一次性鑒別羊肉、雞肉、鴨肉、豬肉的pcr檢測方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】針對市場上用豬肉、鴨肉、雞肉下腳料經(jīng)過加工冒充羊肉的現(xiàn)象，需要一個統(tǒng)一的檢測方法，以鑒別羊肉、鴨肉、豬肉、雞肉，以及混合或加工過的肉制品中的這四種肉的成分。曾經(jīng)提出或使用過的方法，如紅外線光譜檢測、蛋白質(zhì)指紋方法、免疫學(xué)方法、隨機擴增多態(tài)性DNA分析(RAPD)、限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLP)和擴增片段長度多態(tài)性分析(AFLP)等均存在某些缺點，如檢測結(jié)果不穩(wěn)定、難以區(qū)分混合肉樣、難以鑒別熟肉制品等。本發(fā)明利用動物種屬間特異性較強的線粒體DNA序列設(shè)計種屬特異性引物，通過PCR反應(yīng)得到長度各不相同的特異性擴增片段，對擴增產(chǎn)物電泳檢測，能夠一次性、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、簡單快捷的鑒別羊肉、鴨肉、豬肉、雞肉，以及混合或加工過的肉制品中的這四種肉的成分。
【專利說明】-次性鑒別羊肉、雞肉、鴨肉、豬肉的PCR檢測方法及試劑 合 品

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本項發(fā)明技術(shù)將分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于食品檢測領(lǐng)域，利用動物種屬間特異性較 強的線粒體DNA序列設(shè)計種屬特異性引物，通過多重PCR反應(yīng)和核酸電泳技術(shù)檢測綿羊、家 豬、家雞、家鴨的肉樣品。

【背景技術(shù)】
[0002] 線粒體DNA (Mitochondrial DNA)是動物體內(nèi)唯一存在的核外遺傳信息載體，為 雙鏈的閉合環(huán)狀分子，為嚴(yán)格的母系遺傳，在高等動物中結(jié)構(gòu)基本一致，大小為16 kb左右， 有37個基因（細(xì)胞色素C氧化酶的三個亞基CO I、C0 II、C0 III的基因，細(xì)胞色素b的基因， 兩個編碼ATP合成酶亞基ATPase6和ATPase8的基因，NADH脫氫酶的7個亞基的基因 以及2個rRNA基因和22個tRNA基因)，另外還有一段和復(fù)制轉(zhuǎn)錄有關(guān)的控制區(qū)D-loop。
[0003] 線粒體DNA進(jìn)化速度較快，因而具有很強的種屬特異性，并且由于具有分子量小、 結(jié)構(gòu)簡單穩(wěn)定、不與組蛋白結(jié)合、存在廣泛、拷貝數(shù)極多、易于操作和分析的優(yōu)點而受到青 睞。線粒體DNA最早用于動物檢材的種屬鑒定是在法醫(yī)和考古領(lǐng)域，近年來也被試圖用于 動物源食品、飼料檢測，特別當(dāng)檢材是熟制品或成分復(fù)雜的混合物時，蛋白質(zhì)分析技術(shù)和免 疫方法顯得無能為力，線粒體DNA的PCR檢測則顯示出優(yōu)越性，即使經(jīng)過高壓、蒸煮等處理 也會有少量線粒體DNA完整保存下來，經(jīng)PCR反應(yīng)擴增百萬倍后可經(jīng)電泳顯帶，或用更靈敏 的實時熒光PCR檢測出來。
[0004] 目前用于種屬鑒定的分子生物學(xué)方法有：隨機擴增多態(tài)性DNA分析（RAPD)、限 制性片段長度多態(tài)性分析（RFLP)、擴增片段長度多態(tài)性分析（AFLP)、種屬特異PCR技術(shù) 等。
[0005] PCR-RFLP技術(shù)結(jié)果準(zhǔn)確，操作簡單，同時對試驗設(shè)備要求較低，馮強等采用 PCR-RFLP技術(shù)對cytb基因在人及動物間差異進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，在15種常見動 物中，狗線粒體DNA有微弱的非特異性擴增產(chǎn)物；對雞、蛙、鴨、魚、馬線粒體DNA無擴增產(chǎn) 物。根據(jù)擴增產(chǎn)物的有或無，可初步區(qū)分人與狗、雞、蛙、鴨、魚、馬。擴增產(chǎn)物經(jīng)Alu I酶切 后，除鱔魚及人的擴增產(chǎn)物不被酶切外，牛、豬、羊、貓、猴、兔、豚鼠和鼠均有不同變化。 Zehner等采用相同的引物擴增不同動物線粒體DNA后，聯(lián)合應(yīng)用內(nèi)切酶Alu I和Nco I 酶切擴增產(chǎn)物，人類cyt b基因的981bp片段被Alu I酶切，產(chǎn)生978bp和3bp片段， 除雞和火雞外，其他動物cyt b基因酶切片段與人類cyt b基因酶切片段明顯不同。Nco I可以酶切雞和火雞cyt b基因而不酶切人類cyt b基因。
[0006] 種屬特異PCR是根據(jù)擴增的目的基因設(shè)計高特異性引物，包括單一或多種屬特 異性引物，相應(yīng)的擴增產(chǎn)物就有單一和多種種屬目的片段。常規(guī)PCR技術(shù)一次只能擴增 一個目的片段。在肉制品檢測中，混合肉的成分比較復(fù)雜，必須對成分的不同動物源 性同時進(jìn)行檢測。若是用單一 PCR分開檢測這幾個項目，就存在操作繁瑣，耗時費事 和試劑消耗大等缺點。Matsunaga等建立多重PCR技術(shù)，通過7種按適當(dāng)比例混合的 引物，用一次PCR同時對食品中的6種肉--牛肉、豬肉、雞肉、山羊、綿羊和馬肉中 限制性DNA片段進(jìn)行檢測，其中7種引物包括一條用線粒體色素細(xì)胞b基因設(shè)計的 正鏈引物和6條各物種的特異性的DNA引物，反應(yīng)采用35個循環(huán)進(jìn)行PCR擴增，從山 羊、雞、牛、綿羊、豬和馬肉的擴增產(chǎn)物中分離出長度分別為157，227，274，331，398 和439bp的DNA片段，從而根據(jù)DNA片段的長度來鑒別混合肉制品的動物源性。張 娟等克隆出了鴨線粒體DNA COIII基因（Genbank accession:DQ655706)，利用BLAST軟 件、Bioedit軟件分析線粒體DNA序列，根據(jù)鴨線粒體DNA CO III基因的特異性，設(shè)計引物 (5-CTCATCTATCCTGCTAGCCGC-3'）、（5' -TACCAACCCCCGAACTA GGC-3'），利用此引物 PCR 擴增鴨DNA的特異性片段為226bp。王麗媛等根據(jù)線粒體細(xì)胞色素b基因設(shè)計一條共用的 上游引物，根據(jù)種屬差異設(shè)計其下游引物，然后通過多種類引物的合理配比，可以同時對樣 品中的多種動物源成分進(jìn)行鑒定。
[0007] 針對市場上用豬肉、鴨肉、雞肉下腳料經(jīng)過加工冒充羊肉的現(xiàn)象，需要一個統(tǒng)一的 檢測方法，以鑒別羊肉、鴨肉、豬肉、雞肉，以及混合或加工過的肉制品中的這四種肉的成 分。曾經(jīng)提出或使用過的方法，如紅外線光譜檢測、蛋白質(zhì)指紋方法、免疫學(xué)方法、隨機擴增 多態(tài)性DNA分析（RAPD)、限制性片段長度多態(tài)性分析（RFLP)和擴增片段長度多態(tài)性分析 (AFLP)等均存在某些缺點，如檢測結(jié)果不穩(wěn)定、難以區(qū)分混合肉樣、難以鑒別熟肉制品等。 本發(fā)明利用動物種屬間特異性較強的線粒體DNA序列設(shè)計種屬特異性引物，通過PCR反應(yīng) 得到長度各不相同的特異性擴增片段，對擴增產(chǎn)物電泳檢測，能夠一次性、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、簡單 快捷的鑒別羊肉、鴨肉、豬肉、雞肉，以及混合或加工過的肉制品中的這四種肉的成分。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明既提供一種由8種引物（S-l、S-2、P-1、P-2、C-l、C-2、D-l、D-2的濃度為 1、1、1、1、1、1、2、2 μ mo 1 /L )、PCR反應(yīng)液、DNA Marker、4種目的片段組成的試劑盒，也提供一 種用這種試劑盒對待測樣品DNA進(jìn)行擴增并電泳檢測的方法。
[0009] 為了鑒別羊肉、鴨肉、豬肉、雞肉，利用動物種屬間特異性較強的線粒體DNA序列 針對每種動物分別設(shè)計各自的種屬特異性引物，分別以羊、豬、雞、鴨4種動物的全基因組 DNA為模板，通過PCR反應(yīng)得到4種長度各不相同的特異性擴增片段，對擴增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂 糖凝膠電泳檢測，4種長度不同的條帶可以在電泳圖中分辨出來(見圖1)。4種動物對應(yīng)的 4對引物序列為 ： 羊： S-1:5'-GGCTCTCTCCTAGGCATTTGCTT-3' S-2:5' -AGTTGTCTGGGTCTCCGAGTAA-3' 擴增片段大小為 667bp 豬： P-1:5,-ACCCAGCAAGCCCAGAATCAACCG-3， P-2:5'-CGAGATTGTGCGGTTATTAATGAGTCG-3' 擴增片段大小為 196bp 雞： C-1:5'-AATCGCAGGTATTACTATCATCCAC-3' C-2:5'-GGTGAGTATGAGAGTTAAGCCCAG-3' 擴增片段大小為 148bp 鴨： D-l:5'-CTCATCTATCCTGCTAGCCGC-3' D-2:5' -GCCTAGTTCGGGGGTTGGTA-3' 擴增片段大小為 226bp 本發(fā)明所針對的綿羊?qū)儆诓溉榫V-偶蹄目-反芻動物亞目-洞角科-綿羊?qū)?，線粒體 DNA序列來自于Genbank，序列號為AY858379 ;家雞屬于鳥綱-雞形總目一雉科一原雞屬一 家雞種，線粒體DNA序列來自于Genbank，序列號為NC007236 ;家豬屬于哺乳綱-偶蹄目-豬 次目-豬科-豬屬-豬種，線粒體DNA序列來自于Genbank，序列號為AF486871 ;家鴨屬于鳥 綱-雁形目-鴨科-河鴨屬-綠頭鴨，線粒體DNA序列來自于Genbank，序列號為DQ655706。 綿羊的引物為自行設(shè)計，豬、雞、鴨的引物參考自文獻(xiàn)(張娟等，2007，PCR-mtDNA技術(shù)鑒別檢 測肉食品和飼料中鴨源性成分的研究；李林等，2004, PCR方法鑒別肉骨粉中的動物成份種 類)。
[0010] 為了能夠一次性的鑒別羊肉、鴨肉、豬肉、雞肉，以及混合過的肉制品中的這四種 肉的成分，反復(fù)試驗得到4種單PCR反應(yīng)共同的反應(yīng)條件為： 預(yù)變性94°C 5min 循環(huán) 94°C 30s 58 °C 30s 72°C 30s共30個循環(huán) 延伸 72°C lOmin冷卻，電泳檢測 將4種動物的肉樣的DNA與4對引物進(jìn)行4X4交叉試驗，沒有非特異性擴增。將4對 引物中的任何2對混合后進(jìn)行PCR擴增，引物間沒有明顯的競爭或干擾。將4種肉樣的DNA 中的任何2種混合后PCR擴增，模板間沒有明顯的相互干擾。將4種肉樣經(jīng)100°C加熱5min 或120°C高壓加熱20min后，PCR產(chǎn)物有所減少，但電泳條帶仍清晰可見。
[0011] 為達(dá)到四重PCR反應(yīng)的最佳擴增效果，將s-l、S-2、p-l、P-2、c-l、C-2、D-l、D-2 共8種引物的原液(濃度各為10 μ mol/L)按照1:1:1:1:1:1:2:2的比例混合得到混合引 物，即得到的混合引物中 S-l、S-2、P-l、P-2、C-l、C-2、D-l、D-2 的濃度為 1、1、1、1、1、1、2、 2 μ mol/L。PCR反應(yīng)體系為： 總體積20yl，2XPCR反應(yīng)液10μ1 (含Taq DNA聚合酶、4種dNTP等，可以直接由市 售的現(xiàn)有產(chǎn)品充當(dāng))，混合引物2·0μ 1，模板DNA 1·0μ 1，去離子水補至20μ 1。
[0012] 為使電泳檢測更加方便，試劑盒中除了提供混合引物、PCR反應(yīng)液外，還可以包括 DNAMarker，可以直接由市售的現(xiàn)有產(chǎn)品充當(dāng)，也可以用經(jīng)過PCR擴增、電泳分離、膠回收純 化得到的4種純化的目的片段的混合液作為一種Marker。
[0013] 此方法通過實驗證實了正確可靠，是一種可以一次性、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、簡單快捷的鑒 別羊肉、鴨肉、豬肉、雞肉，以及混合或加工過的肉制品中的這四種肉的成分的種屬特異性 的多重PCR方法。
[0014] 本發(fā)明的內(nèi)容結(jié)合以下實施例作更進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅限于實施 例中所涉及的內(nèi)容。
[0015] 本實施例中的試劑盒由8種引物（S-l、S-2、P-1、P-2、C-l、C-2、D-l、D-2的濃度 為1、1、1、1、1、1、2、2以111〇1/1)、？0?反應(yīng)液、0嫩1&^1?^1(購自北京全式金生物技術(shù)有限 公司）、4種純化的目的片段混合成的Marker組成。用量由待測樣品的量決定。待測樣品為 經(jīng)過冷凍的生肉，由羊肉、豬肉、雞肉、鴨肉中的某幾種粉碎混合成。
[0016] 實驗步驟： 1、DNA提?。喊凑粘Ｒ?guī)的DNA提取方法或試劑盒進(jìn)行DNA提取均可。為縮短檢測所耗 時間，采用動物組織全基因組提取試劑盒提取(購自北京全式金生物技術(shù)有限公司）。肉樣 的選取要有代表性，先肉眼大致區(qū)分肌肉組織、脂肪組織以及不同色澤、紋理的肉樣，然后 用干凈的鑷子或剪刀取6份肉樣，每份20mg左右，置于6個2ml離心管中。按照DNA提取 試劑盒說明書進(jìn)行操作。組織消化時間為1-3小時，消化時間越長，DNA提取效果越好，因 此選擇消化3小時。純化的DNA經(jīng)紫外分光光度儀測得0D 26(l/0D28(l均在1. 8-2. 0之間，濃 度為20-50ng/ μ 1，將6管DNA相互充分混合均勻。
[0017] 2、PCR擴增：6管待測DNA每管做2個平行實驗，共12個管進(jìn)行擴增，反應(yīng)體系為： 總體積20 μ 1，2XEs Taq MasterMix (含Taq DNA聚合酶、4種dNTP等，購自北京康為生物 技術(shù)有限公司），混合引物（S-l、S-2、P-l、P-2、C-l、C-2、D-l、D-2 的濃度為 1、1、1、1、1、1、 2、2μπι〇1/υ2.〇μ 1，待測模板DNA Ι.Ομ 1，去離子水補至20μ 1。設(shè)空白對照一管，不加待 測模板DNA，用水補齊體積。
[0018] 反應(yīng)條件為： 預(yù)變性94°C 5min 循環(huán) 94°C 30s 58 °C 30s 72°C 30s共30個循環(huán) 延伸 72°C lOmin冷卻 3、電泳檢測：產(chǎn)物用TBE做緩沖液的2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，取2-5 μ 1上樣。與 DNA Marker I及4種純化的目的片段的混合Marker對比，待測肉樣含有羊肉、雞肉、豬肉， 與事實相符，12個PCR結(jié)果完全一致，說明此方法正確可靠。
[0019] 本方法用4對引物同時進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系和條件一致，4對引物間以及 和4種動物的模板DNA間沒有相互干擾，不影響結(jié)果，4種目的片段大小不同，在電泳圖上可 以清晰分辨開，因此可一次性的鑒別出4種動物的肉樣，節(jié)省了時間、人力和試劑、耗材。
[0020]【專利附圖】

【附圖說明】 附圖1四種肉類(雞肉、豬肉、鴨肉和羊肉）PCR電泳圖。
【權(quán)利要求】
1. 為了鑒別羊肉、鴨肉、豬肉、雞肉，利用動物種屬間特異性較強的線粒體DNA序列，針 對每種動物分別設(shè)計各自的種屬特異性引物，分別以羊、豬、雞、鴨4種動物的全基因組DNA 為模板，通過PCR反應(yīng)得到4種長度各不相同的特異性擴增片段，對擴增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝 膠電泳檢測，4種長度不同的條帶可以在電泳圖中分辨出來。4種動物對應(yīng)的4對引物序列 為： 羊： S-1:5，-GGCTCTCTCCTAGGCATTTGCTT-3， SU' -AGTTGTCTGGGTCTCCGAGTAA-3'擴增片段大小為 667bp 豬： P-1:5，-ACCCAGCAAGCCCAGAATCAACCG-3' Pjj' -CGAGATTGTGCGGTTATTAATGAGTCG-3'擴增片段大小為 196bp 雞： C-1:5; -AATCGCAGGTATTACTATCATCCAC-3; C-2:5< -GGTGAGTATGAGAGTTAAGCCCAG-3'擴增片段大小為 148bp 鴨： D-1:5; -CTCATCTATCCTGCTAGCCGC-3; 0-2:5' -GCCTAGTTCGGGGGTTGGTA-3'擴增片段大小為 226bp。
2. 為了能夠一次性的鑒別羊肉、鴨肉、豬肉、雞肉，以及混合過的肉制品中的這四種肉 的成分，反復(fù)試驗得到4種單PCR反應(yīng)共同的反應(yīng)條件為： 預(yù)變性94°C 5min 循環(huán) 94 °C 30s 58 °C 30s 72°C 30s共30個循環(huán) 延伸72°C lOmin冷卻，電泳檢測。
3. 為達(dá)到四重PCR反應(yīng)的最佳擴增效果，將S-l、S-2、P-1、P-2、C-l、C-2、D-l、D-2共 8種引物的原液(濃度各為10 μ mol/L)按照1:1:1:1:1:1:2:2的比例混合得到混合引物，即 得到的混合引物中 S-l、S-2、P-l、P-2、C-l、C-2、D-l、D-2 的濃度為 l、l、l、l、l、l、2、2ymol/ L。PCR反應(yīng)體系為： 總體積20yl，2XPCR反應(yīng)液10μ1 (含Taq DNA聚合酶、4種dNTP等，可以直接由市 售的現(xiàn)有產(chǎn)品充當(dāng))，混合引物2·0μ 1，模板DNAl.Oy 1，去離子水補至20μ 1。
【文檔編號】C12Q1/68GK104099405SQ201310123666
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2013年4月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月11日
【發(fā)明者】張英杰, 劉月琴, 陳睿賾, 劉彥琴, 郭云霞, 李雪梅, 楊佳棟, 錫建中 申請人:河北農(nóng)業(yè)大學(xué)