制備特異性沙門氏菌h:6診斷血清的工程菌株及構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種能夠制備特異性沙門氏菌H:6診斷血清的工程菌株及其構(gòu)建方法，它是利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)對傳統(tǒng)的多克隆抗體制備體系進(jìn)行改造，構(gòu)建表面鞭毛抗原合成基因缺失的宿主菌；將不同病原微生物的表面鞭毛抗原合成基因克隆到適合表達(dá)的載體中，并轉(zhuǎn)入抗原基因缺失的宿主菌中，得到一系列具有相同遺傳背景，含有不同病原微生物特異性表面鞭毛抗原基因的工程菌株。利用上述技術(shù)體系能夠構(gòu)建一個包含若干種沙門氏菌的特異抗體庫。該抗體庫可補(bǔ)充現(xiàn)有抗血清種類，同時也可為其他免疫學(xué)技術(shù)的應(yīng)用提供基礎(chǔ)。
【專利說明】制備特異性沙門氏菌H:6診斷血清的工程菌株及構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物制品【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及能夠制備特異性沙門氏菌系列診斷血清的工程菌株，更具體說是一種能夠制備特異性沙門氏菌H: 6診斷血清的工程菌株及構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]沙門氏菌{Salmonella)屬于腸桿菌科(feieroAacieriaceae),是革蘭氏陰性菌。沙門氏菌廣泛分布于自然環(huán)境及動物的腸道中，大多數(shù)能引起家畜、鼠類和禽類等動物的疾病，有些菌株能造成人類的食源性疾病。
[0003]鞭毛是負(fù)責(zé)細(xì)菌運(yùn)動的器官,對細(xì)菌致病性也有重要影響。細(xì)菌的鞭毛蛋白具有強(qiáng)的免疫原性，構(gòu)成了細(xì)菌的鞭毛抗原(H antigen)。鞭毛蛋白與細(xì)菌的致病機(jī)理、生物膜的形成有密切的關(guān)系，也是被內(nèi)在的免疫系統(tǒng)通過Toll-1ike 5受體所識別的一種與致病性相關(guān)的分子。鞭毛抗原(H抗原)是沙門氏菌等革蘭氏陰性菌表面的主要抗原之一，其血清學(xué)水平上的變異在種內(nèi)分型上有重要意義。鞭毛相位變異(選擇性表達(dá)2個不同的鞭毛蛋白基因)是細(xì)菌的一種重要機(jī)制，可以使細(xì)菌適應(yīng)不只一種生存環(huán)境，尤其是可以逃避宿主免疫系統(tǒng)。沙門氏菌有兩種表面抗原:0_抗原和鞭毛蛋白(H-抗原)。沙門氏菌的鞭毛蛋白是由或/7及基因所編碼的，約1.5 kb。沙門氏菌的H抗原分為第一相和第二相。一相由編碼，二相由/7及編碼，這兩個基因通過變位機(jī)制協(xié)同表達(dá)。目前，已經(jīng)確定了沙門氏菌46種O抗原和114種H抗原，在不同的組合下，產(chǎn)生2523種血清型。
[0004]研制沙門氏菌診斷血清一直是生物制品領(lǐng)域的熱門課題。傳統(tǒng)制備診斷血清的方法包括免疫原及免疫血清的制備，吸收與檢定及穩(wěn)定性試驗(yàn)等相關(guān)步驟已經(jīng)非常成熟。但傳統(tǒng)方法耗時長，工作量大。且獲得的是多克隆血清，其特異性不高，常發(fā)生一些交叉反應(yīng)。本發(fā)明致力于改造傳統(tǒng)的多克隆抗體制備體系，利用當(dāng)今生物學(xué)領(lǐng)域最經(jīng)典的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，如基因缺失、克隆構(gòu)建等技術(shù)實(shí)現(xiàn)了快速制備特異性的沙門氏菌診斷血清。利用本發(fā)明的技術(shù)能夠生產(chǎn)用傳統(tǒng)方法很難生產(chǎn)的血清，同時還可以構(gòu)建一個包含若干種沙門氏菌的特異抗原庫。利用該抗原庫能夠建立包含多種沙門氏菌特異抗體的抗體庫，該抗體庫可補(bǔ)充現(xiàn)有抗血清種類。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是構(gòu)建能夠制備特異性沙門氏菌H: 6診斷血清的工程菌株；
本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
一種能夠制備特異性沙門氏菌H: 6診斷血清的工程菌株，其特征在于:它是將含有編碼鞭毛抗原6基因的重組質(zhì)粒pTrC99a-/7及(6)，轉(zhuǎn)入表面鞭毛抗原合成基因缺失的沙門氏菌中得到的能夠有效表達(dá)鞭毛抗原6的工程菌株。
[0006]更具體地說是將基因用質(zhì)粒pKD3上的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因替換，將fljB基因用質(zhì)粒PKD4上的卡那霉素抗性基因替換，通過抗生素初步篩選出缺失菌株，再經(jīng)過PCR鑒定及測序鑒定，得到相應(yīng)的缺失菌株G4831 Δ fliC Δ fljB,然后再將構(gòu)建的重組質(zhì)、粒pTrc99a-/7及(6)轉(zhuǎn)入其中，篩選得到能夠有效表達(dá)鞭毛抗原6的工程菌株。
[0007]本發(fā)明所述的能夠制備特異性沙門氏菌H:6診斷血清的工程菌株，其中所述一相鞭毛抗原合成基因缺失菌株G4831缺失后基因大小為IlOObp (氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因)，其序列為SEQ ID NO =10
[0008]本發(fā)明所述的能夠制備特異性沙門氏菌Η:6診斷血清的工程菌株，其中所述二相鞭毛抗原合成基因缺失菌株G4831 ΛΛ/7及，缺失后基因大小仍為1500bp (卡那霉素抗性基因)，其序列為SEQ ID NO:2。
[0009]本發(fā)明進(jìn)一步公開了能夠制備特異性沙門氏菌H:6診斷血清的工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于按如下的步驟進(jìn)行:
(1)表面鞭毛抗原合成基因缺失菌株(G4831及)的構(gòu)建；
(2)重組質(zhì)粒pTrc99a-/7及(6)的構(gòu)建；
(3)含有重組質(zhì)粒pTrc99a-/7及(6)的克隆菌株的構(gòu)建。[0010]本發(fā)明利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)對傳統(tǒng)的多克隆抗體制備體系進(jìn)行改造，構(gòu)建表面鞭毛抗原合成基因缺失的宿主菌；將不同病原微生物的表面鞭毛抗原合成基因克隆到適合表達(dá)的載體中，并轉(zhuǎn)入抗原基因缺失的宿主菌中，得到一系列具有相同遺傳背景，含有不同病原微生物特異性表面鞭毛抗原基因的工程菌株。用制備的工程菌抗原免疫動物，用具有相同遺傳背景但不含鞭毛抗原的宿主菌吸附除去非目的抗體，能夠?qū)崿F(xiàn)交叉反應(yīng)的有效去除和抗體制備的標(biāo)準(zhǔn)化和工程化。利用本發(fā)明的技術(shù)可以獲得能夠制備特異性H:k，H:r, H:y, H:z, H:ζ6, Η:zlO, Η:zl3, Η:zl5, Η:z28, Η:z29, Η:v, H:w, H:6 等多種沙門氏菌診斷血清的工程菌株。
[0011]本發(fā)明更加詳細(xì)的構(gòu)建方法如下:
1、表面鞭毛抗原合成基因缺失菌株(G4831及)的構(gòu)建
本發(fā)明選用本實(shí)驗(yàn)室編號為G4831 (格羅斯出浦沙門氏菌)為目的菌株，利用噬菌體λ的Red重組系統(tǒng)介導(dǎo)鞭毛基因和/7及的缺失?，F(xiàn)針對基因說明一下主要過程，先合成一對引物，每一條引物的5'端有39 bp與基因同源，3'端與抗氯霉素基因同源(用于篩選)，以抗氯霉素模板質(zhì)粒pKD3 (Genebank AY048742)的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因?yàn)槟０澹ㄟ^PCR擴(kuò)增獲得中間為一個約1033bp的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，其兩端為39bp同源臂的線性打靶DNA片段，通過切膠回收純化得到該片段。將該線性打靶DNA片段電擊轉(zhuǎn)化到提前導(dǎo)入Red重組系統(tǒng)的G4831中誘導(dǎo)Red重組系統(tǒng)適量表達(dá)，λ核酸外切酶結(jié)合到線性打靶DNA片段兩39bp同源臂末端，酶切產(chǎn)生游離3'單鏈DNA區(qū)段，從而使兩同源臂和G4831染色體間以鏈侵入的方式發(fā)生重組。線性打靶DNA片段插入到G4831染色體上基因兩同源臂之間，而G4831染色體上兩同源臂間的基因序列被其置換，從而完成了 fliC基因的缺失，得到的fliC基因缺失菌株。
[0012]本發(fā)明中的Red重組系統(tǒng)由pSim質(zhì)粒完成，需要提前導(dǎo)入到目的菌株中。pSim質(zhì)粒載有適用于很多腸道細(xì)菌的DNA重組系統(tǒng)，是一種溫度敏感性質(zhì)粒，在42°C時表達(dá)，溫度高于32°C時即丟失。
[0013]/7及基因的缺失是在基因缺失菌株基礎(chǔ)上引入另一個抗性篩選片段完成的，和基因的缺失的原理相同。經(jīng)過上述兩次缺失，得到/7Y基因和fljB基因均缺失的菌株。[0014]2、重組質(zhì)粒pTrc99a_/7及(6)的構(gòu)建
本發(fā)明通過比對ncbi上和鞭毛抗原6相關(guān)的fljB基因序列，經(jīng)過比對分析設(shè)計(jì)fljB基因通用擴(kuò)增引物，在兩條引物的5 '端分別加入NcoI和BamH I的酶切位點(diǎn)。
[0015]本發(fā)明選用pTrc99a這一低拷貝質(zhì)粒作為克隆載體，以本實(shí)驗(yàn)室編號為G4819(倫敦沙門氏_基因組為模板，用nJB基因通用擴(kuò)增引物PCR擴(kuò)增fljB基因(鞭毛抗原6基因)，用Nco I和BamH I做雙酶切，與同樣經(jīng)過雙酶切的載體連接，得到含有鞭毛抗原6基因的重組質(zhì)粒。
[0016]3、含有重組質(zhì)粒pTrc99a_/7及(6)的克隆菌株的構(gòu)建
將經(jīng)過酶切和PCR鑒定正確的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入基因和fljB基因均缺失的菌株中，經(jīng)過抗性篩選轉(zhuǎn)化子和菌落PCR鑒定，得到含有能夠表達(dá)鞭毛蛋白6的重組質(zhì)粒的克隆菌株。
[0017]4、驗(yàn)證克隆表達(dá)實(shí)驗(yàn):
利用細(xì)菌動力實(shí)驗(yàn)和血清學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證重組質(zhì)粒的表達(dá)情況。
[0018]細(xì)菌動力實(shí)驗(yàn)具體是利用細(xì)菌鞭毛的游動性原理，長鞭毛的細(xì)菌能在半固體培養(yǎng)基中游動，不長鞭毛的細(xì)菌則無法游動，如果重組質(zhì)粒能夠表達(dá)出鞭毛蛋白，同時該鞭毛蛋白可以組裝到鞭毛缺失菌的表面，使其長出鞭毛，恢復(fù)動力。本發(fā)明將利用克隆菌株在半固體培養(yǎng)基上的游動情況驗(yàn)證重組質(zhì)粒的表達(dá)情況。
[0019]血清學(xué)實(shí)驗(yàn)具體是利用鞭毛抗原與相應(yīng)抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)，有鞭毛的細(xì)菌能和相應(yīng)的抗體發(fā)生凝集反應(yīng)，沒有鞭毛的細(xì)菌則不能，如果重組質(zhì)粒能夠表達(dá)出鞭毛蛋白，該鞭毛蛋白能夠組裝到鞭毛缺失菌的表面，使其長出鞭毛，就可以用血清來檢測鞭毛抗原的存在情況。本發(fā)明將利用克隆菌株與相應(yīng)血清有無凝集反應(yīng)這一情況來驗(yàn)證重組質(zhì)粒的表達(dá)情況。
[0020]本發(fā)明制備的能夠制備特異性沙門氏菌H:6診斷血清的工程菌株與現(xiàn)有技術(shù)相t匕，具有如下優(yōu)點(diǎn)
1、可行性好:本發(fā)明利用實(shí)驗(yàn)室最基本的分子生物學(xué)技術(shù)對傳統(tǒng)的多克隆抗體制備體系進(jìn)行改造，通過做缺失，建克隆等途徑得到能夠有效表達(dá)鞭毛蛋白6的菌株，從而獲得特異性的沙門氏菌H: 6診斷血清，方法實(shí)用，可行；
2、實(shí)用性強(qiáng):通過本發(fā)明制備特異性的沙門氏菌H:6診斷血清。和傳統(tǒng)方法相比減少了大量的吸收去除工作，更省時，且工作量降低，生產(chǎn)的血清特異性高，交叉少，大大降低了生產(chǎn)血清的成本；
3、靈活性好:利用本發(fā)明的技術(shù)能夠生產(chǎn)用傳統(tǒng)方法很難生產(chǎn)的血清，同時還可以構(gòu)建一個包含若干種沙門氏菌的特異抗原庫。利用該抗原庫能夠建立包含多種沙門氏菌特異抗體的抗體庫，該抗體庫可補(bǔ)充現(xiàn)有抗血清種類，同時也可為其他免疫學(xué)技術(shù)的應(yīng)用提供基礎(chǔ)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1是本發(fā)明所使用的嗤囷體XRed重組系統(tǒng)的原理不意圖；
圖2是本發(fā)明基因缺失菌G4831 Δ fliC PCR篩選電泳結(jié)果圖；圖中M:DNA Marker (DL2000) ；U ddH20 control ;2、野生型 strain G4831 ;3_5、G4831 Δ fliCmutants ；
圖3是本發(fā)明fljB基因缺失菌G4831 Δ fliC Δ fljB PCR篩選電泳結(jié)果圖；圖中 M:DNA Marker (DL2000) ;1、ddH20 control ;2、野生型 strain G4831 ;3_5、G4831 Δ fliC Δ flJB mutants ；
圖4是本發(fā)明制備的沙門氏菌缺失菌株G4831 Δ fliC Δ fljB的fliC和fljB的缺失的遺傳穩(wěn)定性鑒定，M:DNA Marker (DL2000) ;1 和 6、ddH20 control ；2 和 7、野生型 strainG4831 ；3-5>three generations of G4831 A fliC mutant ;8_10、three generations ofG4831 Δ fliC Δ flJB mutant ；
圖5是本發(fā)明構(gòu)建的表面鞭毛抗原合成基因缺失菌株G4831 AfliCAflJB的生長曲
線.圖6是本發(fā)明中重組質(zhì)粒pTrc99a-/7及(6)構(gòu)建的流程圖；
圖7是本發(fā)明中構(gòu)建的重組質(zhì)粒pTrc99a-/7及(6)的物理圖譜；
圖8是對重組質(zhì)粒的鑒定，其中:圖8A:是重組質(zhì)粒pTrc99a-/7及(6)的酶切鑒定結(jié)果，圖中 M:DNA Marker (DL2000 Plus) ;1_3、pTrc99a-/7j^(6)/Nco I +BamHi 圖 8B:是重組質(zhì)粒pTrc99a-/7及(6)的PCR鑒定結(jié)果，圖中M:DNA Marker (DL2000) ；UddH2O control ；2-4> PCR product of pTrc99a-/7JB(6)；
圖9為本發(fā)明野生型G4831與G4831 Δ fliC Δ fljB缺失菌動力板對比圖；
圖10為本發(fā)明G4831 Δ fliC Δ flJB缺失菌與所建克隆菌株G4831 Δ fliC Δ flJB(pTrc99a-/7j^(6))動力板對比圖。 【具體實(shí)施方式】
[0022]下面結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人,分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(New York: Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的條件。本發(fā)明所用到的各種試劑均有市售。
[0023]本發(fā)明所用菌株編號和來源見下表:_
實(shí)驗(yàn)室編號原編號中文名稱_來源
G48195010~倫敦沙門氏菌CMCC
G4831丨50752 |格?出浦沙門氏菌 |巧疋
本發(fā)明所用質(zhì)粒來源見下表:
【權(quán)利要求】
1.一種能夠制備特異性沙門氏菌H:6診斷血清的工程菌株，其特征在于:它是將含有編碼鞭毛抗原6基因的重組質(zhì)粒pTrC99a-/7及(6)，轉(zhuǎn)入表面鞭毛抗原合成基因缺失的沙門氏菌G4831 Δ fliC Δ fljB中得到的能夠有效表達(dá)鞭毛抗原6的工程菌株。
2.權(quán)利要求1所述的能夠制備特異性沙門氏菌H:6診斷血清的工程菌株，其特征在于:它是將基因用質(zhì)粒pKD3上的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因替換，將fljB基因用質(zhì)粒pKD4上的卡那霉素抗性基因替換，通過抗生素初步篩選出缺失菌株，再經(jīng)過PCR鑒定及測序鑒定，得到相應(yīng)的缺失菌株G4831 Δ fHC AfljB,然后再將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pTrc99a_/7及(6)轉(zhuǎn)入其中，篩選得到能夠有效表達(dá)鞭毛抗原6的工程菌株。
3.權(quán)利要求2所述的能夠制備特異性沙門氏菌H:6診斷血清的工程菌株，其中所述一相鞭毛抗原合成基因缺失菌株G4831 缺失后基因大小為IlOObp (氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因)，其序列為SEQ ID NO =10
4.權(quán)利要求2所述的能夠制備特異性沙門氏菌H:6診斷血清的工程菌株，其中所述二相鞭毛抗原合成基因缺失菌株G4831 ΛΛ/7及，缺失后基因大小仍為1500bp (卡那霉素抗性基因)，其序列為SEQ ID NO:2。
5.一種能夠制備特異性沙門氏菌H: 6診斷血清的工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于按如下步驟進(jìn)行: (1)表面鞭毛抗原合成基因缺失菌株(G4831及)的構(gòu)建； (2)重組質(zhì)粒pTrc99a-/7及(6)的構(gòu)建； (3)含有重組質(zhì)粒pTrc99a-/7及(6)的克隆菌株的構(gòu)建。
【文檔編號】C12R1/42GK103468626SQ201310446593
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月27日
【發(fā)明者】馮露, 蔣新蕾, 王磊 申請人:南開大學(xué)