專利名稱：一種復(fù)合污染河流底泥微生物總dna提取的前處理方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種復(fù)合污染河流底泥微生物總DNA提取的前處理方法。
背景技術(shù)：
:河流沉積物中的微生物可對(duì)污染物進(jìn)行有效地分解和轉(zhuǎn)化，并快速、靈敏地反映河流的污染狀況，在河流生態(tài)修復(fù)和健康狀況監(jiān)測(cè)方面發(fā)揮著重要的作用?，F(xiàn)已知所能培養(yǎng)得到的微生物只占總微生物數(shù)量的不到1%。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)、基因組學(xué)、生物信息學(xué)的快速發(fā)展，研究者們可以利用免培養(yǎng)的手段開展微生物的相關(guān)研究，為了解河流健康狀況和發(fā)展河流污染治理的微生物技術(shù)提供科學(xué)依據(jù)和理論指導(dǎo)。其中，完整的、高質(zhì)量的、有利于后續(xù)分子操作的微生物總DNA的獲取，是開展相關(guān)工作的重要保障。然而，由于污染河流沉積物成分復(fù)雜，其中的污染物成份不僅能抑制提取過程中所使用試劑(SDS、溶菌酶、蛋白酶K)的作用，影響DNA的抽提效果，而且有些與DNA沉降性質(zhì)相似的腐殖酸等污染物可與DNA共同沉淀析出，導(dǎo)致其質(zhì)量的下降，從而影響其后續(xù)分子水平的操作，甚至實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性。如何在DNA提取過程中有效地去除河流沉積物中的污染物，是保證河流沉積物微生物總DNA質(zhì)量的關(guān)鍵。

從環(huán)境樣品中直接分離DNA的過程中，去除樣品中的抑制物的策略大體上有四種:第一、在細(xì)胞裂解前將抑制物與DNA分離。如用PBS、EDTA、Tween-20等洗滌樣品，或加入CaCO3等絮凝劑使抑制物絮凝分離。第二、細(xì)胞裂解過程加入試劑使抑制物和DNA進(jìn)入不同的相，使兩者分離。如含CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)、Triton X_100、PVPP(交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮)、CaCl2等的裂解緩沖液提取DNA。第三、將粗提的DNA通過梯度離心、凝膠電泳、Sephadex G-200柱層析等方法分離抑制物。第四、對(duì)DNA進(jìn)行操作時(shí)，對(duì)樣品進(jìn)行稀釋或者加入BSA(牛血清白蛋白)等試劑降低抑制物的作用。四種策略中，第一種策略是在首步將DNA與抑制物分離，其優(yōu)勢(shì)是顯而易見的，可以在細(xì)胞裂解之前將抑制物污染風(fēng)險(xiǎn)減到最小，提聞DNA的質(zhì)量
發(fā)明內(nèi)容
:本發(fā)明的目的是提供一種快速、簡(jiǎn)易、低成本的復(fù)合污染河流底泥微生物總DNA提取的前處理方法，從而為能夠獲得完整的、高質(zhì)量的、有利于后續(xù)分子操作的微生物總DNA,為污染河流監(jiān)測(cè)和修復(fù)的研究提供技術(shù)保障。本發(fā)明的復(fù)合污染河流底泥微生物總DNA提取的前處理方法，其特征在于，將復(fù)合污染河流底泥樣品置于去腐試劑中，65°C振蕩混勻，然后離心去上清收集沉淀底泥；再加入去腐試劑中，振蕩混勻，離心去上清收集沉淀底泥，如此重復(fù)洗滌，直至上清為無色，即得到前處理后的樣品；所述的去腐試劑為含有0.1M EDTA, pH8.00.1M Tris-HCl, 1.5M NaCl,0.1MNaH2PO4 和 0.1M Na2HPO4，余量為水。
前處理后的樣品再按照常規(guī)的提取總DNA的方法提取微生物總DNA就行。所述的65°C振蕩混勻，其振蕩時(shí)間優(yōu)選為15min。本發(fā)明在復(fù)合污染河流底泥中的微生物細(xì)胞裂解前，用去腐試劑洗滌底泥，去腐試劑能有效去除底泥中的腐殖質(zhì)、腐殖酸、重金屬和有機(jī)物等抑制物，合適的溫度一方面可以增加試劑作用強(qiáng)度與無序自由擴(kuò)散動(dòng)力，另一方面加快某些在較低溫度下不能溶解的腐殖質(zhì)的溶解和去除，從而使利用本發(fā)明的前處理方法處理后的復(fù)合污染河流底泥能夠避免重金屬、腐殖酸和腐殖質(zhì)等雜質(zhì)的影響，利用常規(guī)的DNA提取方法提取前處理后的復(fù)合污染河流底泥中微生物總DNA，能夠獲得完整的、高質(zhì)量的微生物總DNA，可較好地滿足后續(xù)微生物群落結(jié)構(gòu)及其生態(tài)功能研究的相關(guān)要求，有利于后續(xù)分子操作，為污染河流監(jiān)測(cè)和修復(fù)的研究提供技術(shù)保障，為了解河流健康狀況和發(fā)展河流污染治理的微生物技術(shù)提供科學(xué)依據(jù)和理論指導(dǎo)。


:圖1是不同去腐試劑浸泡洗滌底泥情況，其中a為浸泡底泥離心后的情況，b為洗滌3次后底泥離心后的情況；圖2是不同浸泡溫度處理后的底泥的粗DNA的凝膠電泳圖；圖3是不同浸泡溫度處理后的底泥的粗DNA的酶切圖譜；圖4是不同浸泡溫度處理后 的底泥的粗DNA16S rDNA V3區(qū)PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖。
具體實(shí)施方式
:以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對(duì)本發(fā)明的控制。實(shí)施例1:去腐試劑的選擇將來自廣東省佛山市容桂鎮(zhèn)河涌中復(fù)合污染的底泥樣品分成9份，每份0.25g(濕重)，分別加入 3ml 去腐試劑 SO:含 0.1M EDTA，0.1M Tris-HCl (ρΗ8.0), 1.5Μ NaCl,0.1M NaH2PO4 和 0.1M Na2HPO4,余量為水；去腐試劑 SI:0.1M EDTA，0.1M Tris-HCl(pH8.0), 1.5M NaCl,0.1M NaH2PO4 和 0.1M Na2HPO4,1%CTAB，余量為水；去腐試劑 S2:0.1MEDTA，0.1MTris-HCl (ρΗ8.0)，1.5Μ NaCl,0.1M NaH2PO4 和 0.1M Na2HPO4, 0.05%TritonX-100, 1%CTAB，余量為水。每種處理3個(gè)平行。25° C水浴震蕩IOhrs后，12000rpm,25° C，離心5min，去上清，再分別加相應(yīng)去腐試劑3ml洗滌2次至上清為無色，去上清后再加入相應(yīng)去腐試劑2ml重懸，得到前處理后的復(fù)合污染河流底泥樣品；不同去腐試劑浸泡洗滌的前處理后的復(fù)合污染河流底泥樣品情況如圖1所示。前處理后的復(fù)合污染河流底泥樣品按照傳統(tǒng)的微生物總DNA提取步驟進(jìn)行。具體如下:前處理后的復(fù)合污染河流底泥樣品反復(fù)凍融-80° ClOmin, 65° C5min3次后加入25 μ I溶菌酶(100mg/ml )，37° C水浴震蕩30min后加入10μ I蛋白酶K (20mg/ml), 37° C震蕩30min ;然后加入220 μ I預(yù)熱的20%十二燒基橫酸鈉(Sodium Dodecyl Sulfate, SDS), 65° C 水浴 2hrs,每隔 15_30min 輕輕顛倒；12000rpm,25° C，IOmin收集上清液,再加入等體積氯仿:異戍醇(24:1),顛倒混勻后12000rpm，25° C，IOmin再次收集上清液，加入0.6倍體積的異丙醇，沉淀DNAlhrs ;再用12000rpm, 25° C，20min離心收集DNA沉淀。得到的DNA沉淀用70%的乙醇洗2次，于室溫干燥后加入50 μ I去離子水溶解，由此得到各前處理后的復(fù)合污染河流底泥樣品的粗DNA。采用NanoDrop測(cè)定粗DNA產(chǎn)率及質(zhì)量,具體結(jié)果如見表I所示。表1:不同試劑浸泡洗漆底泥后粗DNA質(zhì)量分析表
權(quán)利要求
1.一種復(fù)合污染河流底泥微生物總DNA提取的前處理方法，其特征在于，將復(fù)合污染河流底泥樣品置于去腐試劑中，65°C振蕩混勻，然后離心去上清收集沉淀底泥；再加入去腐試劑中，振蕩混勻，離心去上清收集沉淀底泥，如此重復(fù)洗滌，直至上清為無色，即得到前處理后的樣品； 所述的去腐試劑為含有 0.1M EDTA, ρΗ8.00.1M Tris-HCl，1.5Μ NaCl,0.1M NaH2PO4 和0.1M Na2HPO4，余量為水。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的前處理方法，其特征在于，所述的65°C振蕩混勻，其振蕩時(shí)間為 15min。 ·
全文摘要
本發(fā)明公開了一種復(fù)合污染河流底泥微生物總DNA提取的前處理方法。它是將復(fù)合污染河流底泥樣品置于去腐試劑中，65℃振蕩混勻，然后離心去上清收集沉淀底泥；再加入去腐試劑中，振蕩混勻，離心去上清收集沉淀底泥，如此重復(fù)洗滌，直至上清為無色，即得到前處理后的樣品；所述的去腐試劑為含有0.1M EDTA，pH8.0 0.1M Tris-HCl，1.5M NaCl，0.1M NaH2PO4和0.1M Na2HPO4，余量為水。利用常規(guī)方法提取前處理后的復(fù)合污染河流底泥中微生物總DNA，能夠獲得完整的、高質(zhì)量的微生物總DNA，可較好地滿足后續(xù)微生物群落結(jié)構(gòu)及其生態(tài)功能研究的相關(guān)要求，有利于后續(xù)分子操作，為污染河流監(jiān)測(cè)和修復(fù)的研究提供技術(shù)保障。
文檔編號(hào)C12N15/10GK103215252SQ20131008914
公開日2013年7月24日 申請(qǐng)日期2013年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月19日
發(fā)明者許玫英, 方云, 陳杏娟, 孫國(guó)萍 申請(qǐng)人:廣東省微生物研究所