ΒΜΡ-2抗原進(jìn)行結(jié)合，利用熒光顯微鏡觀察，其中熒光素受照射發(fā)出各種熒光，從而可以確定ΒΜΡ-2蛋白的定位和性質(zhì)。而構(gòu)建融合蛋白載體王要步驟為:構(gòu)建能表達(dá)含有綠色滅光蛋白和目的蛋白相互連接的融合蛋白的載體，并使其在動(dòng)物或者細(xì)胞體內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，通過(guò)在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，進(jìn)行靶蛋白的定位。免疫膠體金標(biāo)記法中，當(dāng)用金顆粒標(biāo)記的抗體與抗原反應(yīng)時(shí)，在光鏡下呈現(xiàn)鮮艷的櫻紅色，從而獲得抗原的定位信息。
[0004]在現(xiàn)有技術(shù)中，免疫熒光定位方法對(duì)儀器的要求比較高，并且結(jié)果不能長(zhǎng)期保存。而對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)中的構(gòu)建融合蛋白載體方法，由于兩個(gè)不同的基因相互連接，在翻譯成蛋白的時(shí)候兩個(gè)蛋白之間的空間構(gòu)象極易發(fā)生改變而無(wú)法正確折疊，從而使熒光蛋白或者靶蛋白失去活性而無(wú)法達(dá)到定位或者對(duì)靶蛋白進(jìn)行功能研究的目的。免疫膠體金標(biāo)記法成本高，需要較大直徑的金顆粒(40-50nm)才能獲得較高的靈敏度，同時(shí)耗費(fèi)抗體量較多，檢測(cè)過(guò)程中需要較高濃度的標(biāo)記物，并且當(dāng)金顆粒過(guò)大時(shí)，標(biāo)記物不穩(wěn)定，長(zhǎng)期貯存容易發(fā)生自動(dòng)聚集。因此需要開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)便快速成本低的BMP-2蛋白定位檢測(cè)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明實(shí)施例的目的在于提供一種含形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP-2)和ZsGreenl基因的表達(dá)載體及其構(gòu)建方法，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中BMP-2蛋白定位成本高效果不好的問(wèn)題。
[0006]本發(fā)明實(shí)施例是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種含BMP-2和ZsGreenl基因的表達(dá)載體構(gòu)建方法，包括:
[0007]S01.通過(guò)PCR方法將BMP-2基因擴(kuò)增，得擴(kuò)增產(chǎn)物；[0008]S02.將該擴(kuò)增產(chǎn)物和pIRES2_ZsGreenl載體分別利用XhoI和BamHI酶進(jìn)行雙酶切處理，將所得含BMP-2基因的雙酶切產(chǎn)物和含ZsGreenl基因的雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行粘性末端連接，
[0009]其中所述通過(guò)PCR方法將BMP-2基因擴(kuò)增時(shí)使用的引物對(duì)為:SEQ ID NO:1和SEQID NO:2。
[0010]本發(fā)明實(shí)施例還提供利用本發(fā)明的方法構(gòu)建的含BMP-2和ZsGreenl基因的表達(dá)載體。
[0011]本發(fā)明實(shí)施例還提供本發(fā)明的含BMP-2和ZsGreenl基因的表達(dá)載體用于誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞的應(yīng)用，該應(yīng)用包括將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的步驟。
[0012]本發(fā)明實(shí)施例米用了含有IRES序列的突光報(bào)告載體,構(gòu)建了能夠同時(shí)表達(dá)非融合的BMP-2蛋白和ZsGreenl綠色熒光蛋白的熒光報(bào)告載體，該載體可同時(shí)表達(dá)上述兩種蛋白，并且使得兩種蛋白的空間構(gòu)象和功能不會(huì)相互影響。因此通過(guò)該載體的表達(dá)可利用ZsGreenl綠色熒光蛋白對(duì)BMP-2蛋白表達(dá)和分泌進(jìn)行亞細(xì)胞定位。該表達(dá)載體可以應(yīng)用于動(dòng)物體內(nèi)的研究中，可利用該表達(dá)載體實(shí)時(shí)觀察檢測(cè)BMP-2在動(dòng)物體內(nèi)不同組織表達(dá)分布情況。該表達(dá)載體的構(gòu)建，將更有利于探索BMP-2基因在骨折愈合、骨修復(fù)等方面的機(jī)制研究。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0013]圖1是本發(fā)明實(shí)施例中使用的pIRES2-ZsGreenl載體的序列位點(diǎn)及雙酶切位點(diǎn)示意圖；
[0014]圖2是本發(fā)明實(shí)施例2中將表達(dá)載體pIRES2-ZsGreenl-BMP-2轉(zhuǎn)染至C0S-1細(xì)胞系后的顯微鏡下觀測(cè)圖片；
[0015]圖3是本發(fā)明實(shí)施例2中pIRES2-ZsGreenl-BMP-2轉(zhuǎn)染細(xì)胞后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)的轉(zhuǎn)染效率圖；
[0016]圖4為本發(fā)明實(shí)施例2中pIRES2-ZsGreenl-BMP-2轉(zhuǎn)染細(xì)胞后PCR檢測(cè)結(jié)果電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017]為了使本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0018]本發(fā)明實(shí)施例提供一種含BMP-2和ZsGreenl基因的表達(dá)載體構(gòu)建方法，包括:
[0019]S01.通過(guò)PCR方法將BMP-2基因擴(kuò)增，得擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0020]S02.利用XhoI和BamHI酶將所得擴(kuò)增產(chǎn)物和pIRES2_ZsGreenl載體分別進(jìn)行雙酶切，得到兩種目的雙酶切產(chǎn)物，將含BMP-2目的基因的雙酶切產(chǎn)物和含ZsGreenl基因的表達(dá)載體雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行粘性末端連接，
[0021 ] 其中步驟SOI中對(duì)BMP-2基因擴(kuò)增的PCR方法中使用的弓丨物對(duì)為SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，具體序列為:[0022]上游引物:5’-CCGCTCGAGACCATGGTGGCCGGGACCCGCT-3，, SEQ ID NO:1，
[0023]下游引物:5’-CGCGGATCCCTAGCGACACCCACAACCCTCCA-3，, SEQ ID NO:2，
[0024]其中上游引物中包含了 Xho I酶切位點(diǎn)，在SEQ ID NO:1中用下劃線標(biāo)注；下游引物中包含了 BamH I酶切位點(diǎn)，在SEQ ID NO:2中用下劃線標(biāo)注。
[0025]本發(fā)明實(shí)施例中使用的BMP-2基因?yàn)橥暾鸅MP-2編碼基因，包括N端的信號(hào)肽、中間的前肽和C端的成熟肽序列，以發(fā)揮BMP-2的全部功能。BMP-2在體內(nèi)以前體形式合成，經(jīng)蛋白酶切去除信號(hào)肽和前肽，得到由114個(gè)氨基酸殘基組成的成熟肽。成熟肽通過(guò)7對(duì)二硫鍵將其保守結(jié)構(gòu)正確折疊。
[0026]具體地，本發(fā)明實(shí)施例中BMP-2基因插入位點(diǎn)，即XhoI和BamHI雙酶切位點(diǎn)，位于ZsGreenl基因序列上游并與該ZsGreenl基因序列間隔一定序列，如圖1所不。圖1顯不了載體pIRES2-ZsGreenl的序列位點(diǎn)示意圖,其中Xho I酶切識(shí)別位點(diǎn)自613位開(kāi)始，BamHI酶切識(shí)別位點(diǎn)自660位開(kāi)始。雙酶切處理后，回收較大的載體序列與上述PCR反應(yīng)產(chǎn)物的雙酶切產(chǎn)物連接。將兩種基因序列間隔開(kāi)，使得兩者形成非融合性表達(dá)，各自獨(dú)立表達(dá)并發(fā)揮作用，并且不會(huì)相互影響。
[0027]具體地，上述粘性末端連接過(guò)程中可使用E.coli DNA連接酶或者T4DNA連接酶，優(yōu)選使用T4DNA連接酶。
[0028]具體地，上述BMP-2基因擴(kuò)增的PCR反應(yīng)條件為:
[0029]94-95 0C 預(yù)變性 2-3 分鐘，
[0030]97-98°C變性 10`-12 秒，55_56°C退火 30-40 秒，68_70°C延伸 90-120 秒，擴(kuò)增 25-30個(gè)循環(huán)，
[0031]70_72°C充分延伸 10-12 分鐘。
[0032]具體地,上述PCR反應(yīng)后需進(jìn)行回收純化目的DNA序列的操作。該操作用于獲得純度較高的目的DNA片段，便于后續(xù)操作的順利進(jìn)行。
[0033]具體地，上述粘性末端連接操作中，含BMP-2目的基因的雙酶切產(chǎn)物與含ZsGreenl基因的表達(dá)載體雙酶切產(chǎn)物的DNA含量摩爾比為3-6: I。該用量可獲得較好的連接效果。
[0034]另一方面，本發(fā)明實(shí)施例還提供根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)載體構(gòu)建方法制備的含BMP-2和ZsGreenl基因的表達(dá)載體，該表達(dá)載體可同時(shí)表達(dá)BMP-2基因和ZsGreenl基因，兩者可各自發(fā)揮作用并且不會(huì)相互影響。
[0035]另一方面，本發(fā)明實(shí)施例還提供本發(fā)明制備的含BMP-2和ZsGreenl基因的表達(dá)載體用于誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞的應(yīng)用，該應(yīng)用包括將本發(fā)明實(shí)施例的含BMP-2和ZsGreenl基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的步驟。
[0036]具體地，將本發(fā)明構(gòu)建的雙表達(dá)載體pIRES2-ZsGreenl-BMP-2轉(zhuǎn)染至骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞之后，可通過(guò)BMP-2誘導(dǎo)該骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞。成骨細(xì)胞是骨形成的主要功能細(xì)胞，負(fù)責(zé)骨基質(zhì)的合成、分泌和礦化。因此本發(fā)明構(gòu)建的雙表達(dá)載體pIRES2-ZsGreenl-BMP-2還可用于治療骨損傷、促進(jìn)骨愈合等方面的應(yīng)用。在骨損傷治療領(lǐng)域，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞逐漸成為骨組織工程良好的種子細(xì)胞。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為體外轉(zhuǎn)染基因治療的靶細(xì)胞具有以下優(yōu)點(diǎn):來(lái)源充足、采集簡(jiǎn)便，有絲分裂能力強(qiáng)、易于擴(kuò)大培養(yǎng)，有較強(qiáng)的成骨潛能并對(duì)多種骨生長(zhǎng)因子有良好的反應(yīng)性等，因此本發(fā)明的雙表達(dá)載體具有廣泛的應(yīng)用前景。同時(shí)本發(fā)明的雙表達(dá)載體pIRES2-ZsGreenl-BMP-2也可用于制備治療骨損傷及促進(jìn)骨愈合的藥物。
[0037]另一方面，本發(fā)明構(gòu)建的雙表達(dá)載體pIRES2-ZsGreenl-BMP-2還可用于骨形成蛋白2(BMP-2)基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)骨愈合的研究，即將BMP-2轉(zhuǎn)染至骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后促進(jìn)骨愈合的理論研究上有輔助作用。
[0038]本發(fā)明實(shí)施例中使用的表達(dá)載體中，ZsGreenl是來(lái)源于Anthozoa珊瑚綱的具有明亮熒光的四聚體綠色熒光蛋白質(zhì)，特別適合作為報(bào)告基因，其熒光強(qiáng)度大約是普通的綠色熒光蛋白EGFP的2.5倍。同時(shí)熒光報(bào)告載體含有IRES序列，可以使綠色熒光蛋白ZsGreenl和BMP-2基因共同表達(dá)而不形成融合蛋白，不影響兩種蛋白的生物學(xué)功能，具有靈敏度高、易檢測(cè)、對(duì)細(xì)胞組織不具破壞性；并且在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行表達(dá)不受生物類(lèi)型、細(xì)胞和組織類(lèi)型的限制，也不需任何底物和輔助因子參與，直接觀察；便于早期篩選轉(zhuǎn)基因材料。
[0039]以下通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。
[0040]實(shí)施例lpIRES2-ZsGreenl-BMP_2 表達(dá)載體構(gòu)建
[0041]1.BMP-2目的某閔的擴(kuò)增與鈍化
[0042]引物設(shè)計(jì)與合成:設(shè)計(jì)骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)的擴(kuò)增引物，其中上游引物:5，-CCGCTCGAGACCATGGTGGCCGGGACCCGCT-3，(SEQ ID NO:1)，下劃線部分為 Xho I 酶切位占.[0043]下游引物:5，-CGCGGATCCCTAGCGACACCCACAACCCTCCA-3，(SEQID NO:2)，下劃線部分為BamH I酶切位點(diǎn)。
[0044]該引物對(duì)由上海生工生物工程股份有限公司合成。以本實(shí)驗(yàn)室擁有的插入完整的人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)的pC1-neo-BMp-s質(zhì)粒為模板，采用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增的反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性2分鐘，以98°C變性10秒，56 °C退火30秒，68°C延伸I分鐘30秒，擴(kuò)增25個(gè)循環(huán)，再以72°C充分延伸10分鐘。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為15 μ 1，各成分如下表1所示:
[0045]表1 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系組成
[0046]
【權(quán)利要求】
1.一種含BMP-2和ZsGreenl基因的表達(dá)載體構(gòu)建方法，包括: 501.通過(guò)PCR方法將BMP-2基因擴(kuò)增，得擴(kuò)增產(chǎn)物； 502.將所述擴(kuò)增產(chǎn)物和pIRES2-ZsGreenl載體分別利用XhoI和BamHI酶進(jìn)行雙酶切處理，將所得含BMP-2基因的雙酶切產(chǎn)物和含ZsGreenl基因的雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行粘性末端連接， 其中所述通過(guò)PCR方法將BMP-2基因擴(kuò)增時(shí)使用的引物對(duì)為:SEQ ID NO:1和SEQ IDN0:2。
2.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述BMP-2基因包括信號(hào)肽、前肽和成熟肽序列。
3.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述粘性末端連接使用E.coli DNA連接酶或T4 DNA連接酶進(jìn)行。
4.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述PCR方法的反應(yīng)條件為: 94-95 °C預(yù)變性2-3分鐘， 97-98°C變性 10-12 秒，55-56°C退火 30-40 秒，68_7(TC延伸 90-120 秒，擴(kuò)增 25-30 個(gè)循環(huán)， 70-72°C延伸 10-12 分鐘。
5.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，在所述通過(guò)PCR方法將BMP-2基因擴(kuò)增之后還包括對(duì)目的DNA序列進(jìn)行純化回收的操作。
6.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述粘性末端連接過(guò)程中，所述含BMP-2目的基因的雙酶切產(chǎn)物與含ZsGreenl基因的雙酶切產(chǎn)物的DNA摩爾含量比為3-6:1。
7.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的構(gòu)建方法制備的含BMP-2和ZsGreenl基因的表達(dá)載體。
8.如權(quán)利要求7所述的表達(dá)載體用于誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化的應(yīng)用，所述應(yīng)用包括將所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的步驟。
【文檔編號(hào)】C12N15/66GK103525851SQ201310446813
【公開(kāi)日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年9月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月26日
【發(fā)明者】岳建輝, 趙曉麗, 潘浩波, 胡慶茂 申請(qǐng)人:深圳先進(jìn)技術(shù)研究院