專利名稱：一種融合蛋白基因TAT-sVP7及其應(yīng)用的制作方法
—種融合蛋白基因TAT-SVP7及其應(yīng)用本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及到一種融合蛋白基因TAT-SVP7，還涉及到一種融合蛋白基因TAT-SVP7在制備治療或預(yù)防草魚呼腸孤病毒口服藥物中的應(yīng)用。以水稻愈傷組織細(xì)胞作為生物反應(yīng)器，采用融合表達(dá)的技術(shù)策略，將構(gòu)建的組成型植物表達(dá)載體通過轉(zhuǎn)基因的方法，導(dǎo)入水稻愈傷組織細(xì)胞，在水稻愈傷組織細(xì)胞中高效表達(dá)和大量積累融合蛋白。
背景技術(shù)：
草魚(Ctenopharyngon idellus)是我國重要的經(jīng)濟(jì)淡水養(yǎng)殖品種,其年養(yǎng)殖量約已占我國淡水養(yǎng)殖總量的20%。草魚出血病是危害草魚種的主要病害，流行于我國主要淡水養(yǎng)殖區(qū)，可導(dǎo)致草魚種大量死亡，死亡率在70%以上，給養(yǎng)殖戶造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響了我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展(Fang Q, Seng EK, Ding QQ, Zhang LL(2008)Characterization of infections particles of grass carp reovirus by treatmentwith proteases.Arch Viroll53:675_682)。GCRV 是引起草魚出血病的主要病原。GCRV是一種直徑70nm的球狀病毒，有雙層衣殼，無囊膜。研究表明，決定病毒進(jìn)入細(xì)胞的是其外層蛋白質(zhì)衣殼。VP7與VP5形成的異源二聚體是外衣殼主要的結(jié)構(gòu)蛋白，VP6則連接內(nèi)、外蛋白層。VP5的抗體可對(duì)GCRV產(chǎn)生中和作用，但VP7抗體的中和作用是VP5抗體的 3 倍(Shao L, Sun X, Fang Q (2011) Antibodies against outer-capsid proteinsof grass carp reovirus expressed in E.coli are capable of neutralizing viralinfectivity.Virol j8:347)。研究發(fā)現(xiàn)，基于VP7構(gòu)建的核酸疫苗對(duì)草魚GCRV具有較好的免疫保護(hù)(He Y X，Yang Q, Xu HX, Wu H, Wu FY, Lu LQ (2011) Prokaryotic expressionand purification of grass carp reovirus capsid protein VP7and its vaccinepotential.Afr J Microbiol Res5 (13): 1643-1648)。因此，VP7 是開發(fā) GCRV 疫苗最佳靶標(biāo)。免疫預(yù)防是有效防治GCRV導(dǎo)致草魚出血病的方法之一，因此疫苗研制對(duì)于控制該病意義重大。在漁 用疫苗中，口服免疫途徑是一種最為方便和引起魚體應(yīng)激最小的途徑(李新華，沈錦玉，潘曉藝，郝貴杰.魚類口服免疫的研究進(jìn)展，水產(chǎn)科學(xué)，2010，29(1):51-56)。用植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)研制的口服疫苗會(huì)更加符合草食性魚類的特點(diǎn)，也有利于該疫苗的推廣應(yīng)用。合適的黏膜免疫佐劑，可增強(qiáng)黏膜免疫系統(tǒng)產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫應(yīng)答。如穿膜肽Tat (transcriptional activator protein)是一種帶正電荷的短肽，是一些具有細(xì)胞膜穿透能力的小分子多肽，可有效攜帶比其分子質(zhì)量大100倍的外源性疏水大分子進(jìn)入細(xì)胞，且對(duì)宿主細(xì)胞沒有顯著毒副作用(Rosales-Mendoza S, Rubio-1nfanteN, Govea-Alonso DO, Moreno-Fierros L.Current status and perspectives ofplant-based candidate vaccines against the human immunodeficiency virus(HIV).Plant Cell Rep2012, 31:495-511.) TAT 是由 11 個(gè)氨基酸組成，其序列為 YGRKKRRQRRR，該段等電點(diǎn)12.7，為堿性多肽，轉(zhuǎn)導(dǎo)速度快，效率高。TAT可以將與之相連的多肽或全長蛋白質(zhì)在數(shù)分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞，而且在體內(nèi)可以通過血液循環(huán)運(yùn)輸至魚體免疫生發(fā)中心一前腎。因此，利用植物細(xì)胞生產(chǎn)含有TAT與VP7的GCRV 口服疫苗可能會(huì)成為預(yù)防草魚出血病的最佳選擇，也符合水生動(dòng)物的特點(diǎn)，也有利于該疫苗的推廣應(yīng)用，具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種融合蛋白基因TAT-SVP7，其序列為SEQ ID N0.1所示。該基因的密碼子根據(jù)真核生物基因密碼子偏好性進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后TAT-SVP7基因密碼子，更加符合真核生物基因表達(dá)特點(diǎn)，表達(dá)的重組蛋白量高，且更有活性。本發(fā)明還有一個(gè)目的在于提供了一種含有融合蛋白基因TAT-SVP7的大腸桿菌基因工程菌,分類命名:大腸桿菌 BL21(DE3)hsdS gal pET28a_TAT_sVP7，Escherichia coliBL21(DE3)hsdS gal pET28a-TAT_sVP7CCTCC N0:M2013084。該菌已于 2013 年 3 月 14 日送往中國典型培養(yǎng)物保藏中心進(jìn)行保藏，地址:中國武漢武漢大學(xué)。該菌繁殖速度快，擴(kuò)大培養(yǎng)容易，環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)。本發(fā)明還有一個(gè)目的是在于提供了一種含有融合蛋白基因TAT-SVP7的重組農(nóng)桿菌基因工程菌，分類命名:農(nóng)桿菌EHA105Act-TAT-sVP7，Agrobacteriumsp.EHA105Act-TAT-sVP7CCTCC N0:M2013083，該菌已于 2013 年 3 月 14 日送往中國典型培養(yǎng)物保藏中心進(jìn)行保藏，地址:中國武漢武漢大學(xué)。該菌具有將重組融合蛋白基因整入到植物細(xì)胞的核遺傳物質(zhì)中，且整合效率高，對(duì)植物細(xì)胞無損傷。本發(fā)明最后一個(gè)目的是在于提供了一種含有融合蛋白基因TAT-SVP7的重組農(nóng)桿菌基因工程菌在制備治療或預(yù)防草魚呼腸孤病毒口服藥物中的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:1.獲得水稻密碼子優(yōu)化的GCRV外衣殼蛋白sVP7基因；

為了使重組蛋白在水稻愈傷細(xì)胞中獲得較高的表達(dá)，采用了水稻偏愛的遺傳密碼子，從美國生物技術(shù)信息中心(NCBI)基因庫里獲得了成熟的GCRV的VP7基因序列信息(GenBank AF403394)所對(duì)應(yīng)的氨基酸序列，由DNA分析軟件(Gene Runner)將VP7基因的氨基酸序列轉(zhuǎn)換成含有優(yōu)化水稻遺傳密碼子的核苷酸序列，人工合成VP7基因，記為sVP7，其序列為SEQ N0.3所示的核苷酸序列。2.融合基因TAT-SVP7的制備及表達(dá)載體的構(gòu)建:(I)TAT核苷酸片段的生成上游引物I條，下游引物I條，一次聚合合成。TAF:GGATCCATGTACGGCCGCAAGAAACGCCGACAGCGTCGACGCGGTGGAGGTGGATCT ；TAR:ATCATGTGAAGTGGAGATCCACCTCCACCAGATCCACCTCCACCAGATCCACCTCCAC ；先分別配成IOuMol.L_\等量混合后，95°C加熱IOmin后，室溫冷卻Ih后，即得到細(xì)胞穿膜肽TAT及柔性聯(lián)系序列。將其和sVP7片段等量混合作為PCR擴(kuò)增的模板。(2) TAT與sVP7基因柔性對(duì)接上游引物，GGATCCATGTACGGCCGCAAGAAACGCCGACAG;下游引物，GGATCCTTATCATAGCTCATCTTTCTC ;退火溫度 56°C進(jìn)行 PCR, PCR 擴(kuò)增目的基因 TAT_sVP7,其序列為SEQ ID N0.1所示。PCR產(chǎn)物通過DNA凝膠電泳檢測(cè)，回收PCR產(chǎn)物并將其克隆到PGEM-T載體(在PiOmega公司購置)中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TP10，挑取單菌落培養(yǎng)，用堿裂解法小量提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，并進(jìn)行測(cè)序，得到的陽性克隆子即為包含TAT-SVP7基因的大腸桿菌，該質(zhì)粒命名為pGEM-TAT-sVP7。 (3)質(zhì)粒pET-28a (+)(在INVITR0GEN公司購置)，經(jīng)BamHI酶切后，并經(jīng)堿性磷酸酶處理后，再用瓊脂糖膠切膠回收，回收的載體記為:pET-28a-B-C。用BamHI酶切pGEM-TAT-sVP7質(zhì)粒，目的片段TAT_sVP7和開環(huán)的pET-28a-B_C在16°C連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TPlO感受態(tài)細(xì)胞，用堿裂解法小量提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，并進(jìn)行測(cè)序，得到的陽性克隆子即為包含TAT-SVP7基因的大腸桿菌，該質(zhì)粒命名為pET-28a-TAT-sVP7。3.大腸桿菌基因工程菌的制備和融合蛋白TAT-SVP7的表達(dá)(I)將質(zhì)粒pET-28a-TAT_sVP7轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞。PCR鑒定篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，所得陽性克隆即為本發(fā)明涉及的能夠融合表達(dá)TAT-SVP7的重組基因工程菌株 Escherichia coli BL21 (DE3)pET-28a-TAT_sVP7。(2)重組基因工程菌株Escherichia coli BL21 (DE3)pET-28a-TAT_sVP7 的單菌落接種到IOml新鮮液體LB (含終濃度為50 μ g/ml卡那霉素)培養(yǎng)基中。37°C 150rpm搖床培養(yǎng)過夜。無菌條件下，從培養(yǎng)過夜的菌中，取出2ml菌液接種到200ml的新鮮液體LB中，370C 200rpm搖床培養(yǎng)至0D600為0.8時(shí)(約4h)加入終濃度為0.5mM IPTG，37°C誘導(dǎo)4h后，離心6000g，4°C，IOmin收集菌體，用IOmM PBS (pH8.0)重懸超聲波破壁，離心收集上清和沉淀并用SDS-PAGE電泳檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。以優(yōu)化后的條件擴(kuò)大培養(yǎng)，超聲波破壁后，離心12000g，4°C，20min收集沉淀，并用尿素變性液在4°C冰箱中溶解處理過夜，4°C離心12000g，30min收集上清。融合蛋白TAT_sVP7的純化按N1-NTA說明書進(jìn)行，用SDS-PAGE檢測(cè)蛋白純化結(jié)果。得到純化的TAT-SVP7蛋白，其序列為SEQ ID N0.2所示。一種大腸桿菌基因工程菌株，其特征在于，該菌株為重組基因工程菌株，分類命名:大腸桿菌 BL21(DE3)hsdS gal pET28a_TAT_sVP7，Escherichia coli BL21 (DE3)hsdSgal pET28a-TAT-sVP7CCTCC N0:M201`3084。該菌已于2013年3月14日送往中國典型培養(yǎng)物保藏中心進(jìn)行保藏，地址:中國武漢武漢大學(xué)。該菌株有以下特征，最適生長溫度為37°C，菌落邊緣整齊，表面有光澤、濕潤、光滑、呈灰白色。培養(yǎng)基:LB培養(yǎng)基配方:IL溶液中，Tryptone(胰蛋白胨):10g;YeastExtract (酵母提取物):5g;NaCl (氯化鈉):10g,再加入16g Agar (瓊脂)ρΗ7.2，培養(yǎng)溫度在32-39°C均可生產(chǎn)，但最適培養(yǎng)溫度37°C，卡那霉素抗性，好氧性細(xì)菌。4.TAT-SVP7融合基因?qū)朕D(zhuǎn)基因載體，構(gòu)建植物轉(zhuǎn)基因載體并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌；將上述目的片段TAT-SVP7與轉(zhuǎn)基因載體ACT(本實(shí)驗(yàn)室留存)通過BamHI酶切位點(diǎn)相聯(lián)(T4DNA連接酶(NEB公司購買)，16°C，連接12h，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TPlO感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)PCR鑒定正反向。將插入正確的TAT-sVP7_ACT導(dǎo)入農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefa ciensSP.)EHA105o一種重組農(nóng)桿菌基因工程菌株，其特征在于，該菌株為重組基因工程菌株 Agrobacteriu m tumefaciens SP.EHA105ACT-TAT-sVP7,分類命名農(nóng)桿菌EHA105Act-TAT-sVP7,Ag robacterium sp.EHA105Act-TAT-sVP7CCTCC N0:M2013083。該菌已于2013年3月14日送往中國典型培養(yǎng)物保藏中心進(jìn)行保藏，地址:中國武漢武漢大學(xué)。該菌株有以下特征，最適生長溫度為26 °C，菌落邊緣整齊，表面濕潤、光滑、呈白色不透明。培養(yǎng)基=YEB培養(yǎng)基配方:1L溶液中，蛋白胨:5.0g;酵母提取物:1.0g;牛肉膏:
5.0g;蔗糖5.0g;MgSO4.7Η200.5g;再加入16g Agar (瓊脂)。其培養(yǎng)基的最適ρΗ7.2，培養(yǎng)溫度25-31°C,但最適培養(yǎng)溫度28°C,卡那霉素抗性,好氧性菌株。一種含有融合蛋白基因TAT-SVP7的重組農(nóng)桿菌基因工程菌在制備治療或預(yù)防草魚呼腸孤病毒口服藥物中的應(yīng)用，其應(yīng)用過程是:利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，經(jīng)共培養(yǎng)和抗性篩選，獲得大量的轉(zhuǎn)基因水稻愈傷細(xì)胞系，再經(jīng)繼代，⑶S顯色和PCR分子鑒定，獲得了 26個(gè)水稻轉(zhuǎn)基因愈傷細(xì)胞系。從每個(gè)水稻愈傷細(xì)胞系中取出一部分材料，利用蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)——酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒(武漢博士德公司)檢測(cè)技術(shù)，篩選高表達(dá)重組TAT-SVP7的轉(zhuǎn)基因愈傷細(xì)胞系。高表達(dá)重組TAT-SVP7的水稻轉(zhuǎn)基因愈傷細(xì)胞系，經(jīng)NB和N6培養(yǎng)基進(jìn)行交替培養(yǎng)，收獲水稻轉(zhuǎn)基因愈傷細(xì)胞，經(jīng)凍干機(jī)凍干，即為草魚GCRV的口服疫苗，可以直接或拌餌投喂草魚，拌餌量為15%，草魚攝食轉(zhuǎn)基因水稻愈傷組織凍干粉后，產(chǎn)生了有效免疫保護(hù)，保護(hù)率達(dá)到70.18%。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):本發(fā)明利用基因工程的方法，利用水稻愈傷組織細(xì)胞作為載體，借助植物轉(zhuǎn)基因的技術(shù)平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)在水稻愈傷組織細(xì)胞中高效表達(dá)細(xì)胞穿膜肽TAT與GCRV外衣殼VP7的融合蛋白，細(xì)胞穿膜肽具有協(xié)助后面的重組蛋白進(jìn)入細(xì)胞，增強(qiáng)了重組融合蛋白直接進(jìn)入魚體消化道粘膜機(jī)會(huì)，減少了被消化道中消化酶的消化降解作用，并加以直接利用，供草魚直接口服免疫接種，實(shí)現(xiàn)魚用疫苗的生產(chǎn)和免疫接種的有機(jī)統(tǒng)一，不僅簡化了重組蛋白的純化工序，還克服了因表達(dá)體系不同而引起的蛋白糖苷化修飾的不同。本發(fā)明提供的GCRV 口服疫苗，直接口服免疫接種草魚魚種，使魚體在吞食餌料的同時(shí)，也實(shí)現(xiàn)了免疫接種。該口服植物疫苗，不僅使用方便，實(shí)用性強(qiáng)，成本低，擴(kuò)大生產(chǎn)容易，具有廣闊的應(yīng)用前景。

本項(xiàng)目的生產(chǎn)的植物疫苗，疫苗的載體為水稻愈傷，草魚可以直接攝食，即是食物也是疫苗，對(duì)草魚機(jī)體無損傷，無毒副作用，使用方便，可以單獨(dú)投喂，也可拌在飼料中投喂，省時(shí)省力，可解決大水面(如湖泊、水庫、河流)養(yǎng)殖魚類和大批量魚類的免疫接種難題。生產(chǎn)的疫苗可以常溫存放，減少了常規(guī)疫苗需低溫存放和低溫運(yùn)輸?shù)臒┈嵑唾M(fèi)用。本專利生產(chǎn)的植物疫苗，有別于一般的細(xì)菌(原核)為載體的口服疫苗，需人工注射或拌飼料，使用不方便。同時(shí)，該疫苗的生產(chǎn)利用的是真核生物，重組蛋白在表達(dá)過程中，經(jīng)過了糖基化等修飾，因此，重組蛋白的活性比原核生物更強(qiáng)，特性更好。


:圖1為sVP7基因的合成電泳示意圖。圖1中:M，DL2000分子標(biāo)準(zhǔn)；1，pUC18_sVP7質(zhì)粒經(jīng)經(jīng)BamHI酶切.
圖2為一種TAT-SVP7原核誘導(dǎo)表達(dá)及其融合蛋白的純化電泳示意圖。圖2中a:pET28a-TAT-sVP7誘導(dǎo)前后菌體總蛋白情況；1，誘導(dǎo)前的總蛋白；2，誘導(dǎo)后的總蛋白；圖2中b:融合蛋白的純化；1，菌體超聲處理后上清中的總蛋白；2，菌體超聲處理后下部分的蛋白；3，純化后的TAT-SVP7融合蛋白。
圖3為一種TAT-SVP7合成及其轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建電泳示意圖TAT-SVP7導(dǎo)入到植物轉(zhuǎn)基因載體，并生產(chǎn)水稻組成型表達(dá)的載體；圖3中a:TAT-sVP7融合片段的生成。M，DL2000的DNA標(biāo)準(zhǔn)；1，TAT片段；2，合成的sVP7片段；3，TAT-sVP7融合片段;圖3 中 b:TAT-sVP7 轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建；Μ1, λ DNA 的 Hind III的 DNA 標(biāo)準(zhǔn)；M2, DL2000的DNA標(biāo)準(zhǔn)；C，轉(zhuǎn)基因載體的母體經(jīng)BamHI酶切；1，構(gòu)建的含TAT_sVP7的轉(zhuǎn)基因載體經(jīng)BamHI酶切。圖4為一種水稻愈傷 組織細(xì)胞系PCR鑒定和Western blot定性檢測(cè)分析示意圖。圖4中a =GCRV的TAT_sVP7融合基因在不同水稻愈傷組織細(xì)胞系中的PCR鑒定；圖4中b =GCRV的TAT_sVP7融合蛋白在不同水稻愈傷組織細(xì)胞系中的Westernblot檢測(cè)。M, DNA分子標(biāo)準(zhǔn)(DL2000) ; CO,無樣品的PCR對(duì)照；V，轉(zhuǎn)基因植物載體；C1，正常水稻愈傷細(xì)胞；1_7，分別為不同的水稻愈傷組織樣品。TAT-SVP7，TAT-SVP7融合基因融合表達(dá)的蛋白。圖5為一種水稻愈傷組織細(xì)胞系胚性狀態(tài)調(diào)整示意圖。圖5中a:篩選的水稻愈傷組織細(xì)胞系在同一 N6培養(yǎng)基上繼代情況；圖5中b:篩選的水稻愈傷組織細(xì)胞系進(jìn)行N6和NB培養(yǎng)基交替繼代的情況。圖6為一種水稻轉(zhuǎn)基因愈傷組織細(xì)胞系的凍干材料示意圖。圖7為一種GCRV攻毒實(shí)驗(yàn)示意圖。圖7中C:攝食普通非轉(zhuǎn)基因水稻愈傷組織的草魚，經(jīng)攻毒后出現(xiàn)的癥狀；圖7中TAT-SVP7:攝食含有TAT_sVP7的轉(zhuǎn)基因水稻愈傷組織的草魚，經(jīng)攻毒后出現(xiàn)的癥狀。
具體實(shí)施方式
:本實(shí)驗(yàn)中所涉及的分子生物學(xué)方法為常規(guī)方法，為本領(lǐng)域人員所熟悉。本發(fā)明中未詳細(xì)闡述的請(qǐng)參見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾等主編。實(shí)施例1:融合基因TAT-SVP7的制備I)從美國生物技術(shù)信息中心(NCBI)基因庫里獲得了成熟的GCRV的VP7(GenBank:AAM92742.1)所對(duì)應(yīng)的氨基酸序列信息，由DNA分析軟件(Gene Runner)將VP7基因(GenBank AF403394)的氨基酸序列轉(zhuǎn)換成含有優(yōu)化水稻遺傳密碼子的核苷酸序列，人工合成VP7基因，記為sVP7，其序列為SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列，人工合成(南京金斯瑞生物科技公司合成)。經(jīng)密碼子優(yōu)化后的sVP7基因的核苷酸序列改變了 23.5%，遺傳密碼改變了 74.5%。2) TAT核苷酸片段的生成上游引物I條，下游引物I條，一次聚合合成。TAF:GGATCCATGTACGGCCGCAAGAAACGCCGACAGCGTCGACGCGGTGGAGGTGGATCT ；TAR:ATCATGTGAAGTGGAGATCCACCTCCACCAGATCCACCTCCACCAGATCCACCTCCAC先將兩條引物分別配成IOuMol.L—1，等量混合后，95°C加熱IOmin后，室溫冷卻Ih后，生成TAT核苷酸片段，4°C保存?zhèn)溆?。其生成的?xì)胞穿膜肽TAT及柔性聯(lián)系序列為:
GGATCCATGTACGGCCGCAAGAAACGCCGACAGCGTCGACGCGGTGGAGGTGGATCTGGTGGAGGTGGATCTGGTGGAGGTGGATCTCCACTTCACATGATTCCG。3) TAT與sVP7的柔性融合以TAT和人工合成的sVP7為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增得TAT-VP7融合基因。在引物中加ABamH I酶切位點(diǎn)，以利于后續(xù)的重組質(zhì)粒構(gòu)建工作。設(shè)計(jì)的特異引物序列為:上游引物:5，一GG GGA TCC ATG ATGTACGGCCGCAAGAAACGCCGACAG — 3，BamH I下游引物:5’一 GG GGA TCC TTA TCATAGCTCATCTTTCTC — 3’BamH IPCR反應(yīng)的總體積為50 μ I。PCR擴(kuò)增條件為:熱啟動(dòng)(94°C，5min)，繼續(xù)進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每一循環(huán)的程序?yàn)?4°C，30sec ;56°C，30sec ;72°C , 30sec，最后一個(gè)延伸反應(yīng)(72°C，5min)。取擴(kuò)增產(chǎn)物5μ I在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色后，紫外燈下觀察，拍照。擴(kuò)增產(chǎn)物用PCR純化試劑盒純化。實(shí)施例2 =PCR產(chǎn)物的回收、純化及質(zhì)粒pMD18-TAT_sVP7的構(gòu)建將實(shí)施例1中得到的TAT-SVP7，在瓊脂糖凝膠上電泳，在紫外燈下迅速切下欲回收的條帶，用Trans瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化,將單一的目的DNA條帶放入干凈的Eppendorf管中，稱取重量。按其說明書進(jìn)行回收操作。將回收、純化的PCR產(chǎn)物與pMD18-T (在Takara公司購置)連接，連接體系如下:
pMD18_T Vector 1.0 μ I純化的TAT+sVP7 3.0dH201.0混勻后，再加入5.0 μ I的連接溶液I (Solution I)(在Takara公司購置，D6020S)16°C，連接過夜。實(shí)施例3:pMD18-TAT-sVP7工程菌的構(gòu)建I)氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞采用TP10，其步驟和方法，按照分子克隆實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)進(jìn)行。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞:其步驟是:2)在無菌條件下取連接反應(yīng)液10 μ 1，加入到100 μ I大腸桿菌TPlO感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min。42°C水浴中熱激90sec,速移至冰水中2_3min。無菌下,加入600 μ I液體LB培養(yǎng)基，37°C，IOOrpm輕搖，溫浴45min使細(xì)胞復(fù)蘇。取上述菌液150μ 1，用無菌三角玻棒均勻涂布在50 μ g/ml Kan的LB平板上，正向放置l_2h，直至液體被全部吸收，倒置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。由此法可得到E.coli TP10pMD18-TAT-sVP7菌落。實(shí)施例4:融合基因的制備及表達(dá)載體的構(gòu)建挑取單克隆E.coli TP10pMD18-TAT-sVP7于IOml新鮮液體LB培養(yǎng)基中，37°C，150rpm搖床培養(yǎng)過夜，按分子克隆實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)進(jìn)行提取質(zhì)粒。用BamHI分別酶切pMD18-TAT-sVP7和pET_28a,目的片段TAT_sVP7與開環(huán)pET_28a膠回收后16°C連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TPlO感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化方法同上。選取5個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序，鑒定TAT-SVP7插入到pET-28a載體中的方向和序列信息，分析編碼框的完整性。實(shí)施例5:大腸桿菌基因工程菌的制備
將鑒定正確的質(zhì)粒pET-28a-TAT-sVP7(1.0ul)轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞。PCR鑒定篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，所得陽性克隆即為本發(fā)明涉及的能夠融合表達(dá)TAT-SVP7 的重組基因工程菌株，大腸桿菌 BL21(DE3)hsdS gal pET28a-TAT_sVP7CCTCCN0:M2013084o實(shí)施例6:基因工程融合蛋白TAT-SVP7的誘導(dǎo)表達(dá)和純化重組基因工程菌株Escherichiacoli BL21 (DE3)hsdS gal pET-28a-TAT_sVP7 的單菌落接種到IOml新鮮液體LB (含終濃度為50ug/ml卡那霉素)培養(yǎng)基中。37°C 150rpm搖床培養(yǎng)過夜。無菌條件下，從培養(yǎng)過夜的菌中，取出2ml菌液接種到200ml的新鮮液體LB中，37°C 200rpm搖床培養(yǎng)至0D600為0.8時(shí)(約4h)加入終濃度為0.5mM IPTG, 37°C誘導(dǎo)4h后，離心6000g，4°C，IOmin收集菌體，用IOmM PBS (pH8.0)重懸超聲波破壁，離心收集上清和沉淀并用SDS-PAGE電泳檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。以優(yōu)化后的條件擴(kuò)大培養(yǎng)，超聲波破壁后，離心12000g，4°C，20min收集沉淀，并用尿素變性液在4°C冰箱中溶解處理過夜，4°C離心12000g，30min收集上清。融合蛋白TAT_sVP7的純化按N1-NTA說明書進(jìn)行，用SDS-PAGE檢測(cè)蛋白純化結(jié)果。得到純化的TAT-SVP7蛋白，其序列為SEQ ID N0.2所示。實(shí)施例7:融合蛋白TAT-SVP7的抗體制備；純化的TAT-SVP7融合蛋白與弗氏不完全佐劑等量混合，腹腔注射Bal/C小白鼠5只，間隔2周免疫I次，共三次，最后I次免疫后第7天，從小白鼠眼眶取少量的血，37°C溫箱中作用2h后，4°C放置過夜，取上清采用ELISA檢測(cè)效價(jià)。如達(dá)到1:10000，就可大量取血，同上制備血清。TAT-SVP7的鼠源抗血清，4°C保存?zhèn)溆谩?shí)施例8:TAT-sVP7融合基因?qū)朕D(zhuǎn)基因載體，構(gòu)建植物轉(zhuǎn)基因載體；將目的片段TAT-SVP7與轉(zhuǎn)基因載體ACT，通過BamHI酶切位點(diǎn)相聯(lián)，T4DNA連接酶(NEB公司購買)， 16°C，連接12h，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TPlO感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)PCR鑒定正反向。將插入正確的TAT-sVP7_ACT導(dǎo)入農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105。獲得了一種重組農(nóng)桿菌，分類命名農(nóng)桿菌EHA105Act-TAT-sVP7，Agrobacteriumsp.EHA105Act-TAT-sVP7CCTCC N0:M2013083。實(shí)施例9:構(gòu)建植物轉(zhuǎn)基因載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌將鑒定方向正確的TAT-SVP7-ACT通過電激轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105.電擊議的實(shí)驗(yàn)參數(shù)為:2.5KV,電泳沖25 μ F，電阻400歐。實(shí)施例10:農(nóng)桿菌與水稻愈傷組織細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)、篩選和繼代；Α.愈傷組織的誘導(dǎo)1.剝?nèi)シN子的外穎、內(nèi)穎，選擇成熟飽滿的水稻世錦B(SJB)種子，裝入50ml離心管。2.蒸懼水30ml清洗3次,70%乙醇浸泡2min,蒸懼水清洗3次,再用0.15%HgCl2浸泡15_20min,同時(shí)IOOrpm振蕩。3.在無菌臺(tái)打開離心管，倒出HgCl2，用無菌水清洗種子4、5次后，把種子倒在滅菌的濾紙，放置約lh。4.將種子置入N6固體培養(yǎng)基(10粒/25ml/瓶)，種胚朝上或接觸培養(yǎng)基，28°C，暗
培養(yǎng)4周。5.觀察誘導(dǎo)的愈傷，把淡黃色、致密的胚性愈傷與小盾牌分離后，轉(zhuǎn)入新的N6，繼代培養(yǎng)2周。B.前培養(yǎng)選擇致密、相對(duì)干燥的胚性愈傷轉(zhuǎn)移至新的N6培養(yǎng)基上，28°C下暗培養(yǎng)2天。C.農(nóng)桿菌的培養(yǎng)和懸浮1.將適量農(nóng)桿菌涂布接種在含有相應(yīng)抗生素的LB固體培養(yǎng)基上，對(duì)于LBA4404，28°C下暗培養(yǎng)36h即可。2.向50ml離心管加入30mll/2N6AS。然后，取滅菌小勺刮取農(nóng)桿菌，用勺背面將菌體貼在管壁輕輕拍散，使細(xì)菌懸液的0D_達(dá)到0.8 1.0。D.感染和共培養(yǎng)1.感染:把經(jīng)過前培養(yǎng)的愈傷集中至一個(gè)平皿，一次性轉(zhuǎn)入菌液中，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)管子使菌液均勻分布，感染時(shí)間約15 - 25min。2.共培養(yǎng):將菌液倒出，把愈傷在無菌濾紙上放置2h，保證菌液被吸干，接至1/2N6AS 中，20°C，暗培養(yǎng) 1.5_2d。E.農(nóng)桿菌的去除1.將共培養(yǎng)的愈傷裝入50ml離心管，用無菌水清洗3次以上，至液體比較清亮。2.最后一次倒出無菌水，加入含有頭孢霉素(500mg/L)的N6液體培養(yǎng)基，于IOOrpm 下,振蕩 15_20min,重復(fù) 2-3 次。1.將愈傷倒在無菌濾紙上吸干2h以`上。F.愈傷組織的篩選1.將干燥愈傷轉(zhuǎn)入含有頭孢霉素(250mg/L)的N6培養(yǎng)基中，28°C暗培養(yǎng)7_10d。2.將沒有被農(nóng)桿菌污染的愈傷轉(zhuǎn)入含有頭孢霉素(250mg/L)和潮霉素(50mg/L)的N6培養(yǎng)基中(對(duì)于超量表達(dá)載體)或含有頭孢霉素(250mg/L)和G418 (25mg/L)的N6培養(yǎng)基中(對(duì)于轉(zhuǎn)基因沉默載體)，28°C暗培養(yǎng)15 20d。3.將愈傷轉(zhuǎn)入僅含有潮霉素(50mg/L)的N6培養(yǎng)基中(對(duì)于超量表達(dá)載體)或含有G418 (50mg/L)的N6培養(yǎng)基中(對(duì)于轉(zhuǎn)基因沉默載體)，28°C暗培養(yǎng)15 20d。4.再一次將愈傷轉(zhuǎn)入僅含有潮霉素(50mg/L)的N6培養(yǎng)基中(對(duì)于超量表達(dá)載體)或含有G418 (50mg/L)的N6培養(yǎng)基中(對(duì)于轉(zhuǎn)基因沉默載體)，28°C暗培養(yǎng)15 20d。實(shí)施例11:外源融合蛋白的表達(dá)量檢測(cè)和高表達(dá)水稻愈傷組織細(xì)胞系篩選；取每個(gè)水稻愈傷組織細(xì)胞系中的部分組織塊，采用ELISA試劑盒(從武漢博士德生物工程公司購買)進(jìn)行外源融合蛋白量的測(cè)定。轉(zhuǎn)基因的水稻愈傷細(xì)胞系經(jīng)繼代后，取0.1g的水稻愈傷材料，用IOOul的蛋白提取液提取，取20ul的上樣在12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，通過蛋白質(zhì)印跡轉(zhuǎn)膜并進(jìn)行Westernblot，可檢測(cè)到TAT-SVP7帶，后經(jīng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)，其表達(dá)量為1.54%。最終獲得了一種高表達(dá)重組TAT-SVP7的水稻轉(zhuǎn)基因愈傷細(xì)胞系，實(shí)施例12:水稻轉(zhuǎn)基因愈傷組織的擴(kuò)大培養(yǎng)和胚性改良選取高表達(dá)TAT-SVP7融合蛋白的水稻愈傷組織細(xì)胞系進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，為改善其胚性，采用N6和NB培養(yǎng)基交替進(jìn)行繼代。即是將高表達(dá)TAT-SVP7融合蛋白的水稻愈傷組織細(xì)胞系先繼代在N6培養(yǎng)基上，等愈傷生長14d后，再將其在NB上進(jìn)行繼代培養(yǎng)；再等愈傷生長14d后，又用N6培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代，依此類推，這樣可以有效地改善了愈傷組織細(xì)胞的胚性和愈傷組織細(xì)胞狀態(tài)；實(shí)施例13:轉(zhuǎn)基因水稻愈傷的加工將采集的水稻轉(zhuǎn)基因愈傷，放在培養(yǎng)皿中進(jìn)行冷凍干燥。實(shí)施例14:轉(zhuǎn)基因水稻愈傷直接用于草魚種的GCRV免疫防治草魚為草食性魚類，在人工養(yǎng)殖的條件下可吃天然水草，可吃配合飼料，也可吃凍干的植物愈傷材料。凍干的水稻愈傷組織塊，無需純化處理即為草魚種的口服疫苗。實(shí)驗(yàn)中，每箱中隨機(jī)放養(yǎng)15尾，每尾體重50.0±5g的草魚苗。將陽性愈傷組織直接投喂。對(duì)照組的水稻愈傷組織為正常非轉(zhuǎn)基因水稻愈傷組織，實(shí)驗(yàn)組的水稻愈傷組織含有TAT-SVP7蛋白，設(shè)置不同的濃度梯度，其中凍干粉為15%左右，間隔I天投喂，連續(xù)投喂5次，每天的投餌量為魚體重的2%。設(shè)3個(gè)平行組，實(shí)驗(yàn)前Id和實(shí)驗(yàn)開始后第7d、第14d、第28d和第35d進(jìn)行草魚尾靜脈采血，做間接ELISA、Western blot免疫組化檢測(cè)。如若檢測(cè)效果好，則對(duì)連續(xù)口服攝食28d后的實(shí)驗(yàn)草魚種和對(duì)照實(shí)驗(yàn)草魚(一組為空白組和對(duì)照組)，經(jīng)腹腔注射GCRV組織毒進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，分別統(tǒng)計(jì)各組的死亡率和相對(duì)保護(hù)率。結(jié)果顯示，攻毒后，對(duì)照組草魚的死亡率78.75%±2.56 ;而投喂了含有轉(zhuǎn)基因水稻愈傷組織塊的飼料組，草魚的死亡率為23.48± 1.27，后者比前者下降了 55.27%，二者比較達(dá)到顯著水準(zhǔn)(t-test P=0.024), 表明直接喂養(yǎng)轉(zhuǎn)TAT-sVP7融合基因水稻愈傷組織塊的獲得的相對(duì)免疫保護(hù)率為70.18%，因此，含有TAT-SVP7融合蛋白的植物疫苗，具有明顯的抗GCRV的效果O
權(quán)利要求
1.一種分離基因，其特征在于:基因TAT-SVP7，其序列為SEQ ID N0.1所示。
2.一種分離的蛋白，其序列為SEQ ID N0.2所示。
3.一種人工合成的基因，其特征在于:基因sVP7，其序列為SEQ ID N0.3所示。
4.含有權(quán)利要求1所述基因的大腸桿菌基因工程菌，其特征在于:大腸桿菌(.Escherichia co7i) BL21 (DE3) hsdS gal pET28a_TAT_sVP7 CCTCC NO: M2013084。
5.含有權(quán)利要求1所述基因的重組農(nóng)桿菌基因工程菌，其特征在于:農(nóng)桿菌(.Agrobacterium sp.) EHA105 Act-TAT_sVP7 , CCTCC NO: M2013083。
6.權(quán)利要求4或權(quán)利要求3所述的基因工程菌在制備治療或預(yù)防草魚呼腸孤病毒藥物中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要 求2所述的蛋白在制備治療或預(yù)防草魚呼腸孤病毒藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種融合蛋白基因TAT-sVP7及其應(yīng)用，基因庫里獲得了成熟的GCRV的VP7所對(duì)應(yīng)的氨基酸序列信息，將VP7基因的氨基酸序列轉(zhuǎn)換成含有優(yōu)化水稻遺傳密碼子的核苷酸序列，將其與細(xì)胞穿膜肽TAT進(jìn)行柔性連接，導(dǎo)入表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，該菌可高效的表達(dá)TAT-sVP7融合蛋白；將融合蛋白基因TAT-sVP7導(dǎo)入植物轉(zhuǎn)基因載體并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，該菌介導(dǎo)了融合蛋白基因TAT-sVP7整入植物細(xì)胞核DNA，實(shí)現(xiàn)了TAT-sVP7融合蛋白在植物細(xì)胞中的高效表達(dá)，表達(dá)量達(dá)總可溶蛋白的1.54%，；草魚經(jīng)口服吞食含重組融合蛋白的植物材料，產(chǎn)生了有效的免疫應(yīng)答；草魚對(duì)草魚呼腸孤病毒的免疫保護(hù)率達(dá)到70.18%。
文檔編號(hào)C12R1/01GK103184230SQ20131009010
公開日2013年7月3日 申請(qǐng)日期2013年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月20日
發(fā)明者聶品, 張秋勝, 李楠, 羅璋, 高謙 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院水生生物研究所